Генерация трехмерных сфероидов/органоидов из двумерных клеточных культур с использованием нового штампового устройства

Summary

В данном исследовании представлена экономически эффективная и эффективная методология создания 3D-ячеечных структур с использованием штамповой системы для создания микролунок в агарозных формах. Система способствует образованию однородных сфероидов/органоидов, тем самым улучшая клеточные взаимодействия. Этот подход снижает экспериментальную вариативность и поддерживает приложения в тестировании лекарств и тканевой инженерии.

Abstract

Трехмерные (3D) клеточные культуры обеспечивают более точное представление микроокружения in vivo , чем обычные двумерные (2D) культуры, поскольку они способствуют усилению взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом. Целью данного исследования была разработка эффективной, экономичной и воспроизводимой методологии создания 3D-клеточных структур (сфероидов/органоидов) с использованием инновационной системы на основе штампов для создания микролунок в агарозных формах. Новый штамп был использован для производства 663 микролунок на лунку 6-луночного планшета, что обеспечило идеальную среду для агрегации клеток. Первичные островковые клетки поджелудочной железы свиней были посажены в эти микролунки, где они агрегировались с образованием сфероидов/органоидов. Культуры инкубировали при 37 °C при 5%_CO2, а среду заменяли каждые 3 дня. Формирование сфероидов периодически контролировалось, и отбирались образцы для характеризации. Метод успешно сгенерировал однородные и высококачественные сфероиды, снизив экспериментальную изменчивость, минимизировав манипуляции и усилив клеточные взаимодействия. Использование пресс-форм на основе агарозы с микроузорами обеспечило упрощенную, контролируемую среду для 3D-культур, предлагая стандартизированное и экономичное решение. Эта методология поддерживает приложения для тестирования лекарств и тканевой инженерии, предлагая практичную и масштабируемую платформу для 3D-моделей клеточных культур, которые могут быть легко реализованы в различных лабораторных условиях.

Introduction

За последние 50 лет многочисленные исследования в области клеточной биологии показали, что двумерные (2D) культуры не могут точно воспроизвести условия in vivo, наблюдаемые на^{животных моделях}. Структурно двухмерные клеточные культуры не позволяют клеткам организовываться трехмерно и воспроизводить ситуацию, наблюдаемую в системах in vivo. Кроме того, клеточные сигнальные пути изменены в 2D-культурах по сравнению с трехмерными (3D) культурами, что, вероятно, может объяснить, почему определенные типы скрининга наркотиков с использованием 2D-культур так отличаются друг от^друга. Значительный прогресс в методах культивирования клеток произошел с внедрением систем 3D-культивирования. 3D-системы значительно различаются по сложности в зависимости от клеточного состава и цитоархитектуры. Как правило, образуются два типа структур, а именно: сфероиды и органоиды. Сфероиды описываются как простые скопления клеток, полученных из нормальных или опухолевых тканей, эмбриоидных тел и клеточных линий. На формирование 3D-структур влияют различные факторы, в том числе межклеточные взаимодействия и сигнальные пути, опосредованные компонентами внеклеточного матрикса (ВКМ), которые обеспечивают структурную поддержку и биохимические сигналы. Эти элементы регулируют взаимодействия, которые способствуют организации и функционированию тканей³. Система сфероидных культур была впервые описана в начале 1970-х годов с использованием клеточных линий легких китайского хомяка V79 в качестве модели узловых карцином, растущих в неадгезивных условиях и образующих идеальные^сферы. Органоиды описываются как кластеры органоспецифичных типов клеток, полученных из стволовых или прогениторных клеток, которые самоорганизуются посредством таких процессов, как сортировка клеток и спецификация родословной, в пространственно ограниченном виде, отражая^{развитие} in vivo.

Существует несколько доступных методов и материалов для культивирования клеток в 3D-условиях. Основными методами, используемыми в настоящее время для создания 3D-культур, являются: 1) висячие капли; 2) вращающиеся клеточные культуры и пластики с низкой адгезией; 3) пирамидальные плиты, содержащие конические колодцы; 4) макропористые каркасы; 5) магнитные бусины; и 6) гидрогели без скаффолда.

Висячие капли — это метод, используемый для получения 3D-культур без каркасов. Этот метод имеет определенные ограничения, в том числе необходимость обширной обработки, низкую эффективность производства, сферическую геометрию и воздействие высоких сил сдвига. Кроме того, специфические процедуры, такие как замена среды или добавление компаунда, могут быть сложными и могут привести к потерям материала. Кроме того, в литературных источниках указано, что некоторые клеточные линии не могут продуцировать плотно упакованные сфероиды при использовании^{этого подхода6}.

Вращающиеся клеточные культуры и пластики с низким уровнем прикрепления используются для предотвращения прикрепления клеток к субстрату, в результате чего они агрегируются и образуют сфероиды. Этот процесс требует специальных колб и/или перемешивания/вращения. Хотя это один из самых простых подходов к крупномасштабному производству сфероидов или органоидов, он не лишен недостатков, таких как потребность в специальном оборудовании, низкая продолжительность жизни культур, изменение размеров сфероидов, механические повреждения клеток и^{низкая эффективность.}

Пирамидальные пластины, содержащие конические колодцы, являются коммерчески доступными пластинами, влияющими на стоимость, в дополнение к тому факту, что некоторые манипуляции могут препятствовать образованию сфероидов/органоидов⁷.

Макропористые каркасы также используются для 3D-культивирования; Однако основное препятствие заключается в достижении эффективного посева клеток и равномерного распределения. Эта проблема возникает из-за того, что размеры пор могут быть либо слишком малы для проникновения в клетки, либо слишком велики для надежного удержания клеток. Для решения этой проблемы было^{изучено несколько} стратегий8, которые напрямую влияют на сложность и стоимость этого метода.

Методология магнитных шариков генерирует небольшое количество сфероидов/органоидов, имеет высокую стоимость и может оставлять остатки наночастиц внутри клеток⁹.

Среди систем для культивирования сфероидов доступны неадгезивные агарозные гидрогели, представляющие собой гидрогель без скаффолда. Этот подход дает заметные преимущества, такие как точный контроль над размерами 3D-структур и возможность создания значительного количества этих структур на пластине. При этом методе клетки вводятся в гидрогель с предварительно сформированными лунками, в которых они погружаются и самособираются в 3D сфероиды¹⁰.

В этом исследовании мы представляем устройство и методологию для создания агарозных микролунок с использованием микрошаблонной формы простым, эффективным, воспроизводимым и недорогим способом.

Использование этого штампа в качестве пресс-формы для создания микролунок в агарозе, с помощью силы тяжести, направлено на улучшение взаимодействия клеток внутри микролунки и клеточной организации, создание 3D-структур (сфероидов/органоидов) in vitro простым, эффективным, воспроизводимым и недорогим способом, тем самым экономя время исследований и лабораторные ресурсы.

Protocol

Этот протокол соответствует рекомендациям Комитета по этике исследований человека нашего учреждения CEUA-FMUSP: 1699/2021, утвержденному 8 сентября 2021 года - «Выделение и инкапсуляция островков поджелудочной железы свиней» и является частью тематического проекта нашей группы клеточной и молекулярной терапии NUCEL (www.usp.br/nucel), грант FAPESP No 2016/05311-2 под названием: «Регенеративная медицина, направленная на терапию хронических дегенеративных заболеваний (рака и диабета)».

1. Изготовление штемпельного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта марка изготовлена по индивидуальному заказу группой NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Штемпельное устройство было разработано с использованием программного обеспечения, широко известного своей точностью и передовыми возможностями трехмерного моделирования.

1. Убедитесь, что спроектированные прототипы имеют 663 микроконтакта, расположенных таким образом, чтобы можно было генерировать эквивалентное количество трехмерных культур, таких как сфероиды или органоиды. Чтобы обеспечить устойчивость штампа на поверхностях лотка T6, стратегически расположите пять опорных точек по окружности устройства.
2. Убедитесь, что микроконтакты имеют коническую конструкцию с регулируемыми размерами, варьирующимися от 1 до 3 мм в длину. Диаметр основания конуса варьируется от 0,7 до 1,5 мм, а угол конуса колеблется от 5° до 10°.
3. Убедитесь, что «стоповая» структура устройства, определяющая глубину микроконтактов, имеет регулируемую длину от 10 до 19 мм и диаметр от 20 до 40 мм, при этом микроконтакты равномерно распределены по его поверхности.
4. Кроме того, спроектируйте устройство так, чтобы оно имело эргономичную ручку, подходящую для работы одной рукой, чтобы повысить практичность и точность во время использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения крупномасштабного производства устройства предоставляется цифровой файл в формате .stl, который необходим для процесса 3D-печати.
5. Просто нарежьте его с помощью соответствующего программного обеспечения и распечатайте на совместимом 3D-принтере. Используйте следующие печатные размеры: Х - 68 мм; Y - 120 мм; Z - 150 мм, обеспечивая идеальный баланс между функциональностью и качеством конструкции.
6. Для изготовления устройства используйте фотоотверждаемый 3D-принтер, совместимый с УФ-отверждаемой полимерной смолой, которая должна иметь высокое разрешение и однородную поверхность поверхности, необходимые для оптимальной работы устройства.
7. Нарежьте цифровую модель для печати с помощью программного обеспечения, совместимого с выбранным 3D-принтером.

2. Подготовка агарозных микролунок

1. Приготовьте раствор агарозы.
   1. Взвесьте чистый порошок агарозы и растворите его в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) до достижения конечной концентрации 1-2% (w/v).
   2. Нагрейте раствор в микроволновой печи или на водяной бане до полного растворения, убедившись, что он однородный и прозрачный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перегрева или чрезмерного повторного нагрева, так как это может привести к ухудшению качества агарозы. Не стоит готовить большие объемы исходного раствора.
   3. Дайте раствору остыть до ~40 °C, идеальной температуры для пипетирования.
2. Подготовьте штамп на заказ.
   1. Промойте штамп губкой с мягкой щетиной и дистиллированной водой, чтобы удалить остатки.
   2. Подвергните очищенный штамп воздействию ультрафиолетового излучения на 5-10 минут, чтобы обеспечить стерильность.
3. Сформируйте микролунки.
   1. Налейте ~3 мл 40 °C агарозного раствора в каждую лунку 6-луночного планшета, обеспечивая равномерную глубину 2-3 мм.
   2. Поместите изготовленный на заказ штамп в центр лунки, пока агароза еще теплая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамп имеет боковые опоры, которые обеспечивают выравнивание и устойчивость, устраняя необходимость в ручной поддержке. Каждый штамп создает ~663 микролунки (~2 мм в высоту) на лунку. Убедитесь, что на микроконтактах нет пузырей; Если образовались пузыри, аккуратно переместите штамп, чтобы устранить их.
   3. Дайте агарозе застыть в течение 5-10 минут при комнатной температуре, не перемещая пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожьте агарозу во время застывания, чтобы избежать изменений в структуре микролунок.
   4. Удалите штамп легкими движениями вперед-назад, чтобы выпустить вакуум, не повреждая микролунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот механизм облегчает поступление воздуха, обеспечивая плавное удаление штампа без деформации геля. Микролунки должны оставаться неповрежденными.
   5. Промойте микролунки 3 раза раствором PBS для удаления остатков.
   6. Подвергните пластину воздействию ультрафиолетового излучения в течение 10 минут, чтобы устранить микробное загрязнение.
   7. Добавьте 3 мл питательной среды и инкубируйте планшет в инкубаторе с_CO2 при температуре 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инкубация проверяет отсутствие загрязнения перед посевом клеток.

3. Посев клеток в микролунки

1. Приготовьте клеточную суспензию.
   1. Соберите клетки с помощью трипсинизации или другого метода диссоциации для получения однородной суспензии.
   2. Подсчитайте ячейки и отрегулируйте концентрацию в соответствии с желаемым числом на микролунку.
      Примечание: Для посева 5000 клеток на микролунку в 663 микролунки приготовьте суспензию, содержащую не менее 3,315 × 10⁶ клеток. Оптимизируйте концентрацию клеток для предотвращения центрального некроза и обеспечения адекватной диффузии питательных веществ и кислорода.
2. Засейте клетки.
   1. Пипеткой нанесите ~3 мл приготовленной клеточной суспензии на микролунки, обеспечивая равномерное распределение, аккуратно вращая планшет.
   2. Дайте клеткам осесть под действием силы тяжести (~10-15 минут) или выполните щадящее центрифугирование при 100 × г в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование может быть использовано для обеспечения концентрации ячеек в микролунках.
   3. Перенесите планшет в инкубатор с_CO2 при температуре 37 °C с увлажненной атмосферой.

4. Уход за 3D культурами клеток

1. Замените питательную среду.
   1. Меняйте среду каждые 2-3 дня, удаляя 50% старой среды и добавляя свежую среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что микролунки остаются погруженными в воду в течение всего периода культивирования, чтобы предотвратить обезвоживание.
2. Следите за формированием 3D культур.
   1. Продолжайте культивирование до тех пор, пока 3D-структуры полностью не сформируются и не уплотнятся (например, 2-3 дня для первичных культур островков поджелудочной железы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культур, требующих более длительного времени формирования, проводите частичную смену среды каждые 2-3 дня.

5. Сбор и определение характеристик 3D конструкций

1. Соберите сфероиды/органоиды.
   1. Удалите старую среду и соберите 3D-структуры с помощью энергичного пипетирования с помощью наконечника пипетки большого диаметра или отрезанного наконечника для предотвращения сжатия или разукрупнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо контролировать энергичное пипетирование, чтобы вытеснить агрегаты без их деформации.
2. Подготовьтесь к анализу.
   1. Используйте собранные сфероиды/органоиды сразу или зафиксируйте их для будущего анализа.
      Примечание: Ассоциация и стабильность сфероидов зависят от типа клеток, времени формирования и условий культивирования. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать диссоциации.

Results

Клеточная культура, использованная в этом исследовании, была получена из островков поджелудочной железы свиней. Островковый препарат, использованный в этом исследовании, имел чистоту 80 ± 5% на основе окрашивания дитизоном и жизнеспособность островковых клеток >80% на основе обнаружения флуоресцеина диацетата в живых клетках или йодида пропидиума в мертвых клетках (флуоресцентный метод «живые/мертвые»). Убедитесь, что препарат островков поджелудочной железы свиней имеет чистоту не менее 80% (например, путем окрашивани...

Discussion

Несмотря на то, что в литературе существуют различные протоколы 3D-культивирования, в исследовании, проведенном Wassmer et ^al.13 , было проверено несколько методологий создания 3D-структур с использованием островков поджелудочной железы. Авторы отметили, что нативные островки и самоагрегирующиеся сфероиды демонстрируют значительную гетерогенность по размеру и форме и являются крупнее, чем те, которые были получены другими методами. Основываясь на своих выводах, он...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31л СВЧ	Electrolux	78965840 6699 9	Оборудование, используемое для нагрева агарозного раствора, облегчающее его растворение и обеспечивающее большую однородность. Это позволяет раствору достичь идеального жидкого состояния для формирования скважин.
3DFila Gray Opaque Светочувствительный 3D Resin			УФ-отверждаемая полимерная смола
3D принтер - Creality Halot One	Creality	N/A	3D-принтер, используемый для печати устройства
печати Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	Чтобы сформировать гель, растворите от 1 до 2% в буфере солевого фосфата (PBS) или соответствующей среде.
Autodesk Fusion 360			3D моделирование
BB15 CO2 Инкубатор	Thermo Fisher	51023121	Оборудование, используемое для инкубации культивируемых клеток в подходящей и контролируемой среде.
Chitubox Chitubox		N/A Программное	обеспечение, используемое для нарезки детали для печати
Класс II Шкаф биологической безопасности	Grupo VECO	N/A	Обеспечивает стерильную среду для проведения культивирования клеток в соответствии с установленными параметрами и протоколами.
Питательная среда	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	Содержит добавки для правильного культивирования клеток.
Культуральные планшеты (P6)	SARSTEDT	1023221	Используются для придания формы агарозе и культивирования клеток.
Колба Эрленмейера (25 мл)Laborglas		91 216 14	Контейнер для растворения 1– 2% агарозы в фосфатно-солевом буфере (PBS) или другой подходящей среде, обычно нагретой в микроволновой печи.
Falcon 15 мл Полистирольная центрифужная трубка	Corning	352099	Используется для удержания клеток во взвешенном состоянии и выполнения возможных разведений.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Добавка для питательных сред.
PBS раствор (солевой фосфатный буфер)	Lab сделал	N/A	, разбавленный 1x сверхчистой водой MiliQ. Используется для растворения агарозы от 1 до 2% и для промывки уже произведенных лунок.
Флакон с реактивом с синей крышкой - Schott	Laborglas	21801545	Используется для приготовления и хранения питательной среды.
Stamp device	NUCEL Group	N/A	Link - Эта ссылка предоставляет доступ к файлу .stl устройства для печати штампов. Просто нарежьте его с помощью соответствующего программного обеспечения и распечатайте на совместимом 3D-принтере. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK<чел/> EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
Колба для обработанных культур с фильтром 25 см²	Corning	430639	используется для культивирования и поддержания адгезивных клеток.
Трипсин	Merck	07-07-9002	Для диссоциации клеток перед посевом.
Ультрафиолетовое излучение (УФ)	Н/Д	Н/Д	Используется для стерилизации штампа и пластин.