Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Половые скрещивания с мукоромицетом Phycomyces blakesleeanus

839 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67790

⸱

6 июня 2025 г.

 , 
1Organismal Biology and Ecology Department, Colorado College

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем основной протокол индукции спаривания P. blakesleeanus .

Аннотация

Phycomyces blakesleeanus, нитчатый гриб из семейства Mucoromycota, отличается своей замечательной способностью к восприятию окружающей среды и адаптивным реакциям. Хотя прошлые работы показали, что стимулы окружающей среды, включая гравитацию, свет, влагу и доступность питательных веществ, влияют на динамику его роста и репродуктивные стратегии, лежащие в его основе механизмы остаются в центре внимания. Сигналы окружающей среды запускают половое или бесполое размножение. Половое размножение начинается с передачи феромонных сигналов, которые запускают гифальную хемоаттракцию, что в конечном итоге приводит к серийным морфологическим переходам, кульминацией которых является образование зигосспоры.

В лабораторных условиях скрещивание P. blakesleeanus приводит к комплементарному мицелию, проходящему половой цикл на разных стадиях. Наша работа направлена на то, чтобы проверить, могут ли сигналы окружающей среды вызвать спаривание в мицелии P. blakesleeanus. Скрещивания P. blakesleeanu, выращенные на средах с ограничением питательных веществ, будут подвергаться воздействию агара с ограниченным содержанием питательных веществ, чтобы вызвать сексуальную реакцию в соответствии с депривацией питательных веществ. Успешное инициирование спаривания у P. blakesleeanus облегчит будущие исследования, требующие большого количества мицелия, воспроизводящего половым путем на определенных стадиях. Результаты этого исследования еще больше углубят наше понимание того, как факторы окружающей среды влияют на репродуктивные механизмы P. blakesleeanus , что внесет свой вклад в более широкую базу знаний о половом размножении нитчатых грибов.

Введение

Индукция спаривания в грибковых системах в лабораторных условиях продвинула понимание эукариотической генетики, клеточной биологии, эволюционной биологии и биотехнологии. Дикарийские грибы, в частности Ascomycota, обладают наиболее обширными знаниями об индукции спаривания в лабораторных условиях1. Интересно, что первый гриб, у которого было предложено половое размножение, Syzygites megalocarpus, не является членом Ascomycota, а скорее членом типа Mucoromycota2. Тип Mucoromycota является раннедивергирующей группой, ранее классифицированной как "Zygomycota", но теперь считающейся сестринской линией Дикарья 3,4. Mucoromycota, наряду с Zoopagomycota, являются эволюционно значимыми, так как эти типы представляют собой переход грибов к наземным экосистемам 4,5. Как и другие грибы, мукоромицеты используют бесполые и половые репродуктивные стратегии в ответ на окружающую среду 3,6. В условиях ограниченного количества питательных веществ мукоромицеты начинают половой цикл6. Мукоровицеты демонстрируют как гомоталльные, так и гетероталлические механизмы спаривания, где совместимость определяется генами типа спаривания sexM и sexP, обозначенными как (-) и (+) соответственно 7,8,9.

Блейксли10 подчеркнул чувствительность полового цикла мукоровицетов к внешним условиям, отметив, что влажность имеет решающее значение для их формирования и что доступность питательных веществ в субстрате играет значительную роль. Комплементарные типы спаривания начинают половой цикл путем кооперативного синтеза триспоровых кислот (ТА) с использованием бета-каротина в качестве предшественника 11,12,13. После обнаружения ТА реагирующие вегетативные гифы утолщаются и становятся сильно разветвленными зигофорами 14,15,16. Зигофоры продолжают продукцию TA и взаимно хемоаттрактируются. У P. blakesleeanus зигофоры дифференцируются в пределах субстрата и не видны на твердых агаровых средах17. При контакте зигофоры переплетаются и становятся воздушными зигофорами.

По мере продолжения полового цикла кончики зигофоров прикрепляются, а середина клеток выталкивается, образуя кольцеобразную структуру с коралловидным набуханием у основания, завершая переход к прогаметангиуму. Кончики клеток, образующих прогаметангий, начинают сливаться и развиваться в гаметангий. На стадии гаметангии зигофоры демонстрируют колючий орнамент. Клеточная стенка на концах растворяется, и появляются придаточные перегородки, ограничивающие область, где будет формироваться зигоспора, а зигофоры действуют как щипцеобразные суспензоры18. Зигосспора становится пигментированной по мере того, как ее клеточная стенка утолщается, и она приобретает дополнительный шипообразный орнамент17,18. После формирования зигосспора вступает в период покоя, прежде чем возобновить цикл роста.

Phycomyces blakesleeanus — гетероталлический мукоровицет, отличающийся крупными клетками и экологически чувствительными спорангиофорами 6,8,18. Этот организм легко культивируется в лаборатории, и участки полового цикла, приводящие к образованию зигоспор, можно наблюдать в течение 8-10 дней. В качестве модели P. blakesleeanus был исследован на предмет его способности воспринимать свет в окружающей среде17,19. Легкость выращивания и способность вызывать спаривание также сделали его идеальной моделью для изучения механизма, лежащего в основе его способности восприниматьсвет. Эти результаты также высветили эволюционное сохранение светочувствительных механизмов у грибов. Было показано, что у P. blakesleeanus свет подавляет половое размножение через эти консервативные светочувствительные белки21. Недавние исследования эволюционного развития были направлены на то, чтобы понять, какие гены способствуют дифференцировке клеток во время полового цикла P. blakesleeanus 6. Корреляция морфогенеза с конкретными генами потребовала бы выделения достаточного количества тканей из одних и тех же типов клеток для проведения исследований экспрессии генов.

В то время как протоколы индуцирования спаривания P. blakesleeanus в лабораторных условиях были описаны ранее, в некоторых из них упоминается только тип используемой среды исоответствующие штаммы. Некоторые описания протоколов не включают конкретную формулировку среды, но описывают, где расположить предполагаемые комплементарные типы сопряжения на пластине10. Более поздние протоколы позволяют увеличить производство зигоспор либо путем смешивания спор каждого типа спаривания и инокуляции смешанной споровой суспензией21, либо путем размещения типов спаривания на некотором расстоянии друг от друга и предоставления культуре возможности инкубации в течение 20 дней22. Эти подходы полезны для получения достаточного количества дифференцированных клеток, в частности, зигоспор, но могут не подходить для наблюдения за ходом развития или отбора половых структур, которые формируются до зигоспор для транскриптомики одиночных клеток. В других работах этот вопрос решался путем размещения комплементарных типов спаривания на расстоянии друг от друга на твердых средах, чтобы можно было наблюдать за последовательными морфологическими переходами в начале полового цикла 6,22,23. Как и в случае с другими грибами, мицелий P. blakesleeanus расширяется радиальнов 24,25 раза. Поэтому, когда на одной и той же пластине выращиваются комплементарные типы, разные части их мицелия будут соприкасаться в разное время. Поскольку контакт между мицелиями является одним из первых этапов полового цикла P. blakesleeanus, это означает, что разные части взаимодействующего мицелия будут находиться на разных стадиях полового цикла. Эта асинхронность может повлиять на результаты исследования экспрессии генов, так что если дифференцированные типы клеток смешиваются и если они имеют различные программы экспрессии генов, то будет трудно приписать роль гена одной конкретной структуре.

В дополнение к ценности P. blakesleeanus в качестве модели для изучения генов, участвующих в морфогенезе во время полового цикла, его энергичный рост и способность к дифференцировке в течение нескольких дней делают его идеальным грибом для обучения студентов, заинтересованных в ранней дивергации нитчатых грибов, и для использования в аудиториях бакалавриата для изучения разнообразия грибов и процессов их развития. Представленный здесь протокол использует три концентрации двух различных типов сред для демонстрации влияния доступности питательных веществ на внешний вид мицелия, индукцию спаривания и обогащение определенными половыми структурами либо для количественной оценки, либо для наблюдения, либо для потенциальной транскриптомики одиночных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка СМИ

  1. Суспензируйте порошковый агар из кукурузной муки (CMA) или картофельный декстроза-агар (PDA) в деионизированной воде. Для получения 100% CMA или PDA следуйте инструкциям производителя и суспендируйте 17 г CMA в 1 л деионизированной воды или 39 г PDA в 1 л деионизированной воды. Для N% CMA или PDA суспендируйте 1/N от рекомендованного производителем количества и добавьте дополнительный агар для достижения концентрации агара 7,5% (w/v).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательный шаг: Перед автоклавированием добавьте 25 мкг/мл хлорамфеникола, если есть опасения по поводу бактериального загрязнения.
  2. Стерилизовать среду в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 минут.
  3. Охладите среду до ~60 °C, поместив ее на 30 минут на водяную баню, установленную на 60 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если теплую бутылку со средой можно держать в течение 6 секунд практически без дискомфорта, то она готова к наливанию.
  4. В асептических условиях разливайте пластины в колпак с ламинарным потоком или шкаф биологической безопасности. Наклоните бутылку со средой над открытой пустой чашкой Петри и налейте ровно столько, чтобы полностью покрыть дно.
    1. В качестве альтернативы используйте стеклянную серологическую пипетку и внесите 20 мл среды в каждую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход увеличивает время, в течение которого бутылка со средой находится при более низкой температуре, и повышает риск преждевременного затвердевания агара.
  5. Дайте носителю снова затвердеть. Храните пластины при температуре 4 °C, если не используете сразу.

2. Подготовка грибковых спор или тканей

  1. Получите культуры каждого типа спаривания P. blakesleeanus (например, NRRL 1555 (-), NRRL 1554 (+), NRRL 1464 (-) и NRRL 1465 (+)). Чтобы инокулировать скрещивания спорами, сначала выращивают каждый тип спаривания в чистой культуре на 100% ХМА или КПК
  2. Вырежьте часть мицелия по переднему краю из существующих культур и поместите вырезанный мицелий на пластину со 100% CMA/PDA. Инкубировать чистые культуры в течение 1 недели при температуре 27 °C при 12-часовом световом цикле.
  3. Как только спорангиофоры присутствуют, залейте спорулирующую чистую культуру 0,01% Tween 20 в стерилизованную деионизированную воду, используя асептический метод. С помощью микропипетки P1000 наберите 1,0 мл смеси спор Tween 20 из планшета в пробирку для микроцентрифуги.
  4. Центрифугируйте в мини-центрифуге в течение 30 с, затем сцедите надосадочную жидкость.
    1. Если требуется больше спор, продолжайте добавлять 1,0 мл смеси спор Tween 20 в ту же микроцентрифужную пробирку и повторите шаг 2.4. После получения подходящего количества спор сцедите надосадочную жидкость и замените ее 500 мкл стерильной деионизированной воды.
    2. Дополнительно: Используйте гемацитометр для оценки концентрации спор, который сообщит, нужно ли добавить больше воды или повторно центрифугировать споры.
  5. В качестве альтернативы можно инокулировать скрещивания передовым мицелием из чистых культур.
    1. Используйте стерилизованное бритвенное лезвие или сверло для пробковых отверстий, чтобы вырезать ткань и немедленно ввести инокулянт.
  6. Настройте кресты как 2-ходовые кресты, 4-сторонние кресты или 8-сторонние кресты (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для транскриптомной работы настраиваются кроссы, рекомендуется установить 1-2 дополнительные пластины для каждого состояния/среды, которые будут служить индикаторными пластинами. Индикаторные пластины позволяют исследователям ограничивать воздействие света на экспериментальные пластины, поскольку свет подавляет половое размножение P. blakesleeanus.
    1. Для двустороннего скрещивания поместите дополнительные типы спаривания друг напротив друга (рисунок 1A).
      1. Поместите мицелий (-) типа спаривания, NRRL 1555 или NRRL 1464, на расстоянии не менее 1 см от края чашки Петри на PDA или CMA.
      2. На той же пластине, напротив того места, где был размещен тип сопряжения (-), и на расстоянии 1 см от края чашки Петри, поместите тип сопряжения (+), NRRL 1554 или NRRL1465 (рис. 1A).
        Примечание: Расстояние между комплементарными типами спаривания будет влиять на размер ткани, участвующей в половом цикле. Типы спаривания, расположенные дальше друг от друга, позволяют мицелию расширяться больше, что увеличит количество сексуальных взаимодействий между двумя партнерами.
    2. Для 4-стороннего скрещивания разместите похожие типы спаривания друг напротив друга, но рядом с комплементарным типом спаривания (Рисунок 1B).
      1. Поместите споры или мицелий (-) типов спаривания, NRRL 1555 и NRRL 1464, друг напротив друга на расстоянии не менее 1 см от края чашки Петри на КПК или ХМА.
      2. На той же пластине выберите место между двумя (-) типами сопряжения и на расстоянии не менее 1 см от края пластины и инокулируйте участок спорами или мицелием типа (+), NRRL 1554 или 1465.
      3. На той же пластине, напротив того места, где был привит первый (+) тип сопряжения, и на расстоянии не менее 1 см от пластины, поместите другой (+) тип сопряжения.
    3. Для 8-стороннего скрещивания чередуйте типы спаривания вдоль периферии чашки Петри, по четыре типа спаривания каждого типа (рис. 1C).
  7. После инокуляции запечатайте планшеты парапленкой или (оставьте их незакрытыми) и поместите их во вторичный контейнер перед инкубацией при температуре 22 °C в темноте. Ежедневно наблюдайте за пластинами на предмет признаков спаривания, в течение которого делайте фотографии из-под пластины и отслеживайте мицелий по мере роста культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 24 часа после прививки ожидайте распространения мицелия на все типы сред, но люди вряд ли будут контактировать на этом этапе.
  8. В зависимости от типа среды (PDA или CMA) и рецептуры (25%, 50%, 100%), если мицелий начинает контактировать, осмотрите мицелии комплементарных типов спаривания, которые находятся в контакте под препарирующим эндоскопом для доказательства спаривания. Сделайте фотографии взаимодействующего мицелия с помощью камеры или смартфона, установленных на препарирующем эндоскопе.
    1. Получите изображения мицелия и сшейте их вместе (например, с помощью приложения Panorama Stitcher). Используйте ImageJ для оценки площади мицелия (см. онлайн-уроки).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 4-стороннего скрещивания скорость роста каждого штамма незначительно варьировалась, что определялось изменением площади мицелия (Рисунок 2). Несмотря на то, что NRRL 1555 не является статистически значимым, он имел более быстрое изменение площади при нанесении покрытия на 25% CMA, 25% PDA или 100% PDA. Аналогичным образом, NRRL 1465 имел более высокое изменение площади при выращивании на 50% PDA или CMA. NRRL 1464 показал самый быстрый прирост площади при выращивании на 100% CMA. Через...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь представлен простой протокол индуцирования полового размножения у P. blakesleeanus в лабораторных условиях. Одним из наиболее важных соображений для этого протокола является ограничение питательных веществ. Предполагается, что грибы кооптировали половое размножение в ответ на суровые условия окружающей среды, такие как ограничение питательных веществ 6,28,29,30,31,32.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Исполнительный комитет по естественным наукам Колорадского колледжа, факультет биологии и экологии организмов и Фонд студенческих исследований семьи Хеви за финансирование этой работы. Мы также выражаем благодарность Элис Келлер и Тиа Хатченс за их техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Порошок агараThermoFisher3453PK
хлорамфениколFisherSciBP904-100
Агар из кукурузной мукиКаролина742460
Panorama StitcherApple App Store
Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1555Министерство сельского хозяйства США - Служба сельскохозяйственных исследований1555USDA-ARS будет отправлять только академическим исследователям; см. ниже альтернативы
Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1564United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service1564USDA-ARS будет отправлять только академическим исследователям; см. ниже альтернативы
Phycomyces blakesleeanus (-) Tube CultureCarolina Biological Supply156183Культура образовательного уровня, доступная для покупки; NRRL 1555
Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1554United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service1554USDA-ARS будет отправлять только академическим исследователям; альтернативы см
. нижеPhycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1565United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service1565USDA-ARS будет отправлять только академическим исследователям; см. ниже альтернативы
Phycomyces blakesleeanus (+) Tube CultureCarolina156182Education-grade culture доступен для покупки; NRRL 1554
Картофельная декстроза агарFisherSciDF0013-17-6
Sprout Plus Мини центрифугаHeathrow ScientificАртикул 120610
Твин 20Sigma-AldrichP6585-10ML

Ссылки

  1. NaranjoOrtiz, M. A., Gabaldón, T. Fungal evolution: diversity, taxonomy and phylogeny of the fungi. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2101-2137 (2019).
  2. Idnurm, A. Sex determination in the firstdescribed sexual fungus. Eukaryot Cell. 10 (11), 1485-1491 (2011).
  3. Spatafora, J. W., et al. A phylumlevel phylogenetic classification of zygomycete fungi based on genomescale data. Mycologia. 108 (5), 1028-1046 (2016).
  4. Wang, Y., et al. Divergent evolution of early terrestrial fungi reveals the evolution of mucormycosis pathogenicity factors. Genome Biol Evol. 15 (4), evad046(2023).
  5. Gryganskyi, A. P., et al. Sequencing the genomes of the first terrestrial fungal lineages: what have we learned. Microorganisms. 11 (7), 1830(2023).
  6. Peña, J. F. The evolutionary developmental biology of Mucoromycotina [Doctoral dissertation]. , University of California, Riverside. (2022).
  7. Wetzel, J., Burmester, A., Kolbe, M., Wöstemeyer, J. The matingrelated loci sexM and sexP of the zygomycetous fungus Mucor mucedo and their transcriptional regulation by trisporoid pheromones. Microbiology (Reading). 158 (Pt 4), 1016-1021 (2012).
  8. Camino, L. P., Idnurm, A., CerdáOlmedo, E. Diversity, ecology, and evolution in Phycomyces. Fungal Biol. 119 (11), 1007-1021 (2015).
  9. Gryganskyi, A. P., et al. Structure, function, and phylogeny of the mating locus in the Rhizopus oryzae complex. PLoS One. 5 (12), e15273(2010).
  10. Blakeslee, A. F. Sexual reproduction in the Mucorineae. Proc Am Acad Arts Sci. 40, 205-319 (1904).
  11. Sutter, R. P., Grandin, A. B., Dye, B. D., Moore, W. R. (-) mating typespecific mutants of Phycomyces defective in sex pheromone biosynthesis. Fungal Genet Biol. 20 (4), 268-279 (1996).
  12. Sahadevan, Y., RichterFecken, M., Kaerger, K., Voigt, K., Boland, W. Early and late trisporoids differentially regulate βcarotene production and gene transcript levels in the mucoralean fungi Blakeslea trispora and Mucor mucedo. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7466-7475 (2013).
  13. Gooday, G. W., Carlile, M. J. The discovery of fungal sex hormones: III. Trisporic acid and its precursors. Mycologist. 11 (3), 126-130 (1997).
  14. Banbury, G. H. Processes controlling zygophore formation and zygotropism in Mucor mucedo Brefeld. Nature. 173, 499-500 (1954).
  15. Sutter, R. P., Whitaker, J. P. Zygophorestimulating precursors (pheromones) of trisporic acids active in (-)Phycomyces blakesleeanus. Acidcatalyzed anhydro derivatives of methyl 4dihydrotrisporateC and 4dihydrotrisporateC. J Biol Chem. 256 (5), 2334-2341 (1981).
  16. Gooday, G. W. Functions of trisporic acid. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 284, 509-520 (1978).
  17. Bergman, K., et al. Phycomyces. Bacteriol Rev. 33 (1), 99-157 (1969).
  18. O'Donnell, K. L., Hooper, G. R., Fields, W. G. Zygosporogenesis in Phycomyces blakesleeanus. Can J Bot. 54, 2573-2586 (1976).
  19. Delbrück, M., Reichardt, W. I. System analysis for the light growth reactions of Phycomyces. Cellular Mechanics in Differentiation and Growth. Rudnick, D. , Princeton University Press. 3-44 (1957).
  20. Idnurm, A., et al. The Phycomyces madA gene encodes a bluelight photoreceptor for phototropism and other light responses. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4546-4551 (2006).
  21. Shakya, V. P. S., Idnurm, A. The inhibition of mating in Phycomyces blakesleeanus by light is dependent on the MadAMadB complex that acts in a sexspecific manner. Fungal Genet Biol. 101, 20-30 (2017).
  22. Yamazaki, Y., Miyazaki, A., Kataoka, H., Ootaki, T. Effects of chemical components and nitrogen sources on zygospore development in Phycomyces blakesleeanus. Mycoscience. 42 (1), 11-17 (2001).
  23. Idnurm, A., Walton, F. J., Floyd, A., Heitman, J. Identification of the sex genes in an early diverged fungus. Nature. 451 (7175), 193-196 (2008).
  24. Agrios, G. N. Plant pathogens and disease: general introduction. Encyclopedia of Microbiology. Schaecter, M. , Elsevier. 613-646 (2009).
  25. Valle, M., et al. Impact of water activity on the radial growth of fungi in a dairy environment. Food Res Int. 157, 111247(2022).
  26. Heo, Y. M., et al. Investigation of filamentous fungi producing safe, functional watersoluble pigments. Mycobiology. 46 (3), 269-277 (2018).
  27. Wickham, H. ggplot2 elegant graphics for data analysis. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2016).
  28. Lubkowitz, M. A., et al. Schizosaccharomyces pombe isp4 encodes a transporter representing a novel family of oligopeptide transporters. Mol Microbiol. 28 (4), 729-741 (1998).
  29. Nelson, M. A., Metzenberg, R. L. Sexual development genes of Neurospora crassa. Genetics. 132 (1), 149-162 (1992).
  30. Sato, S., Suzuki, H., Widyastuti, U., Hotta, Y., Tabata, S. Identification and characterization of genes induced during sexual differentiation in Schizosaccharomyces pombe. Curr Genet. 26 (1), 31-37 (1994).
  31. Grishkan, I., Korol, A. B., Nevo, E., Wasser, S. P. Ecological stress and sex evolution in soil microfungi. Proc Biol Sci. 270 (1510), 13-18 (2003).
  32. Bernstein, H., Byers, G. S., Michod, R. E. Evolution of sexual reproduction: importance of DNA repair, complementation, and variation. Am Nat. 117 (4), 537-549 (1981).
  33. Heitman, J., et al. The fungal kingdom. , ASM Press. (2017).
  34. Heitman, J., et al. Sex in fungi molecular determination and evolutionary implications. , ASM Press. (2007).
  35. Wang, Z., LópezGiráldez, F., Wang, J., Trail, F., Townsend, J. P. Integrative activity of mating loci, environmentally responsive genes, and secondary metabolism pathways during sexual development of Chaetomium globosum. mBio. 10, (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нитевидные грибыполовое размножениетип спариванияобразование зигоспорысреды с ограниченным содержанием питательных веществхемоаттракция гифкартофельно-декстрозный агарэкспрессия генов
Половые скрещивания с мукоромицетом Phycomyces blakesleeanus
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.