В этом исследовании представлен упрощенный протокол обработки тканей, включающий обезглавливание, фиксацию, криосекцию, флуоресцентное окрашивание, иммуноокрашивание и визуализацию, который может быть расширен до конфокальной и многофотонной визуализации. Метод сохраняет эффективность, сравнимую со сложными вскрытиями, минуя необходимость в продвинутых моторных навыках. Количественный анализ изображений обеспечивает широкие исследовательские возможности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прямая криосекция голов дрозофил для усиленного флуоресцентного окрашивания мозга и иммуноокрашивания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммуноокрашивание мозга Drosophila melanogaster имеет важное значение для изучения механизмов, лежащих в основе сложного поведения, нейронных цепей и паттернов экспрессии белков. Традиционные методы часто сопряжены с такими проблемами, как выполнение сложной диссекции, поддержание целостности тканей и визуализация конкретных паттернов экспрессии во время визуализации с высоким разрешением. Мы представляем оптимизированный протокол, который сочетает в себе криосекцию с флуоресцентным окрашиванием и иммуноокрашиванием. Этот метод улучшает сохранность тканей и четкость сигнала, а также снижает потребность в трудоемком вскрытии для визуализации мозга дрозофилы. Метод включает в себя быструю диссекцию, оптимальную фиксацию, криопротекцию и криосекцию с последующим флуоресцентным окрашиванием и иммуноокрашиванием. Протокол значительно снижает повреждение тканей, усиливает проникновение антител и позволяет получать четкие, четко определенные изображения. Мы демонстрируем эффективность этого подхода, визуализируя конкретные нейронные популяции и синаптические белки с высокой точностью. Этот универсальный метод позволяет анализировать различные белковые маркеры в мозге взрослого человека в нескольких z-плоскостях и может быть адаптирован для других тканей и модельных организмов. Протокол предоставляет надежный и эффективный инструмент для исследователей, проводящих высококачественную иммуногистохимию в нейробиологических исследованиях дрозофилы. Детальная визуализация этого метода способствует всестороннему анализу нейроанатомии, патологии и локализации белков, что делает его особенно ценным для исследований в области нейробиологии.
Введение
Сложное поведение, начиная от социальных взаимодействий1, сенсорного восприятия и обработкиинформации2, обучения 3 и заканчивая движением4, управляется мозгом. Неврологические расстройства также становятся все более распространенными и, по прогнозам, со временем будут увеличиваться 5,6. Крайне важно изучить, как мозг работает как в здоровом, так и в болезнетворном состоянии. Центральная догма молекулярной биологии предполагает, что одной из наиболее важных функций биологических един....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка оборудования
- Убедитесь, что криостат включен и установлен на -20 °C. Включите подогреватель слайдов или небольшой инкубатор, установив его на 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе промаркированные предметные стекла можно поместить на обогреватель или инкубатор и оставить на неопределенный срок до разделения.
2. Приготовление растворов
- Приготовьте 50 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4, из 10x запаса PBS. Приготовьте раствор 4% Параформальдегида в PBS с конечным объемом 10 мл.
- Приготовьте чистящий раствор 70% эта....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанный выше метод позволяет проводить флуоресцентную визуализацию мозга взрослых мух надежно и без утомительного вскрытия. Как показано на рисунке 1, этот метод прост и может быть выполнен быстро, если все образцы, оборудование и материалы легко доступны. В качестве альтернативы, при хранении при температуре -80 °C на стадии OCT-формы, образцы могут быть сохранены для использования в течение многих недель. Исследователям не нужно долго обучаться, чтобы изу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье мы представляем протокол для точной флуоресцентной визуализации криосекционированных голов дрозофил. Это простой подход, который имеет несколько важных положительных моментов. А именно, методы достаточно просты, чтобы их мог пройти любой, кто прошел базовую подготовку по технике безопасности в лаборатории, они могут быть адаптированы для измерения экспрессии любого белка, для которого существуют высококачественные антитела, и они позволяют точно измерить как то, с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим сотрудников лаборатории Melkani за их помощь и ценные отзывы при разработке протокола. Запасы мух, Elav-Gal4 (BL#458) и UAS-ApoE4 (BL#76607) были получены из Bloomington Drosophila Stock Center (Блумингтон, штат Индиана, США). Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) AG065992 и RF1NS133378 для G.C.M. Эту работу также поддерживают фонды UAB Startup 3123226 и 3123227 G.C.M.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Eppendorf | 1000 мкл | 3123000063 | |
| 1000 мкл | наконечники для пипеток Olympus Plastics | 23-165R | |
| 10X Фосфатный буферный раствор (PBS) | Fisher | J62036.K7 | ph=7,4 |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 64-17-5 | |
| 20X Tris Buffered | Salt Thermo Scientific | J60877.K2 | pH=7,4 |
| AF750 Козье антимышиное вторичное антитело | Alexa Fluor | A21037 | |
| Антиролл-стекло | IMEB | AR-14047742497 | |
| ApoE Мышиное первичное антитело | Santa Cruz | SC13521 | |
| бычьей сыворотки Альбумин Fisher | 9048-46-8 | ||
| Центрифужные пробирки 1,5 мл | Fisher | 05-408-129 | |
| Заряженные слайды | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Формы для криосекции | Fisher | 2363553 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Лезвия для криостата | C.L. Sturkey | DT554N50 | |
| дистиллированной водой | |||
| для сухого льда | ??? | ??? | |
| Тонкие щипцы | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fly Pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| Упрочнение монтажного материала с Dapi | Vectashield | H-1800 | |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | |
| Микроскоп | Olympus | SZ61 | |
| Nile Red | Sigma | N3013 | |
| Оптимальная температура резки Компаунд | Fisher | 4585 | |
| Орбитальный шейкер | OHAUS | SHLD0415DG | |
| параформальдегидом 20% | Электронная микроскопия науки | 15713 | |
| Лезвия бритвы | Gravey | #40475 | |
| Пружинные ножницы | Инструменты для тонкой науки | 15000-10 | |
| Сахароза | Фишер | S5-500 |
Ссылки
- Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
- Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Ne....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
