Методическая статья

Извлечение модуля Юнга нативных легочных базальных мембран мышей с помощью силовых карт, полученных с помощью атомно-силовой микроскопии

DOI:

10.3791/67784

⸱

31 января 2025 г.

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол визуализирует, как препарировать криосрезы мышиной легочной ткани, выполнять эксперименты по силовой карте атомно-силовой микроскопии и анализировать данные для определения модуля Юнга нативной легочной базальной мембраны мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) позволяет характеризировать механические свойства образца с пространственным разрешением в несколько десятков нанометров. Поскольку клетки млекопитающих ощущают механику своего непосредственного микроокружения и реагируют на нее, характеристика биомеханических свойств тканей с высоким пространственным разрешением имеет решающее значение для понимания различных процессов развития, гомеостатических и патологических процессов. Базальная мембрана (БМ), представляющая собой субструктуру внеклеточного матрикса (ВКМ) толщиной примерно 100 - 400 нм, играет важную роль в прогрессировании опухоли и образовании метастазов. Несмотря на то, что определение модуля Юнга такой тонкой субструктуры ВКМ является сложной задачей, биомеханические данные КМ дают принципиально новое понимание того, как КМ влияет на поведение клеток, и, кроме того, предлагают ценный диагностический потенциал. Здесь мы представляем визуализированный протокол оценки механики КМ в мышиной легочной ткани, которая является одним из основных органов, склонных к метастазированию. Описан эффективный рабочий процесс определения модуля Юнга БМ, который находится между слоями эндотелиальных и эпителиальных клеток в легочной ткани. Пошаговая инструкция включает в себя замораживание мышиной легочной ткани, криосекцию и запись карты силы АСМ на срезах тканей. Кроме того, мы обеспечиваем полуавтоматическую процедуру анализа данных с использованием CANTER Processing Toolbox, удобного программного обеспечения для анализа данных АСМ собственной разработки. Этот инструмент позволяет автоматически загружать записанные карты сил, преобразовывать кривые зависимости силы от пьезорастяжения в кривые зависимости силы от вдавливания, вычислять модули Юнга и создавать карты модулей Юнга. Наконец, в ней показано, как определить и изолировать значения модуля Юнга, полученные из легочной БМ, с помощью инструмента пространственной фильтрации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Карты сил АСМ стали широко используемым методом определения наномеханических свойств различных биологических образцов с нанометровым пространственным разрешением и чувствительностью к силе Пиконьютона 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Новаторские исследования по применению измерений АСМ к биологическим образцам в физиологических условиях были проведены. Хансмой и коллегами 13,14,15,16,17,18,19,20. Впоследствии с помощью АСМ были проведены силовые измерения для оценки механических свойств отдельных молекул21, живых клеток и их цитоскелета 9,10,22,23,24,25,26, тканей и тканевых срезов 6,8,11,27,28; 29,30,31, а также биологические гидрогели 3,4,32. В нашем исследовании мы использовали АСМ для изучения механических свойств биологических и химических связей 18,33,34,35,36,37 и для измерения наномеханических характеристик отдельных клеток 38,39,40. Более того, измерения хряща пластинки роста8 показали, что коллагеновая архитектура и модуль Юнга внеклеточного матрикса (ВКМ) напрямую делят хондроциты и, следовательно, направление роста мышиной пластинки роста во время эмбрионального развития. Кроме того, мы исследовали изменения, связанные с дегенерацией хряща и остеоартритом в суставном хряще 2,41,42,43,44,45,46,47.

В последние годы в многочисленных исследованиях ОВМ изучались механические свойства как здоровой, так и патологической легочной ткани 48,49,50,51,52. Тем не менее, эти исследования в первую очередь изучали общую механику тканей, не сосредотачиваясь на конкретных компонентах ткани, таких как БМ. КМ представляет собой тонкий слой (100 нм - 400 нм у человека) специализированной структуры ВКМ, которая выстилает большинство органов и тканей млекопитающих, таких как нейроны, мышцы, ткани адипоцитов и кровеносные сосуды. Мы обнаружили, что механические свойства мышиной легочной КМ играют ключевую роль в формировании метастазов таким образом, что более мягкая КМ коррелирует с более высокой вероятностью выживаемостиу пациентов с раком молочной железы и почки. Кроме того, это исследование показало, что секретируемый белок внеклеточного матрикса нетрин-4 снижает модуль Юнга КМ за счет стехиометрического взаимодействия 1:1 с ламинином γ1, ключевым компонентом, присутствующим почти во всех ламининовых сетях внутри БМ40.

Здесь мы представляем визуализацию разработанного нами протокола для определения модуля Юнга (EBM) тонкого мышиного легочного BM длиной 100 - 200 нм. Модуль Юнга БМ является мерой его жесткости и определяется как отношение напряжения (силы на единицу площади) к результирующей осевой деформации (смещению) при линейной упругой деформации54, в данном случае при небольшом сжатии БМ вдавливающим наконечником АСМ. В эксперименте с АСМ сила и смещение (глубина вдавливания) могут быть получены из прогиба кантилевера АСМ и положения кантилевера, а модуль Юнга (отношение напряжения-деформации) может быть выведен из результирующей кривой зависимости силы от вдавливания с помощью подходящей упругой модели, которая учитывает геометрию вдавливающего наконечника (в данном случае модифицированной модели Герца55). Основные шаги показаны на рисунке 1. Первоначально этот протокол описывает методологию подготовки и встраивания образцов легочной ткани мыши в соединение ОКТ (см. шаг 1), тем самым облегчая последующую процедуру криосекции (шаг 2), которая позволяет определить жесткость БМ с использованием силовых карт АСМ. Представленный здесь метод криосекции, в котором используется односторонняя и двусторонняя лента, позволяет разрезать легочную ткань без необходимости фиксации и без размораживания разреза. Подробная процедура АСМ для сбора подходящих данных для оценки жесткости БМ изложена в третьем разделе протокола. В следующем разделе протокола мы объясним, как можно автоматически анализировать генерируемые объемы силы (шаг 4.1) с помощью программного обеспечения собственной разработки на основе MATLAB, CANTER Processing Toolbox56. На этом этапе модуль Юнга извлекается из каждой записанной кривой сила-отступ путем подгонки модифицированной модели Герца, которая корректируется для геометрии индентора, в данном случае четырехсторонней пирамиды55. Наконец, на шагах 4.2 и 4.3 мы опишем, как применять инструменты пространственной фильтрации и фильтрации R2 из разработанного набора инструментов для извлечения значений модуля Юнга, специфичных для базальной мембраны (БМ), из полного набора значений модуля Юнга, полученных на карте сил, содержащей все тканевые компартменты альвеолярной стенки.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры работы с образцами животных были утверждены Советом по экспериментам на животных Министерства окружающей среды и продовольствия Дании (номер разрешения 2017-15-0201-01265) в соответствии с Законом Дании о защите животных. Чтобы продемонстрировать этот протокол, мы использовали самца мыши C57BL/6 в возрасте 13 недель.

ВНИМАНИЕ: В следующем протоколе несколько этапов требуют работы с образцами тканей. Всегда надевайте подходящие перчатки и лабораторный халат при работе с биологическими образцами.

1. Подготовка образцов

  1. Поместите только что собранное легкое мыши в одноразовую форму для основания размером 15 x 15 x 5 мм. Используя шприц объемом 10 мл с иглой 0,9 мм, осторожно введите в образец соотношение оптимальной температуры резания (ОКТ) среднего и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) с соотношением 1:1 (объем) к объему, одновременно втягивая иглу. Проводите инъекцию при комнатной температуре, надежно удерживая образец маленьким хирургическим пинцетом. Инъекция считается завершенной, когда образец становится набухшим, и наблюдается заметное количество сочащихся.
  2. Заполните форму чистым ОКТ до полного погружения образца. Чтобы обеспечить полное замораживание всего легкого, храните образец при температуре -80 °C не менее 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образец может храниться не менее 2 лет при температуре -80 °C. Исходя из технических условий производителя на ОКТ, срок хранения внедренной ткани составляет более 10 лет. Как правило, рекомендуется заворачивать образцы, которые необходимо хранить более 4 месяцев, в прозрачную пленку, чтобы предотвратить впитывание влаги в образец.

2. Криосекция внедренного образца легкого

  1. Отрегулируйте температуру криотомного камеры до -17 °C, так как это оптимальная температура резки для образцов легочной ткани. Установите температуру режущего каскада на -22 °C, если эта функция доступна. Это служит для того, чтобы на поверхности образца поддерживалась оптимальная температура резки на протяжении всего процесса разделки.
  2. Подготовьте 40 предметных стекол микроскопа с помощью двусторонней клейкой ленты, которая аккуратно помещается в середину предметного стекла, прежде чем накатать на ленту центрифужную пробирку объемом 15 мл, чтобы обеспечить прочное сцепление без пузырьков. Убедитесь, что длина двусторонней клейкой ленты примерно равна ширине блока ОКТ, содержащего образец. Предметные стекла микроскопа с матовым краем позволяют наносить карандашом маркировку, содержащую информацию о образце и номер раздела.
  3. Вставьте подготовленные предметные стекла микроскопа в слайд-бокс. Затем поместите коробку с предметными стеклами в криотомную камеру, чтобы охладить их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охлаждение предметных стекол предотвращает возникновение цикла замораживания-оттаивания при захвате срезов, что может нарушить механические свойства образца.
  4. Подготовьте несколько односторонних клейких лент, размер каждой из которых примерно равен размеру замороженного образца.
  5. Заполните два внутренних кольца держателя образца средой OCT. Поместите образец в среду OCT на держатель образца, убедившись, что он находится как можно ровнее. Затем поместите держатель образца примерно на 10 минут в криотомного камеру до тех пор, пока среда OCT полностью не затвердеет и образец не будет надежно закреплен на держателе.
  6. Установите держатель с изображением образца на режущий столик криотома. Отрегулируйте все основные компоненты криотома, такие как наклон режущей ступени и положение лезвия, в соответствии с инструкцией пользователя устройства, чтобы установить режущую плоскость, которая выровнена параллельно поверхности блока OCT.
  7. Проведите первоначальную обрезку образца, отрегулировав толщину среза до 50 мкм, и приступайте к резке до достижения желаемого места в образце (обычно около 500 мкм внутри образца легкого от его поверхности) для сбора предметных стекол ткани. Отрегулируйте толщину среза криотома до 15 мкм, что соответствует желаемой толщине участков ткани.
    ВНИМАНИЕ: Крайне важно проявлять осторожность при использовании режущего инструмента, такого как криотом. Чтобы обеспечить личную безопасность, придерживайтесь рекомендаций производителя по технике безопасности и держите пальцы подальше от лезвия.
  8. Приложите к образцу кусок односторонней клейкой ленты, сильно надавливая большим пальцем. Предварительно убедитесь, что большой палец охлажден, прижав его к стенке камеры криотома в течение нескольких секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лента должна быть плотно прикреплена к образцу, так как любое отсутствие адгезии может привести к отслоению ленты от ткани во время разреза.
  9. Изготовьте с помощью криотома срез ткани размером 15 мкм. Используйте щетку для направления среза и предотвращения отсоединения клейкой ленты от образца во время процедуры резки. Для гладкой поверхности участка ткани важно, чтобы темп резки оставался медленным и постоянным.
  10. Секция, созданная на предыдущем этапе, теперь лежит на блоке лезвий лентой вверх. Используйте одно из охлажденных стекол микроскопа с двусторонним скотчем из предметной коробки и плотно прижмите его к срезу, чтобы захватить его. Затем поместите предметное стекло микроскопа, на котором теперь находится секция, обратно в коробку для предметного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе со предметным стеклом микроскопа и срезом всегда держите их в криотомного камере, чтобы предотвратить оттаивание среза во время процедуры резки.
  11. Повторяйте предыдущие три шага до тех пор, пока не будет собрано необходимое количество разделов, т.е. 40.
  12. Когда закончите, накройте ящик крышкой и переложите его на сухом льду в морозильную камеру при температуре -20 °C. Наконец, очистите криотома, продезинфицировав все используемые предметы и включив ультрафиолетовое излучение в криотомного камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен. Храните образцы при температуре -20 °C до тех пор, пока не будут выполнены измерения АСМ. Рекомендуемый срок хранения срезов и среды ОКТ не должен превышать 6 недель. По истечении этого периода времени срезы и среда OCT могут демонстрировать изменения, напоминающие ожог при замораживании, в результате их значительной площади поверхности и склонности к поглощению влаги.

3. Силовые карты АСМ отдела легких

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола JPK NanoWizard 4XP (AFM) и моторизованный столик от Bruker в сочетании с DMi8 (инвертированным оптическим микроскопом) от Leica были использованы для записи кривых сила-смещение участков легких.

  1. Настройка АСМ
    1. Включите все необходимые устройства настройки АСМ (например, компьютер, контроллер АСМ, виброизоляционный стол, оптический микроскоп и т.д.).
    2. Запустите управляющее программное обеспечение АСМ. В обзоре выбора эксперимента выберите режим расширенной визуализации QI . Кроме того, укажите место, где должны храниться данные эксперимента и файлы калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если у вас нет расширения QI Advanced Imaging , используйте режим наложения сил контактного режима в качестве альтернативного варианта.
    3. Выберите консоль с подходящей пружинной постоянной для конкретного типа исследуемого образца. Для образцов мягких тканей легких рекомендуется использовать кантилевер MLCT F фирмы Bruker с пирамидальным наконечником и номинальной пружинной постоянной 0,6 Н/м. Если чип содержит несколько консолей (например, MLCT), удалите все более длинные кантилеверы из чипа с помощью пинцета под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что только консоль, используемая для измерения, соприкасается с образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие консоли, соприкасающиеся с образцом, кроме той, которая используется для измерения, могут привести к нежелательному перемещению образца во время эксперимента или даже к отсоединению образца от лежащей под ним ленты.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте контакта с консолью, используемой для измерения пинцетом, на текущем или последующем этапе.
    4. Выполните установку чипа на консольный держатель. Вставьте держатель в головку АСМ. Расположите головку АСМ на предметном столике, который расположен на инвертированном оптическом микроскопе. Выровняйте траекторию оптического рычага в соответствии с инструкциями в руководстве пользователя. Правильное выравнивание траектории оптического рычага достигается, когда лазерный луч первоначально размещается на переднем конце измерительной консоли, а затем отраженный лазерный луч попадает в центр сегментированного фотодиода.
  2. Калибровка кантилевера методом теплового шума57
    ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка консоли включает в себя определение его чувствительности инвертированного оптического рычага (InvOLS) и постоянной пружины. Индивидуальная калибровка каждого используемого кантилевера необходима, потому что номинальная постоянная пружины, обычно предусмотренная для консолей, обычно является лишь грубым приближением. В экспериментах, в которых механические свойства образца определяются по записанным силовым кривым, таким как описанная в данном протоколе, важно непосредственно определять InvOLS контактным методом на жесткой подложке. Альтернативные методы определения InvOLS, такие как получение его из геометрии кантилевера, могут обеспечить только грубое приближение и не подходят для описанного здесь типа приложения. В качестве альтернативы, если используются консоли в тех случаях, когда поставщик обеспечивает точную постоянную пружины, InvOLS может быть определен с помощью процедуры, описанной Шиллером и др.58.
    1. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик АСМ. Предметное стекло микроскопа служит жесткой подложкой для контактного определения InvOLS.
    2. После установки головки АСМ на предметный столик опустите головку с помощью шаговых двигателей до тех пор, пока оставшийся зазор между держателем кантилевера и предметным стеклом микроскопа не составит всего примерно 1 - 2 мм. Нанесите PBS на боковую сторону держателя кантилевера, позволяя ему стекать вниз и образовывать жидкий мениск в зазоре между держателем и предметным стеклом микроскопа с помощью шприца объемом 1 мл с длинной иглой (0,9 мм x 70 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что та же жидкость, такая как буфер или среда, которая используется для измерения силы объема образца, также используется для процесса калибровки.
    3. Чтобы выполнить калибровку на основе контактов в программном обеспечении, перейдите на страницу «Получение данных » и выберите параметр «Расширенный вид ». Доступ к диспетчеру калибровки осуществляется с помощью кнопки меню бургера, расположенной в правом верхнем углу. В этом интерфейсе выберите Contact-based в качестве метода и выберите консоль MLCT F в раскрывающемся меню в качестве имени консоли. Кроме того, установите Установочное значение на 1 В, а Количество сканирований на 10 в соответствующих полях ввода.
    4. На странице "Сбор данных " на левой панели управления введите заданное значение 1 В для процедуры автоматического захода на посадку. Нажмите кнопку « Синяя стрелка вниз », расположенную в верхнем левом углу пользовательского интерфейса, чтобы начать автоматический заход на посадку. Когда заход на посадку завершен и кантилевер соприкоснется со предметным стеклом микроскопа, нажмите кнопку «Калибровать » в окне «Диспетчер калибровки ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: InvOLS и постоянная консольной пружины затем определяются автоматически путем записи 10 кривых силы, а также спектральной плотности тепловой мощности (PSD), которая используется для определения постоянной пружины с помощью метода теплового шума57. После завершения процедуры автоматической калибровки визуально убедитесь, что подогнанная кривая правильно описывает нормальную моду (первый пик) зарегистрированного PSD консоли и что определенная постоянная пружины имеет тот же порядок, что и номинальная постоянная пружины, указанная производителем консоли. Если это не так, диапазон подгонки необходимо отрегулировать вручную, чтобы убедиться, что посадка сходится к первому пику теплового спектра и представляет собой его.
    5. После завершения калибровки закройте окно Диспетчера калибровки . После закрытия Менеджера калибровки в предварительно выбранной директории (см. шаг 3.1.2) генерируется файл калибровки (файл *.tnd ascii) с определенными результатами калибровки, которые в дальнейшем потребуются для анализа данных. Запишите значения калибровки для дальнейшего использования в процессе анализа данных, например, в лабораторном блокноте.
      ВНИМАНИЕ: Начиная с этого шага, воздержитесь от изменения положения лазера на консоли, регулировки зеркала в головке АСМ или перемещения держателя консоли. Изменение этих элементов повлияет на InvOLS и сделает значения калибровки недействительными. Чтобы компенсировать тепловой дрейф, отрегулируйте положение сегментированного фотодиода головки АСМ.
  3. Анализ альвеолярной стенки на срезе легкого
    1. Достаньте предметное стекло для оценки из морозильной камеры. Дайте образцу оттаять при комнатной температуре в течение примерно 1 минуты, пока вся среда ОКТ не станет прозрачной. Затем добавьте несколько капель PBS в участок легочной ткани для его регидратации.
    2. Поместите предметное стекло микроскопа с срезом легочной ткани на предметный столик для образца. Установите головку АСМ обратно на предметный столик и опустите головку до тех пор, пока консоль не окажется примерно на 1 мм выше образца. Добавьте немного дополнительного PBS на боковую сторону держателя кантилевера с помощью шприца объемом 1 мл в сочетании с иглой 0,9 мм x 70 мм до образования жидкого мениска между срезом ткани и держателем кантилевера.
    3. Перейдите в Диспетчер настроек, нажав на кнопку со значком гаечного ключа в правом верхнем углу пользовательского интерфейса. В Диспетчере настроек настройте следующие общие параметры. В разделе «Настройки захода на посадку» установите высоту цели на 4 мкм. Затем в разделе «Настройки текущего режима» перейдите к «Расширенным настройкам обратной связи» и установите Множитель на 1. Наконец, в подразделе «Настройки силы», который также находится в разделе «Настройки текущего режима», выберите опцию «Втянутый пьезо» в раскрывающемся меню «Режим в конце».
    4. Используйте инвертированный оптический микроскоп для идентификации и навигации к неповрежденной альвеолярной стенке. Неповрежденная стена характеризуется на изображении светлого поля темными и гладкими краями. (см. Рисунок 2A-B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Импорт светлопольного изображения в управляющее программное обеспечение АСМ, если оно доступно, может помочь в навигации кантилевера к определенной альвеолярной стене и точном захвате карты силы или QI на ее вершине. В программном обеспечении JPK SPM эта функция называется Direct Overlay.
    5. Задайте параметры кривых силы-вдавливания на левой панели управления в зависимости от используемого АСМ, используемого кантилевера и наблюдаемого образца. Для NanoWizard 4XP и MLCT Cantilever F от Bruker мы рекомендуем следующие параметры: Setpoint = 5 нН; длина z = 8 μм; Скорость z = 300 мкм/с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая длина z 8 μм является довольно большой. Это связано с особенностями легочной ткани. Учитывая, что легочная ткань обычно довольно мягкая, глубина углубления может достигать до 4 мкм в определенных точках, даже при относительно скромном заданном значении в 5 нН. Чтобы гарантировать, что базовая линия, где наконечник не соприкасается с образцом, составляет по меньшей мере около половины кривой сила-индентирование, рекомендуется установить общую длину кривой равной 8 мкм. Это значительно упростит анализ кривых в дальнейшем. Для других био-АСМ эти параметры также должны быть применимы, хотя номенклатура для некоторых параметров, таких как заданное значение, определяющее максимальную силу вдавливания, может отличаться у разных производителей. Если система АСМ не может достичь высокой вертикальной скорости, приведенной здесь, необходимо уменьшить скорость по оси z в соответствии с рекомендацией производителя АСМ.
      ВНИМАНИЕ: Чтобы обеспечить сопоставимость результатов, важно использовать идентичные скорости z-подхода во всех экспериментах.
    6. Задайте местоположение и размер исходной обзорной карты сил, убедившись, что она охватывает всю альвеолярную стенку, простираясь от одной воздушной стороны до другой. Для образцов легочной ткани мышей обычно достаточно размера от 20 мкм x 20 мкм до 30 мкм x 30 мкм. Независимо от конкретного размера карты, установите количество пикселей (которое соответствует количеству записанных силовых кривых) равным 50 x 50. Это приводит к созданию 2500 кривых сила-отступ для каждой карты, что обеспечивает необходимое разрешение для идентификации БМ в канале наклона карты сил. (см. рисунок 2C-D).
    7. После записи обзорной карты изучите высоту и наклон силовой карты. Если канал высоты указывает на то, что альвеолярная стенка не повреждена (см. рисунок 2D) и если можно различить БМ в наклонном канале в виде четко очерченной яркой линии (см. рисунок 2C,E), расположенной между двумя слоями эпителия и эндотелия, захватите более сфокусированную карту сил размером 3 мкм x 3 мкм или 4 мкм x 4 мкм. Держите пиксели на уровне 50 x 50 кривых.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура приводит к более высокому разрешению карты и позволяет регистрировать большее количество значений модуля Юнга, особенно для БМ (см. Рисунок 2E-F). Кроме того, это позволяет более точно дифференцировать КМ и окружающие ткани, повышая точность последующего процесса пространственной фильтрации. Если каналы обзорной карты показывают обрушение или разрыв стены, артефакты, вызванные соприкосновением кантилевера с образцом не только наконечником, или отсутствие идентифицируемой БМ в наклонном канале, перейдите к другой стене на участке ткани до тех пор, пока не будет идентифицирована стена с оценкой БМ без артефактов.
      Повторите предыдущие шаги (3.3.6 и 3.3.7) на последующих срезах того же образца легкого до тех пор, пока не будет оценено желаемое количество альвеолярных стенок. Для достижения устойчивых результатов для каждого образца легкого рекомендуется использовать не менее четырех стенок59.
    8. После завершения измерения очистите все оборудование и материалы, которые контактировали с образцом и PBS. Если образец больше не нужен, выбросьте его в автоклавируемый стеклянный контейнер для отходов. Сохраните все записанные данные и выключите управляющее программное обеспечение и компьютер АСМ. Наконец, выключите все используемые электрические устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен. Экспериментальные данные сохраняются и могут быть проанализированы позже.

4. Анализ данных

  1. Анализ кривых сила-отступ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное руководство по работе с приложением "Анализ кривых силы" можно найти здесь: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
    1. Запустите CANTER Processing Toolbox56 в MATLAB и откройте приложение Force Curve Analysis .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набор инструментов можно скачать из репозитория GitHub, перейдя по этой ссылке: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. Файл README.md, содержащий подробное руководство по установке программного обеспечения и его запуску с помощью MATLAB, доступен в репозитории GitHub. Дополнительную информацию о каждом приложении, включенном в Toolbox, можно найти в соответствующей вики по адресу https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki.
    2. Загрузите карту сил с высоким разрешением (3 мкм x 3 мкм или 4 мкм x 4 мкм), нажав кнопку « Выбрать файл », перейдя к месту, где сохранена карта сил, дважды щелкнув по ней, а затем нажав кнопку «Загрузить данные » в пользовательском интерфейсе приложения.
    3. Появится всплывающее окно с запросом значений калибровки (InvOLS и пружинной постоянной), которые были определены (см. шаг 3.2) для кантилевера, используемого для записи карты силы, выбранной на предыдущем шаге протокола. Введите значения калибровки в соответствующие поля редактирования. Если они не были задокументированы на шаге 3.2.4, обратитесь к автоматически сгенерированному файлу калибровки, который также содержит значения калибровки. Оставьте вариант по умолчанию yes для вопроса о том, следует ли рассчитывать разделение зонда и образца. Затем нажмите кнопку «Отправить », чтобы продолжить.
    4. Появится второе всплывающее окно, позволяющее выбрать геометрию индентора и коэффициент Пуассона для образца с отступом. Для используемых консолей MLCT выберите Четырехсторонняя пирамида в качестве геометрии наконечника и введите 17,5° для полуугла к ребру (оба значения являются значениями по умолчанию). Используйте коэффициент Пуассона по умолчанию, равный 0,5, который представляет собой несжимаемый материал. Чтобы продолжить процедуру загрузки карты QI, нажмите кнопку «Отправить ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры нагружения записанные кривые прогиба-смещения (исходные данные АСМ) преобразуются в кривые сила-вдавливание на основе предоставленных калибровочных значений. Для всестороннего понимания отдельных этапов преобразования и связанных с ними уравнений обратитесь к дополнительной информации Hartmann et al.59.
    5. По завершении процесса загрузки на экране отобразится начальная силовая кривая карты силы. Убедитесь, что выбран режим коррекции базовой линии Смещение + Наклон . Этот режим автоматически определяет базовую линию кривой силы и индукции корректирует наклон и смещение по вертикали до нуля. Кроме того, выберите модель Hertz в качестве алгоритма для поиска точек контакта и используйте значение 20% в назначенном поле редактирования для этой опции. Этот алгоритм особенно хорошо подходит для определения точки контакта на кривых сила-вдавливание, которые были зарегистрированы на образцах мягких тканей. Наконец, установите глубину подгонки в соответствующем поле редактирования на 1,5 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать, что жесткость предметного стекла микроскопа не влияет на результирующий модуль Юнга, рекомендуется установить максимальную глубину посадки на значение, которое не превышает 10% от толщины среза ткани60. Более подробно об алгоритмах коррекции см. дополнительную информацию Hartmann et al.59.
      ВНИМАНИЕ: Используйте одну и ту же глубину подгонки на протяжении всех экспериментов, чтобы гарантировать сопоставимость результатов.
    6. Чтобы применить аппроксимацию модифицированной модели Герца ко всем кривым сила-отступ карты QI, нажмите кнопку Сохранить и применить ко всем . Откроется диалоговое окно с вопросом о том, должна ли отображаться каждая силовая кривая во время расчета. Благодаря отсутствию отображения кривых скорость обработки немного увеличивается.
    7. После завершения анализа последней силовой кривой появляется окно с вопросом, следует ли сохранять результаты подгонки. Чтобы сохранить результаты в обоих. tsv (значения, разделенные табуляцией) и .xlsx (Excel), нажмите « Да » и введите имя для файлов результатов. Кроме того, сохраняется текстовый файл с расширением *.meta_data, который содержит все детали анализа кривых, такие как использованные значения калибровки, выбранная модель посадки, выбранный алгоритм определения точки контакта, диапазон посадки и другую актуальную информацию.
    8. Закройте приложение Force Curve Analysis , нажав на значок крестика в правом верхнем углу главного окна.
  2. Пространственная фильтрация результатов карты QI
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг пространственной фильтрации гарантирует, что для любого дальнейшего анализа будут учитываться только значения модуля Юнга карт QI, происходящих из BM. Подробное руководство по работе с инструментом фильтрации результатов можно найти здесь: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
    1. Выберите инструмент фильтрации результатов из списка приложений в окне выбора приложения на панели инструментов CANTER Processing Toolbox и запустите приложение, нажав на кнопку «Запустить приложение».
    2. Чтобы загрузить результаты подгонки, нажмите « Открыть » в верхней строке меню пользовательского интерфейса инструмента фильтрации результатов . В открывшемся окне найдите первую кнопку «Установить », расположенную на вкладке «Карты JPK», и выберите файл .tsv, содержащий результаты анализа кривой силы (см. шаг 4.1.6). Нажмите на вторую кнопку «Установить » и найдите файл карты QI, который соответствует уже выбранному файлу .tsv. Затем нажмите кнопку Отправить , чтобы загрузить данные карты и результаты анализа кривой силы.
    3. Выберите опцию Emodul в верхнем выпадающем меню Отображаемый канал , чтобы отобразить полученные результаты модуля Юнга в виде изображения карты. Кроме того, выберите опцию Emodul (если она еще не выбрана) в раскрывающемся меню Канал данных , расположенном под графиком гистограммы, чтобы визуализировать распределение загруженных значений модуля Юнга на карте QI.
    4. Нажмите на кнопку со стрелкой потока манипуляций , которая находится в центре пользовательского интерфейса, и убедитесь, что она указывает на правую сторону. Установите переключатель фильтра изображений в положение Вкл на панели фильтров, расположенной над осями гистограммы. Выберите параметр «От руки » в раскрывающемся меню «Фильтр геометрии », а затем нажмите кнопку « Добавить ».
    5. На изображении верхнего канала нарисуйте маску фильтра, обводя БМ, удерживая левую клавишу мыши. БМ можно идентифицировать на карте модуля Юнга как яркую (высокие значения модуля Юнга) структуру по сравнению с соседними более мягкими тканями (см. рисунок 3А). Когда закончите рисовать маску, отпустите левую клавишу мыши и дважды щелкните по маске, которая будет применена к карте. График гистограммы справа теперь показывает только значения модуля Юнга для областей карты, выделенных зеленым цветом (цвет по умолчанию; см. рисунок 3C-D).
    6. Чтобы создать новый файл результатов .tsv, содержащий только замаскированные значения модуля Янга, щелкните в верхней строке меню пользовательского интерфейса на Сохранить > Сохранить гистограмму > Сохранить данные. Либо щелкните правой кнопкой мыши пустую область осей построения гистограммы и выберите в контекстном меню пункт Сохранить данные .
    7. Нажмите « Выбрать все » во всплывающем окне с вопросом, какие результаты записывать в файл .tsv. Затем подтвердите выбор, нажав кнопку OK . После этого введите имя файла .tsv в диалоговом окне сохранения, выберите желаемое место сохранения и, наконец, нажмите OK , чтобы сохранить отфильтрованные результаты.
    8. Закройте инструмент фильтрации результатов , нажав на значок крестика в правом верхнем углу приложения.
  3. R2 фильтрация результатов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап протокола гарантирует, что учитываются только результаты модуля Юнга, в которых модифицированная модель Герца показала хорошее согласие с кривой сила-вдавливание, к которой она была подогнана. Подробное руководство по R² Filtering Tool можно найти здесь: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
    1. Запустите инструмент фильтрации R², выбрав его в списке приложений в окне выбора приложения на панели инструментов CANTER Processing Toolbox и нажав на кнопку «Начать приложение».
    2. Перейдите в верхнюю строку меню пользовательского интерфейса и нажмите « Открыть файл .tsv». В открывшемся диалоговом окне загрузки файла найдите файл .tsv, содержащий результаты модуля Юнга BM, сохраненные на предыдущем шаге 4.2.5, и выберите его, дважды щелкнув мышью.
    3. Появится диалоговое окно, в котором будет представлен список столбцов данных, содержащихся в TSV-файле. Выберите Emodul в качестве столбца, содержащего данные о модуле Юнга. Затем в отдельном диалоговом окне списка, запрашивающем данные R², выберите rsquare_fit. После завершения процедуры загрузки загруженные данные модуля Юнга отображаются в виде гистограммы в верхней левой части экрана, а распределение данных R² отображается на графике в верхней правой части.
    4. Введите 0.96 в поле редактирования, расположенное в центре графического пользовательского интерфейса. Нажмите кнопку «Фильтр данных », чтобы применить фильтр R² с использованием введенного значения. Это действие сохранит только те результаты, которые имеют значение R² 0,96 или выше. Отфильтрованные распределения результатов по модулю Юнга и соответствующие значения R² отображаются в нижней половине пользовательского интерфейса.
    5. Выберите Сохранить отфильтрованные данные в верхней строке меню, чтобы создать новый TSV-файл, содержащий только те результаты, которые соответствуют определенному критерию фильтра R² > 0,96. Сохраненные данные теперь можно отобразить в виде гистограммы, например, с помощью инструмента Histogram Plotting Tool, который визуализирует распределение модуля Юнга для зондируемой легочной КМ (см. рисунок 4A).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После идентификации и измерения интактной альвеолярной стенки первичным результатом применения этого протокола являются отфильтрованные значения модуля Юнга БМ. Важно отметить, что невозможно найти подходящую альвеолярную стенку для измерения АСМ на каждом участке ткани. В наших экспериментальных наблюдениях примерно 75% криорезов, полученных из образцов легких мышей, имели поддающуюся количественной оценке альвеолярную стенку. Чтобы точно определить пространственное распределение модуля Юнга в легочной КМ, мы рекомендуем использовать карты сил, охватывающие либо 3 мкм x 3 мкм, либо 4 мкм x 4 мкм. Такой подход обеспечивает достаточное разрешение для исследования легочных КМ мышей, толщина которых обычно составляет от 100 нм до 200 нм. Таким образом, экспериментальный подход включает в себя захват кривых силы размером 50 x 50 для каждой карты сил, что дает в общей сложности 2500 кривых силы. В силовой карте силовые кривые равномерно распределены. Это означает, что в дополнение к модулю Юнга БМ, тканевые структуры, окружающие БМ, исследуются даже на малых силовых картах. Поэтому для точного и селективного определения модуля Юнга исключительно легочной КМ мы реализовали в этом протоколе двухступенчатый процесс фильтрации.

На начальном этапе фильтрации пространственной фильтрации, зависящей от оператора, выбираются результаты подгонки силовой кривой, исходящие из мышиного легочного БМ, составляющие примерно от 10% до 25% от общих значений результатов, содержащихся в анализируемой карте сил. После этой первоначальной пространственной фильтрации примерно 250 - 625 результатов аппроксимации сохраняются для дальнейшего анализа. Следующий шаг фильтрации гарантирует, что будут включены только связанные с BM результаты, полученные из кривых сил, адекватно описанных модифицированной моделью Герца. Поэтому в качестве фильтрующего критерия используется коэффициент детерминации (R2) модифицированной модели Герца. Наш эмпирический опыт показывает, что сохранение результатов со значениями R2 выше 0,96 подходит для результатов соответствия, полученных при соблюдении этого протокола. Важно отметить, что значение R2 в значительной степени зависит от качества (гладкости) и длины базовой линии силовой кривой, определения точки контакта и сходимости подогнанной модели. После применения обеих процедур фильтрации для BM одной альвеолярной стенки обычно остается от 100 до 500 значений модуля Юнга.

Распределение этих остальных значений модуля Юнга от БМ можно визуализировать с помощью гистограммы (рис. 4A). Важно отметить, что результирующие значения модуля Юнга легочной КМ следуют логарифмически нормальному распределению, которое обычно наблюдается для случайных величин, которые могут достигать только положительных значений61. Это визуализировано с помощью графика QQ на рисунке 4B. Следовательно, нормальное (гауссовское) распределение может быть подогнано к распределению логарифмически преобразованных значений модуля Юнга (E). Здесь натуральный логарифм (ln) использовался для преобразования значений E . Пиковое положение распределения (μ) и стандартное отклонение (σ) были извлечены из этого подгонки и впоследствии преобразованы для получения репрезентативного модуля Юнга, обозначенного как EBM, с использованием следующего уравнения:

figure-results-1

Обратите внимание, что после преобразования интервал стандартного отклонения больше не симметричен относительно пикового значения. Отрицательные (σ-) и положительные (σ+) ребра интервала стандартного отклонения могут быть вычислены с помощью следующих выражений:

figure-results-2

figure-results-3

Эти уравнения являются следствием того факта, что экспоненциальная функция является обратной функцией натурального логарифма62.

После повторного преобразования пикового значения μ = 9,31 и стандартного отклонения σ = 0,18, определенного по гистограмме на рисунке 4A, репрезентативное значение модуля Юнга составляет EBM = 11,05 кПа со стандартным интервалом отклонения [-1,82 кПа, +2,18 кПа]. В качестве альтернативы, логнормальное распределение может быть подогнано к гистограмме непреобразованных значений модуля Юнга (E) для определения характеристических параметров распределения.

Рекомендуется анализировать по крайней мере четыре стенки на мышь для получения надежного репрезентативного результата, как мы подробно показали в Hartmann et al.59. Чтобы определить репрезентативный модуль Юнга EBM для мыши, логарифмически преобразованные значения всех четырех стен были построены в одной объединенной гистограмме, а μ и σ были определены путем подгонки нормального распределения. Впоследствии μ и σ преобразуются, как описано ранее, для получения EBM и интервала стандартного отклонения для рассматриваемой мыши.

figure-results-4
Рисунок 1: Обзор основных этапов протокола для определения модуля Юнга базальной мембраны легких мышей. Начальный этап включает в себя получение и подготовку легких мышей с последующим их внедрением. Следовательно, в легкое вводят комбинацию среды ОКТ и PBS, а затем полностью погружают в соединение ОКТ. После этого срезы легочной ткани толщиной 15 мкм получают путем криосекции с помощью криотома. В этом протоколе мы подробно описываем процесс использования односторонних и двусторонних клейких лент для фиксации образцов на месте в процессе резки. Впоследствии значения модуля Юнга БМ определяются с помощью измерений карты силы АСМ на срезах тканей. После завершения процесса анализа кривой силы применяется пространственная фильтрация и фильтрация R² для выделения результатов модуля Юнга интересующей структуры, в частности BM (показанной зеленым цветом на карте сил и количественно выраженной в логарифмически преобразованном распределении модуля Юнга). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 2: Примерный эксперимент по силовой карте АСМ, проведенный на срезе легочной ткани мыши. (A) Обзорное изображение среза легочной ткани мыши, полученное с помощью светлопольной микроскопии, позволяющее идентифицировать подходящие неповрежденные альвеолярные стенки, расположенные между двумя альвеолами. В правой части изображения виден консоль MLCT треугольной формы F АСМ. (B) Увеличенный вид выбранной стенки в пределах участка ткани. (C) Наклон и (D) Канал высоты обзорной карты 15 x 15 мкм, содержащей силовые кривые альвеолярной стенки 50 x 50. В наклонном канале БМ можно идентифицировать по яркой линии (белая стрелка), указывающей на структуру повышенной жесткости внутри стены. Высотный канал подтверждает целостность стены, не показывая никаких признаков разрыва. После идентификации BM на обзорной карте 15 x 15 μm записывается карта меньшего размера 4 x 4 μm (E: канал наклона, F: канал высоты) с кривыми силы 50 x 50. Масштабные линейки: (A) 200 μм и (B-D) 25 μм. Диапазоны цветовых шкал показанных изображений АСМ составляют: (C) 2,36 - 9,29 нН/мкм, (D) 0 - 3,38 мкм, (E) 2,36 - 9,29 нН/мкм (обзорное изображение) и 2,42 - 8,37 нН/μм (меньшее изображение), (F) 0 - 3,38 мкм (обзорное изображение) и 0 - 1,99 мкм (меньшее изображение), от темного до яркого. Линейные цветовые шкалы использовались для всех изображений АСМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 3: Визуализация процедуры пространственной фильтрации. (A) Отображение модуля Юнга, полученное в результате анализа кривой силы, как показано в инструменте фильтрации результатов для обеспечения пространственной фильтрации результатов. БМ можно идентифицировать как яркую полосу (с высокими значениями модуля Юнга), окруженную более мягкими тканевыми отсеками. (В) Гистограмма значений модуля Юнга, соответствующих нефильтрованному отображению (А). После (C) применения пространственной маски фильтра (зеленая область), (D) гистограмма содержит исключительно значения модуля Юнга из выделенной зеленым цветом области, которая была идентифицирована как BM. Обратите внимание, что остаточные мягкие значения, наблюдаемые в левой части гистограммы, могут быть отнесены к плохо сходящимся аппроксимациям, которые будут устранены на следующем этапе фильтрации R². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 4: Распределение модуля Юнга легочной КМ мыши, полученной в соответствии с этим протоколом. (A) Логарифмически нормализованная гистограмма результирующих значений модуля КМ Юнга (N = 325). Путем подгонки нормального распределения (черная сплошная линия) определяется среднее значение μ = 9,31 со стандартным отклонением σ = 0,18. После ретрансформации это соответствует модулю Юнга BM от E BM = 11,05кПа с интервалом несимметричного стандартного отклонения [-1,82 кПа, +2,18 кПа]. (B) QQ График квантилей логарифмизированных значений модуля Б.М. Юнга в зависимости от квантилей стандартного нормального распределения. Этот график демонстрирует, что, за исключением некоторых значений в левом и правом хвостах распределения, результирующие значения модуля Юнга в основном являются логарифмически нормальным распределением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механические характеристики КМ вызвали значительный интерес из-за их влияния на различные клеточные функции, такие как почкование опухолей, клеточная дифференцировка, движение клеток и доступность хроматина 53,63,64,65,66,67,68 . Следовательно, существует невосполнимый пробел в способности оценивать механику БМ последовательным и измеримым образом. Этот протокол направлен на то, чтобы позволить пользователям ОВМ определять модуль Юнга легочных КМ из здоровых или патологических образцов легких мышей, полученных от диких или генетически модифицированных мышей. Удобное графическое пользовательское приложение MATLAB CANTER Processing Toolbox56 облегчает последующий анализ данных АСМ. Ожидается, что этот протокол будет полезен для других исследователей, проводящих исследования, которые могут привести к прогрессу в клинической диагностике, лечении или новых стратегиях лечения заболеваний легких.

Важнейшие шаги в протоколе включают в себя обеспечение того, чтобы во время криоссекции образца легких срезы тканей не оттаивали в любое время, чтобы предотвратить изменение механических свойств из-за циклов замораживания-оттаивания. Поэтому для сбора срезов важно использовать только предварительно охлажденные предметные стекла микроскопа и работать с ними только в камере криотома. Наиболее важным шагом при записи карт сил на альвеолярной стенке является использование сгенерированного изображения уклона, которое обеспечивает качественный обзор распределения жесткости зондируемой области, для определения подходящего места измерения БМ. Пространственная фильтрация полученных значений модуля Юнга представляет собой критический шаг в протоколе и является ключевой функцией CANTER Processing Toolbox. Этот этап фильтрации позволяет исследователю идентифицировать BM, который расположен между двумя более мягкими слоями клеток, по его характерному более жесткому следу и извлечь соответствующие значения модуля Юнга BM для дальнейшего анализа.

Этот процесс расширенного анализа показал, что мыши с нокаутом нетрина-4 демонстрировали значительно (примерно в два раза) более высокий модуль Юнга в легочной базальной мембране по сравнению с мышами дикого типа53. Таким образом, настоящий протокол облегчает сравнительный анализ различных состояний или групп.

В дополнение к АСМ существуют многочисленные методики для изучения механических свойств биоматериалов, охватывающие оптический или магнитный пинцет 69,70,71 на молекулярном уровне, методы микроиндентирования72,73 на промежуточном уровне и испытания на ограниченное или неограниченное сжатие74,75 на макроскопическом уровне. В частности, миография давлением, испытание на растяжение76,77 и реология78 были использованы для оценки жесткости КМ сосудистых образцов и восстановленных матриц БМ. Тем не менее, такие методы, как миография давлением и испытание на растяжение, могут оценить только механические характеристики полных тканей или целых тканевых структур, таких как целые кровеносные сосуды, которые включают в себя различные клеточные слои и структурные элементы. В результате, при использовании этих методов для оценки биомеханики БМ, механические свойства не-БМ, такие как клеточные компоненты, всегда накладываются на результаты БМ, что затрудняет выделение специфических свойств самой БМ.

В этом протоколе интересующий признак (BM) извлекается путем пространственной фильтрации результатов карты сил. Ограничением этого подхода является требование, чтобы интересующий нас признак был различим и идентифицируем как отчетливый шаблон в полученных отображениях модуля Юнга или в любом другом доступном канале отображения. Например, КМ в альвеолярной ткани можно идентифицировать исключительно благодаря ее взаимосвязанной структуре, которая демонстрирует значительно более высокий модуль Юнга по сравнению с окружающими клетками. Следовательно, БМ проявляется в виде непрерывной яркой полосы в полученных отображениях модуля Юнга. Тем не менее, другие биологические структуры демонстрируют механические свойства, которые недостаточно отличаются от механических свойств окружающих тканей, чтобы обеспечить пространственную фильтрацию в результатах карты. Несмотря на то, что протокол может быть объединен с другими методами идентификации структур в зарегистрированных картах сил, такими как иммунофлуоресцентное окрашивание, этот подход может дать результаты, которые трудно интерпретировать. Это осложнение может возникнуть из-за того, что процедуры окрашивания могут изменить механические свойства тканей. Следовательно, любая обработка или окрашивание ткани перед измерениями АСМ должны проводиться только в том случае, если нет альтернативного метода для идентификации интересующего признака. Кроме того, важно проводить соответствующие контрольные эксперименты, сравнивая биомеханические свойства окрашенных и неокрашенных образцов.

В протоколе представлен метод идентификации целевых структур на основе контраста модуля Юнга. Следовательно, его можно применять к тканям с анатомическим КМ, аналогичному КМ легкого, включая щитовидную железу, толстую кишку и простату. (см. Рисунок расширенных данных в Hartmann et al.59). Несмотря на то, что изначально этот протокол был разработан для анализа механики БМ, этот протокол и CANTER Processing Toolbox56 достаточно универсальны для изучения любой механически отдельной и связанной области в пределах карт сил АСМ (см. инструкции в www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). Эта широкая применимость делает этот инструмент ценным в области АСМ и поддерживает растущее внимание к механобиологии в более широком научном сообществе.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H. и H.C.-S. выразить признательность за финансирование со стороны Баварского государственного министерства науки и искусств через Баварский исследовательский центр Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) и Баварский академический форум (BayWISS) и Докторский консорциум по исследованиям в области здравоохранения. Разработка программного обеспечения для анализа данных CANTER Processing Toolbox финансировалась Немецким научно-исследовательским обществом в рамках подпроекта 1 (CL 409/4-1/2) исследовательского консорциума «Изучение дегенерации и регенерации суставного хряща и субхондральной кости при остеоартрозе» - ExCarBon (FOR2407-1/2). Б.Х. и Х.К.-С. выражаем признательность за финансирование со стороны Немецкого научно-исследовательского общества в рамках крупной кампании по разработке приборов GGA-HAW (INST 99/38-1). Эта работа была поддержана Датским онкологическим обществом (R204-A12454 (R.R.)) и Немецким научно-исследовательским обществом (539446614-R.R.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл ШприцB Braun9166017VInjekt-F
10 мл ШприцB Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 мл Falcon TubeSarstedt62.554.002винтовая крышка трубка
Консоль - MLCTBruker AFM Probes3444AFM Консоль с пирамидальной формой наконечника
Криотомного лезвияLeica Biosystems14035843496Низкопрофильные одноразовые лезвия DB80LX
Cryotome Держатель образцаLeica Biosystems14047740044Диск для образцов 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay ExtensionBrukerдля программного обеспечения JPK SPM, позволяющее импортировать оптическое изображение инвертированного микроскопа в Просмотрщик данных программного обеспечения SPM.
Одноразовая основа пресс-формыНаучные услугиSA62534-15Ткань-тек Криомолд 15x15x5
мм Двухсторонняя лентаtesa Пленка56661-00002Фотопленочная лента
Фиксированная пружина Держатель кантилевераBruker
Инвертированный микроскоп - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK Моторизованная сценаBruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS Microscope KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksVersion R2024a или выше
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - Набор инструментов для обработки изображенийMathworks
MATLAB - Набор инструментов для обработки сигналов Mathworks
MATLAB - Набор инструментов для статистики и машинного обученияMathworks
Предметные стекла для микроскопаCarl RothH869.1Простые предметные стекла для калибровки кантилевера
Предметные стекла для микроскопа - матовый крайCarl RothH870.1Предметные стекла для микроскопа с матовым краем для криосекции
Needle ø 0,9 мм и раз; 25 ммB Braun4657500ОКТ для инъекции в образец легкого
иглой 0,9 мм и раз; 70 ммB Braun4665791Длинная игла для нанесения PBS под состав AFM
OCTSakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. Compound
Phosphate Buffered Salt BufferedBio& ПродамBS.L1825PBS solution without Ca2+, Mg2+, 500 мл
QI Advanced Imaging ExtensionBrukerдля программного обеспечения JPK SPM, которое предоставляет для каждого пикселя записанного изображения всю основную кривую силы.
СкальпельB Braun5518083хирургические одноразовые ножницы для скальпеля
Kaut-BullingerM681700Precise Scissors 13 см 
Односторонняя лентаtesa Пленка57330-00000кристально прозрачная лента, 33 м x 19 мм
СлайдбоксGWL Storage SystemsK50WСлайдбокс на 50 слайдов
Стерео микроскоп - Stemi DR1663Пинцет Zeiss
- Vomm SS-SA-ESDEleshop ELE002121
Программное обеспечение Расширение программного обеспечения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsteens, D., et al. Atomic force microscopy-based characterization and design of biointerfaces. Nat Rev Mater. 2 (5), 17008(2017).
  2. Aro, E., et al. Severe extracellular matrix abnormalities and chondrodysplasia in mice lacking collagen prolyl 4-hydroxylase isoenzyme II in combination with a reduced amount of isoenzyme I. J Biol Chem. 290 (27), 16964-16978 (2015).
  3. Domke, J., Radmacher, M. Measuring the elastic properties of thin polymer films with the atomic force microscope. Langmuir. 14 (12), 3320-3325 (1998).
  4. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), e0220281(2019).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: validation with a gel-microfiber composite. Biophys J. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  7. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nanotechnol. 7 (11), 757-765 (2012).
  8. Prein, C., et al. Structural and mechanical properties of the proliferative zone of the developing murine growth plate cartilage assessed by atomic force microscopy. Matrix Biol. 50, 1-15 (2016).
  9. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophys J. 70 (1), 556-567 (1996).
  10. Radmacher, M., Tillamnn, R. W., Fritz, M., Gaub, H. E. From molecules to cells: imaging soft samples with the atomic force microscope. Science. 257 (5078), 1900-1905 (1992).
  11. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nat Nanotechnol. 4, 186-192 (2009).
  12. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophys J. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  13. Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  14. Hansma, P. K., et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids. Appl Phys Lett. 64 (13), 1738-1740 (1994).
  15. Moy, V. T., Florin, E. L., Gaub, H. E. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. Science. 266 (5183), 257-259 (1994).
  16. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, H. G., Hansma, P. K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. Science. 265 (5178), 1577-1579 (1994).
  17. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, P. K. Imaging soft samples with the atomic force microscope: gelatin in water and propanol. Biophys J. 69 (1), 264-270 (1995).
  18. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat Struct Biol. 6 (4), 346-349 (1999).
  19. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  20. Drake, B., et al. Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope. Science. 243 (4898), 1586-1589 (1989).
  21. Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical stability of single DNA molecules. Biophys J. 78 (4), 1997-2007 (2000).
  22. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophys J. 78 (1), 520-535 (2000).
  23. Lekka, M., et al. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy. Eur Biophys J. 28 (4), 312-316 (1999).
  24. Weisenhorn, A. L., Khorsandi, M., Kasas, S., Gotzos, V., Butt, H. J. Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM. Nanotechnology. 4 (2), 106(1993).
  25. Rotsch, C., Jacobson, K., Radmacher, M. Dimensional and mechanical dynamics of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by using atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (3), 921-926 (1999).
  26. Goldmann, W. H., Ezzell, R. M. Viscoelasticity in wild-type and vinculin-deficient (5.51) mouse F9 embryonic carcinoma cells examined by atomic force microscopy and rheology. Exp Cell Res. 226 (1), 234-237 (1996).
  27. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomater. 126, 315-325 (2021).
  28. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthr Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  29. Kinney, J. H., Balooch, M., Marshall, S. J., Marshall, G. W. Jr, Weihs, T. P. Atomic force microscope measurements of the hardness and elasticity of peritubular and intertubular human dentin. J Biomech Eng. 118 (1), 133-135 (1996).
  30. Symposium on Thin Films - Stresses and Mechanical Properties VI,. 1996 MRS Spring Meeting. Lundkvist, A., et al. , 353-358 (1997).
  31. Tao, N. J., Lindsay, S. M., Lees, S. Measuring the microelastic properties of biological material. Biophys J. 63 (4), 1165-1169 (1992).
  32. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Eng Med Biol Mag. 16 (2), 47-57 (1997).
  33. Becke, T. D., et al. Pilus-1 backbone protein RrgB of Streptococcus pneumoniae binds collagen I in a force-dependent way. ACS Nano. 13 (6), 7155-7165 (2019).
  34. Becke, T. D., et al. Single molecule force spectroscopy reveals two-domain binding mode of Pilus-1 tip protein RrgA of Streptococcus pneumoniae to fibronectin. ACS Nano. 12 (1), 549-558 (2018).
  35. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical activation drastically accelerates amide bond hydrolysis, matching enzyme activity. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  36. Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Single-molecule force-clamp experiments reveal kinetics of mechanically activated silyl ester hydrolysis. ACS Nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).
  37. Docheva, D., et al. Researching into the cellular shape, volume and elasticity of mesenchymal stem cells, osteoblasts and osteosarcoma cells by atomic force microscopy. J Cell Mol Med. 12 (2), 537-552 (2008).
  38. Docheva, D., Padula, D., Schieker, M., Clausen-Schaumann, H. Effect of collagen I and fibronectin on the adhesion, elasticity and cytoskeletal organization of prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 361-366 (2010).
  39. Kiderlen, S., et al. Age related changes in cell stiffness of tendon stem/progenitor cells and a rejuvenating effect of ROCK-inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 509 (3), 839-844 (2019).
  40. Reuten, R., et al. Structural decoding of netrin-4 reveals a regulatory function towards mature basement membranes. Nat Commun. 7, 13515(2016).
  41. Fleischhauer, L., et al. Nano-scale mechanical properties of the articular cartilage zones in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Appl Sci. 12 (5), 2596(2022).
  42. Alberton, P., et al. Aggrecan hypomorphism compromises articular cartilage biomechanical properties and is associated with increased incidence of spontaneous osteoarthritis. Int J Mol Sci. 20 (5), 1-16 (2019).
  43. Alberton, P., et al. Aggrecan is critical in maintaining the cartilage matrix biomechanics which in turn influences the correct development of the growth plate. Osteoarthr Cartilage. 27, S178-S178 (2019).
  44. Gronau, T., et al. Forced exercise-induced osteoarthritis is attenuated in mice lacking the small leucine-rich proteoglycan decorin. Ann Rheum Dis. 76 (2), 442-449 (2017).
  45. Hartmann, B., et al. Early detection of cartilage degeneration: A comparison of histology, fiber Bragg grating-based micro-indentation, and atomic force microscopy-based nano-indentation. Int J Mol Sci. 21 (19), 7384-7398 (2020).
  46. Rellmann, Y., et al. ER stress in ERp57 knockout knee joint chondrocytes induces osteoarthritic cartilage degradation and osteophyte formation. Int J Mol Sci. 23 (1), 182(2021).
  47. Kamper, M., et al. Early changes in morphology, bone mineral density and matrix composition of vertebrae lead to disc degeneration in aged collagen IX -/- mice. Matrix Biol. 49, 132-143 (2016).
  48. Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. Characterizing the elastic properties of tissues. Mater Today. 14 (3), 96-105 (2011).
  49. Junior, C., et al. Baseline stiffness modulates the non-linear response to stretch of the extracellular matrix in pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12928(2021).
  50. Junior, C., et al. Multi-step extracellular matrix remodelling and stiffening in the development of idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 24 (2), 1708(2023).
  51. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. J Mech Behav Biomed Mater. 74, 118-127 (2017).
  52. Zemla, J., et al. AFM-based nanomechanical characterization of bronchoscopic samples in asthma patients. J Mol Recognit. 31 (12), e2752(2018).
  53. Reuten, R., et al. Basement membrane stiffness determines metastases formation. Nat Mater. 20 (6), 892-903 (2021).
  54. Johnstone, A. H. CRC Handbook of Chemistry and Physics. J Chem Technol Biotechnol. 50 (2), 294-295 (1991).
  55. Rico, F., et al. Probing mechanical properties of living cells by atomic force microscopy with blunted pyramidal cantilever tips. Phys Rev E. 72 (2), 1-10 (2005).
  56. CANTER Processing Toolbox v.5.7.0. , GitHub. (2022).
  57. Hutter, J. L. J. B. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64 (7), 1868-1873 (1993).
  58. Schillers, H., et al. Standardized nanomechanical atomic force microscopy procedure (SNAP) for measuring soft and biological samples. Sci Rep. 7 (1), 5117(2017).
  59. Hartmann, B., et al. Profiling native pulmonary basement membrane stiffness using atomic force microscopy. Nat Protoc. 19 (5), 1498-1528 (2024).
  60. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys J. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  61. Jolicoeur, P. Introduction to Biometry. , Springer US. Boston, MA. (1999).
  62. Bronshtein, I. N., Semendyayev, K. A., Musiol, G., Mühlig, H. Handbook of Mathematics. , 6th Edition, Springer. Berlin. (2015).
  63. Fiore, V. F., et al. Mechanics of a multilayer epithelium instruct tumour architecture and function. Nature. 585 (7825), 433-439 (2020).
  64. Koester, J., et al. Niche stiffening compromises hair follicle stem cell potential during ageing by reducing bivalent promoter accessibility. Nat Cell Biol. 23 (7), 771-781 (2021).
  65. Bedzhov, I., Zernicka-Goetz, M. Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell. 156 (5), 1032-1044 (2014).
  66. Kyprianou, C., et al. Basement membrane remodelling regulates mouse embryogenesis. Nature. 582 (7811), 253-258 (2020).
  67. Saraswathibhatla, A., Indana, D., Chaudhuri, O. Cell-extracellular matrix mechanotransduction in 3D. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 495-516 (2023).
  68. Sherwood, D. R. Basement membrane remodeling guides cell migration and cell morphogenesis during development. Curr Opin Cell Biol. 72, 19-27 (2021).
  69. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11 (5), 288(1986).
  70. Marago, O. M., Jones, P. H., Gucciardi, P. G., Volpe, G., Ferrari, A. C. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 8 (11), 807-819 (2013).
  71. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  72. Marchi, G., et al. Microindentation sensor system based on an optical fiber Bragg grating for the mechanical characterization of articular cartilage by stress-relaxation. Sens Actuators B. 252, 440-449 (2017).
  73. Wakitani, S., et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel. Tissue Eng. 4 (4), 429-444 (1998).
  74. Moutos, F. T., Freed, L. E., Guilak, F. A biomimetic three-dimensional woven composite scaffold for functional tissue engineering of cartilage. Nat Mater. 6 (2), 162-167 (2007).
  75. Schwarz, S., et al. Contactless vibrational analysis of transparent hydrogel structures using laser-Doppler vibrometry. Exp Mech. 60 (8), 1067-1078 (2020).
  76. Bhave, G., Colon, S., Ferrell, N. The sulfilimine cross-link of collagen IV contributes to kidney tubular basement membrane stiffness. Am J Physiol Renal Physiol. 313 (3), F596-F602 (2017).
  77. Fisher, R. F., Wakely, J. The elastic constants and ultrastructural organization of a basement membrane (lens capsule). Proc R Soc Lond B Biol Sci. 193 (1113), 335-358 (1976).
  78. Wisdom, K. M., et al. Covalent cross-linking of basement membrane-like matrices physically restricts invasive protrusions in breast cancer cells. Matrix Biol. 85-86, 94-111 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CANTER Processing Toolbox

Похожие статьи