Упрощенная операция для эндоваскулярной перфоративной мышиной модели субарахноидального кровоизлияния

Краткое содержание

В данной работе мы представляем упрощенную операцию по эндоваскулярной перфорации мышиной модели субарахноидального кровоизлияния в сочетании с неврологической оценкой.

Аннотация

Модель эндоваскулярной перфорации обычно используется в качестве метода моделирования субарахноидального кровоизлияния (САК) в экспериментальных исследованиях. Будучи всеобъемлющей и надежной, она требует сложных методов. Этот протокол упрощает модель в некоторых деталях в сочетании с неврологической оценкой. Мы используем нейлоновый шов для петли и вытягивания общей сонной артерии (ОСА), чтобы временно блокировать кровоток, в отличие от традиционного лигирования, что обеспечивает чистое операционное поле. Использование электрокаутерной ручки для сращивания кровеносных сосудов снижает риск кровотечения. Более того, мы используем нить с черной меткой, чтобы было легко определить глубину прокола.

Беспрепятственное продвижение черного маркера мимо бифуркации сонной артерии, где общая сонная артерия (ОСА) расходится во внутреннюю сонную артерию (ВСА), сопровождающееся минимальным сопротивлением, указывает на то, что филамент успешно прошел к внутричерепному соединению передней мозговой артерии (ВДК) и средней мозговой артерии (МКА). Это явление указывает на положение нити в критической точке цереброваскулярной конвергенции. Затем, немного продвинув филамент вперед для прокола кровеносного сосуда, можно облегчить операцию по эндоваскулярной перфорации у мышей, тем самым облегчая применение модели эндоваскулярной перфорации у генетически модифицированных мышей. Это может иметь решающее значение для молекулярных исследований и фармацевтических исследований и разработок.

Введение

Субарахноидальное кровоизлияние (САК), тяжелый подтип инсульта, связано с высокими показателями заболеваемости и смертности, особенно среди людей в возрасте около 50 лет. Спонтанная САК в основном вызвана разрывом внутричерепной аневризмы, который преимущественно происходит в круге^{Виллиса 1,2}. Клинически пациенты часто жалуются на головные боли при ударе грома, неврологические дисфункции и быстрое снижение сознания³. Несмотря на достижения в нейрореанимации, почти 40% пациентов умирают в течение месяца после кровотечения⁴. После аневризматической САК может возникнуть несколько вторичных осложнений, что приводит к прогрессирующему неврологическому ухудшению. Тем не менее, патофизиология и клинические характеристики САК до сих пор плохо изучены.

Таким образом, для лучшего понимания основных механизмов и совершенствования терапевтических стратегий необходимы комплексные и надежные модели на мелких животных. На сегодняшний день были предложены многочисленные протоколы для создания моделей САК. Например, один из подходов включает в себя введение аутологичной крови в большую цистерну. Другой модифицированный протокол включает в себя две отдельные инъекции, одну в большую цистерну, а другую в цистерну зрительного нерва. Инъекция аутологичной крови получила широкое распространение благодаря своей технической простоте и благоприятному коэффициенту летальности ^5,6. Чтобы достичь возможности использования более компактного и менее дорогого лабораторного животного, Барри и др. описали первую модель САК на крысах в 1979 году, которая включала в себя прокол базилярной артерии вольфрамовыми микроэлектродами после удаления черепа^.

В 1995 году была представлена еще одна модель эндоваскулярной перфорации, модифицированная версия модели ишемии головного мозга Зеа-Лонга, нынешняя форма которой впоследствии оказалась наиболее часто используемой моделью для изучения САК⁸. Предыдущие исследования показали, что мыши и люди обладают сходной внутричерепной сосудистой структурой, называемой Виллисовым кругом, где^{преимущественно находится} внутричерепная аневризма. Этот некраниотомический метод воспроизводит механизмы разрыва аневризмы человека посредством точной бифуркационной перфорации ICA¹⁰. Кроме того, генетически модифицированная мышь часто используется для изучения молекулярных механизмов. Тем не менее, из-за сложной техники у мелких животных, модель эндоваскулярной перфорации преимущественно используется на крысах или кроликах, в то время как ее применение у мышей встречается сравнительно реже. Поэтому большое значение имеет упрощение модели эндоваскулярной перфорации у мышей и снижение ее высокой смертности.

Здесь мы представляем упрощенную модификацию модели эндоваскулярной перфорации мышей, интегрирующую модифицированную версию шкалы неврологической оценки Гарсии¹¹. Наша модификация представляет собой простую, удобную и надежную модель для будущих экспериментальных исследований САК.

Протокол

Мышей-самцов C57BL/6 (в возрасте 6-8 недель), не содержащих специфических патогенов, содержали в помещении для животных с регулируемой температурой и условиями акклиматизации, с 12-часовым циклом свет/темнота. Мышам был предоставлен неограниченный доступ к стандартному рациону грызунов и стерилизованной воде из-под крана. Перед началом экспериментов был разрешен 2-недельный период акклиматизации. Все процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по этике животных больницы Лунхуа и проводились в соответствии с рекомендациями Национального комитета по науке и технике Китая по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка животных

1. Поместите мышь на грелку, предварительно нагретую до 37 °C, и продолжайте поддерживать эту температуру до завершения операции.
2. Обезболить мышь путем ингаляции 2-2,5% изофлурана. Поддерживайте с 1-1,5% изофлураном во время работы со скоростью потока 0,4-0,6 л/мин.
3. Расположите мышь на операционном столе, стабилизируйте ее голову, удерживайте ее в лежачем положении и закрепите ее конечности скотчем.

2. Индукция САК

1. Надрежьте кожу ножницами вдоль середины передней части шеи (рисунок 1А).
2. Рассеките соединительную ткань и обнажите левую общую сонную артерию (ОСА) и ее разветвления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно защищайте блуждающий нерв и прилегающие железы (Рисунок 1B).
3. Наложите на CCA нейлоновый шов 6-0 и оставьте два конца свободными без перевязки (Рисунок 1C).
4. Соедините оба конца шовной нити с лентой и аккуратно потяните шов вниз и вправо под углом 45° к горизонтальной плоскости. Прикрепите ленту к операционному столу, чтобы временно заблокировать CCA (рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда кровоток внутри окклюзированного сосуда становится нитевидным, это указывает на успешную окклюзию.
5. Перевязать наружную сонную артерию (ЭКА) нейлоновым швом (рис. 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Место прижигания должно находиться как можно ближе к верхнему концу, на расстоянии примерно 2 мм от бифуркации сонной артерии.
6. Соедините ЭХА дистальнее места лигирования с помощью электрокаутерной ручки (рис. 1F).
7. Медленно потяните ЭХА вниз, пока не обнажится внутренняя сонная артерия (ВСА). Выровняйте ECA и ICA по прямой линии, обеспечив правильное положение для следующей процедуры (Рисунок 1G).
8. Заточите верхнюю часть нити. Точка отметки на нити накала расположена в 8 мм от верха.
9. Сделайте небольшой разрез ножницами для введения нити в ЭХА. Введите нить с помощью щипцов (рисунок 1H).
10. Осторожно продвигайте нить щипцами до тех пор, пока черная метка полностью не пройдет через разветвление CCA и ICA. Слегка продвинуться вперед на 2 мм, чтобы проколоть кровеносный сосуд (рисунок 1I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ощущается значительное сопротивление, что указывает на то, что достигнута бифуркация передней мозговой артерии (ВДК) и средней мозговой артерии (МКА).
11. Втяните нить сразу после перфорации.
12. Предсоедините ECA с помощью электрокаутерной ручки (Рисунок 1J).
13. Снимите ленту и снимите капроновый шов ОСА для восстановления кровотока. Обратите внимание на очевидную пульсацию CCA (рис. 1K).
14. Закройте разрез на шее рассасывающимися нитями 5-0.

3. Фиктивная группа

1. В фиктивной группе выполняют ту же хирургическую операцию, за исключением того, что нить продвигается частично в ВСА и удаляется без прокола¹².

4. Окончание эксперимента

1. Через 24 часа после операции оцените неврологические показатели в соответствии с модифицированной версией системы оценки, представленной Sugawara et ^al.11 (из оригинальной работы Garcia et ^al.13). Выполняйте следующие шесть тестов вслепую: спонтанная активность, движение всех конечностей, движение передних конечностей, подъем по проволочной стенке клетки, реакция на прикосновения с обеих сторон туловища и реакция на стимуляцию вибриссами. Оцените неврологические функции с помощью таблицы оценки поведения (Таблица 1).
2. Обезболивайте мышь ингаляционным изофлураном. Поместите мышь в лежачее положение и закрепите ее на операционном столе скотчем, зафиксировав ее конечности. Затем с помощью ножниц сделайте разрез по средней линии живота, разрежьте брюшную стенку и обнажите грудную полость. Аккуратно разрежьте грудину, чтобы обнажить сердце.
3. Осторожно введите инфузионную иглу в левый желудочек, следя за тем, чтобы игла была стабильной и не проникала в сердце.
4. Начните перфузию с предварительно охлажденной 1x PBS (4 °C) с соответствующей скоростью потока (примерно 10 мл/мин) до тех пор, пока истекающая жидкость не станет прозрачной и прозрачной, что указывает на полную замену крови.
5. После завершения перфузии извлеките инфузионную иглу и прекратите инфузию жидкости. Приступайте к забору тканей мозга.

5. Послеоперационное лечение

1. При закрытии кожи введите внутримышечную инъекцию лорноксикама, чтобы облегчить боль у мышей.
2. Во время операции нанесите глазную мазь с эритромицином на оба глаза, чтобы уменьшить сухость глаз.
3. После операции, исходя из объема кровопотери во время хирургического процесса, введите 0,2-0,4 мл физиологического раствора мышке внутрибрюшинно для восполнения жидкости.
4. Внутримышечно вводите пенициллин в дозе 40 000 ЕД в сутки в течение 3 дней подряд для предотвращения инфекции.
5. Регулярно проверяйте животных на спонтанное дыхание в течение первых часов после операции и контролируйте два раза в день на предмет заранее определенных гуманных конечных точек. Немедленно усыпьте мышей с_CO2, если у них обнаружены проблемы с дыханием, вызванные операцией, или достигнуты какие-либо конечные точки, включая потерю веса на >20% от исходного уровня, длительную невозможность доступа к пище/воде или тяжелый неврологический дефицит.
   Примечание: Животное не оставляют без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине, и не возвращают в компанию других животных до полного выздоровления.

Результаты

Неврологические баллы
Девять мышей из каждой группы были оценены через 24 ч после операции с использованием модификации системы подсчета баллов, описанной Sugawara et ^al.11 для оценки САК. Максимальный достижимый балл - 18. Из них n = 9 животных в фиктивной группе, все набрали 18 баллов. В группе с САК средний балл составил 11 (p < 0,0001) (Рисунок 2).

Патологические изменения в головном мозге
Сгус...

Обсуждение

В заключение следует отметить, что в данном исследовании представлена упрощенная и надежная мышиная модель субарахноидального кровоизлияния (САК), индуцированного введением эндоваскулярного филамента, предлагающая удобный и эффективный подход. По сравнению с существующей моделью эндоваскулярной перфорации, этот протокол является таким же на этапе перфорации: филамент вводится в наружную сонную артерию (ECA), продвигается через общую сонную артерию (CCA) и затем направляется во внутреннюю...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6 мыши	Шанхай Цзесцзе Лаборатория Животных Ко., ЛТД
Шприц-ручка для электрокаутеризации	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Подходит для использования при поверхностных мелких операциях, коагуляции тканей и прижигании вегетации.
isoflurance	RWD	R650-IE	Изофлуран является ингаляционным общим анестетиком. Он имеет малый коэффициент разделения крови/газа. При использовании для анестезии животных он может вызывать анестезию плавно, быстро и комфортно, с быстрым восстановлением, хорошим расслаблением мышц и отсутствием возбуждающего эффекта на симпатическую нервную систему. Скорость метаболизма изофлурана в печени низкая, поэтому он мало токсичен для печени, и явных побочных эффектов не наблюдается даже при многократном применении. Чтобы избежать негативного воздействия отходящих газов анестетика на окружающую среду и персонал лаборатории, рекомендуется использовать его вместе с системой рекуперации газа.
Филамент MACO	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	В основном используется для мышей весом 20-25 г, кончик шовной нити расплавлен в полусферическую форму, без полилизинового или силиконового покрытия, помечен на расстоянии 9-10 мм от кончика, дезинфицирован и может использоваться напрямую. Данная модель имеет три характеристики упаковки. Рекомендуется провести предварительный эксперимент перед формальным экспериментом, чтобы определить подходящую модель.
микроскоп	Olympus	BX61VS	Полностью моторизованный вертикальный микроскоп, оснащенный оптической системой UIS2, предназначенный для получения изображений с высоким разрешением и высокой точностью. Функции включают в себя моторизованный револьвер, сцену и фокус, а также возможности виртуального слайда для создания больших цифровых изображений образцов с высоким разрешением. Подходит для передовых исследований в области патологии, клеточной биологии, нейробиологии и материаловедения.
нейлоновый шовный материал	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Нерассасывающийся хирургический шовный материал, изготовленный из высокопрочных, биосовместимых материалов.