Тонкая корректировка ориентации Caenorhabditis elegans на канальных агаровых подушечках для визуализации нейрорегенерации

Нематода Caenorhabditis elegans (C. elegans) является широко используемым модельным организмом для изучения биологических процессов, таких как развитие и поведение, благодаря своей сильно консервативной генетике с аналогами млекопитающих^. Исследователи выращивают C. elegans на планшете с нематодой для роста (NGM) в строго контролируемой среде, которая стандартизирует экспериментальные условия и позволяет более точно соотносить результаты с экспериментальными переменными. Животное прозрачное, что позволяет четко визуализировать ткани, клетки и субклеточные структуры. C. elegans небольшие, взрослые животные имеют длину ~1 мм и диаметр 80 мкм, что позволяет разместить несколько животных на одном стенде для визуализации¹. Их небольшой размер также позволяет на одном изображении захватывать весь организм, разрешая при этом отдельные клетки, что имеет решающее значение для визуализации регенерации нейронных волокон. Синергетические с этими преимуществами для микроскопии, быстрое развитие, стереотипная анатомия и легкая генетика C. elegans позволяют проводить крупномасштабные исследования¹.

Типичная процедура визуализации клеток C. elegans была разработана несколько десятилетий назад и в значительной степени осталась неизменной. Исследователи используют плоские агаровые подушечки на предметных стеклах для крепления и обездвиживания животных для визуализации их клеток². Покровная крышка в верхней части подушечки удерживает животных на месте и защищает линзу микроскопа. Важно отметить, что покровное стекло имеет высокий показатель преломления, который увеличивает числовую апертуру захваченного света и улучшает разрешение изображения. Кроме того, покровное стекло снижает искажения светопропускания. Таким образом, покровное стекло улучшает визуализацию целевых клеток и структур.

Однако при использовании с покровным стеклом плоские агаровые подушечки часто ограничивают ориентацию животного. C. elegans изгибаются вдоль спинно-вентрального (DV) направления, поэтому они принимают боковую ориентацию на плоской агаровой подушечке. Тем не менее, даже после обездвиживания, выпрямления и предварительного поворота в положение DV, размещение покровного стекла возвращает почти всех животных в боковой вид (Рисунок 1). Мы считаем, что эта переориентация происходит из-за того, что покровная крышка отодвигает выступающую вульву C. elegans в сторону. Молодые животные без вульвы ориентированы более случайно. Этот ограниченный контроль над ориентацией проблематичен, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, он может не позволять разместить две структуры в одном поле зрения (например, двустороннее), что усложняет их сравнение. Во-вторых, установка ориентации важна для оптимизации качества изображения, поскольку интересующие структуры обычно лучше всего визуализируются, когда они находятся близко к объекту. Это связано с тем, что объективы получают изображение на ограниченной глубине в образце (т. е. на рабочем расстоянии), а также с тем, что свет из более глубоких мест больше рассеивается и поглощается.

Для C. elegans ограниченный контроль над ориентацией, как правило, более серьезен у пожилых животных. Животные в возрасте от L1 до L4 меньше в диаметре, что делает визуализацию большей части червя. Эти личинки также имеют меньшую пигментацию, что приводит к снижению поглощения видимого света и рассеянию фотонов, что улучшает четкость изображения и разрешение. И наоборот, взрослые животные имеют больший диаметр и большую пигментацию, что создает проблемы для визуализации в более глубоких z-плоскостях, поскольку покровное стекло влияет на первоначальную ориентацию.

В 2008 году мы внедрили стратегию с использованием агаровых прокладок с каналами для преодоления этих проблем за счет сохранения ориентации животных ^3,4. Как описано ниже, пользователи поворачивают обездвиженных животных в каналах в нужную ориентацию, отмечая анатомические ориентиры. Каналы удерживают животных в углублениях между возвышенными поверхностями агара, сводя к минимуму усилие на животное при размещении покровного стекла и исключая вращение животного. Поскольку изготовление канальных и обычных плоских контактных площадок происходит по одной и той же процедуре и требует одинакового времени, наша технология очень доступна. Многие лаборатории используют нашу методику для иммобилизации C. elegans для изучения анатомических особенностей, наблюдения за развитием и анализа вклада нейронов в поведение 5,6,7,8. В следующем разделе описывается весь процесс изготовления канального агара, начиная с виниловой пластинки, которая разрезается на четвертинки с помощью горячего ножа. Во-первых, мы опишем изготовление формы из полидиметилсилоксана (PDMS), используемой для литья канального агара. Затем мы покажем, как шаг за шагом изготовить канальный агар. Ожидается, что вся процедура займет 3 часа без специальных знаний. В соответствии с процедурой изготовления PDMS, изготовление прокладок, изготовленных с помощью пресс-формы, займет столько же времени, сколько и изготовление обычных агаровых прокладок (несколько минут).

1. Подготовка полидиметилсилоксана (PDMS) к изготовлению

1. Вылейте в одноразовую весовую чашку средство быстрого отверждения в соотношении 1:10 к основанию. Перемешивайте неотвержденную жидкость в течение 45 с, пока жидкость полностью не смешается и не заполнится пузырьками.
2. Поместите лоток в вакуумный эксикатор под наклоном. Установите давление в диапазоне от -0,09 до -0,1 кПа 3x, чтобы пузырьки воздуха вышли на поверхность.
3. Держите вакуум включенным в течение часа в диапазоне давления от -0,09 до -0,1 кПа, пока не останется несколько видимых пузырьков, которые можно удалить вручную.

2. Изготовление PDMS пресс-формы для виниловой пластинки

1. Промойте виниловую пластинку и стеклянную пластину деионизированной (DI) водой. Убедитесь в отсутствии пыли для получения наилучшей формы. Дайте виниловой пластинке высохнуть на воздухе до использования.
2. Положите лист алюминиевой фольги поверх горячей плиты, чтобы собрать излишки PDMS.
3. Поместите стеклянное стекло на каждый конец виниловой пластинки, чтобы установить толщину формы на ширину стеклянных стекол. Это обеспечивает равномерную высоту при нажатии стекла на неотвержденный PDMS.
4. Вылейте неотвержденную жидкость PDMS на одну сторону виниловой пластинки.
5. Наблюдайте за пузырьками, отражающимися от поверхности жидкости, и удаляйте их с помощью наконечника для дозатора. Наклоните стеклянную пластину и медленно опустите пластину вниз, позволяя воздуху выходить, предотвращая попадание пузырьков.
6. Отверждите PDMS при 80 °C в течение 35 минут.
7. Снимите виниловую пластинку с горячей плиты и дайте ей остыть. Осторожно снимите PDMS с виниловой пластинки, чтобы не порвать.
8. Используйте новое предметное стекло в качестве ориентира, чтобы разрезать PDMS острой бритвой, чтобы создать форму с каналами из агара.

3. Изготовление канальных агаровых прокладок с NaN₃

ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок и материалы для плоских агаровых прокладок были ранее установлены⁹. Эта процедура очень похожа.

1. Добавьте в колбу 0,6 г агара и 30^{мл жидкого} бульона NGM 9 бульона. Добавьте мешалку и нагрейте на горячей плите до 120 °C.
2. Добавьте 120 мкл материала NaN₃ (концентрация 1 М стока) после того, как гель расплавится.
3. Промойте форму PDMS водой и дайте ей высохнуть на воздухе. Поместите форму PDMS между двумя наборами пар слайдов.
4. Пипеткой агаром вверх и вниз прогрейте кончик пипетки. Нанесите 300 мкл расплавленного агара на форму PDMS, вручную распределяя агар по каналам, так как размещение предметного стекла распределит агар по каналам.
5. Поместите предметное стекло микроскопа прямо на агар, опираясь на предметные стекла по бокам. Снимите предметное стекло после того, как агар остынет.

4. Монтаж C. elegans

1. Как только предметные стекла остынут, снимите предметное стекло прямо с формы без резки.
2. Перемещение животных в каналы после того, как они будут обездвижены NaN₃
3. Поверните животных в нужное положение.
4. Положите на подушечку покровный листок. Наклоните подушку и слегка надавливайте с одной стороны на другую, чтобы вытолкнуть воздух в сторону и избежать образования пузырей.

Изготовление пресс-формы PDMS
Циклическое давление вакуума во время изготовления пресс-формы прокалывает и удаляет пузырьки воздуха из неотвержденной PDMS, обеспечивая отсутствие пузырьков в пресс-форме. Как показано на рисунке 3D , пузырьки поднимаются на поверхность и прокалываются. Формы без пузырей могут образовывать чистые каналы.

Затвердевание пресс-формы PDMS
При размещении стекла на виниловой пластинке избегайте образования воздушных зазоров. Эти зазоры могут привести к неравномерной толщине или поверхностным дефектам. Пузыри, если они присутствуют, могут быть обнаружены визуально. Нажатие на стекло с одной стороны на другую вытесняет воздух, сводя к минимуму образование пузырьков и обеспечивая равномерную толщину формы, показанную на рисунке 4A.

Использование канальных агаровых подушечек для точной ориентации C. elegans
Канальные агаровые подушечки позволяют точно ориентировать C. elegans. Мы устанавливаем ориентацию животного, слегка перекатывая животное платиновой проволокой, проверяя ориентацию с помощью ориентиров, таких как вульва или S-образный кишечник (рис. 5A, C). Мы подтверждаем ориентацию под флуоресцентным препарирующим микроскопом перед переводом животных в инвертированный микроскоп, показанный на рисунке 5B, D.

Оценка регенерации нейронных волокон с помощью канальных агаровых подушечек
Канальные агаровые подушечки улучшают качество визуализации регенерации нейронов за счет оптимальной ориентации животного. Расположение регенерированных нейронных волокон ближе к линзе объектива снижает рассеивание и поглощение света, повышая четкость изображения. Рисунки 5E, F показывают, что размещение сайта регенерации ближе к объективу улучшает качество визуализации, способствуя более точному анализу восстановления нейронов.

Рисунок 1: Caenorhabditis elegans на плоских и канальных подушечках. (А) Животное на плоской агаровой подушке в ориентации DV; Лица вульвы. (B) Введение покровного стекла отодвигает вульву в сторону, заставляя животное ориентироваться на бок. (C) Животное на канальном агаровом подушечке в ориентации DV. (D) Животное остается в ориентации DV после введения покровного стекла. (E) Светлопольное изображение роллера-мутанта на канальной агаровой прокладке в DV-ориентации. (F) Светлопольное изображение с покровным листом, то же животное, что и E , остается в ориентации DV. Сокращения: DV = дорсально-вентральный; lat = боковой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Материалы и оборудование для изготовления PDMS. (A) Комплект силиконовых эластомеров SYLCAP 284-F. (b) Масштаб. (С) Пластиковый шприц. (D) Вакуумный эксикатор. (E) Конфорка. (F) 12-дюймовая долгоиграющая виниловая пластинка, разломанная по мере необходимости. (G) Стеклопакет. Сокращение: PDMS = полидиметилсилоксан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Смешивание и вакуумирование неотвержденного PDMS. (A) Смешайте основу и отвердитель в лотке. (B) Поместите лоток в вакуумную камеру. (C) Трижды запустите цикл вакуума, чтобы пузырьки всплыли на поверхность. (D) Через час лопнуло большинство пузырей. Обратите внимание на улучшенную передачу через PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Введение стеклянного стекла в неотвержденный PDMS без пузырьков. (А) Введение стекла на виниловую пластинку без пузырей. (B) Затвердевшая пресс-форма PDMS, удаленная из пластинки, со вставными каналами для детализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Светлопольные и флуоресцентные изображения C. elegans , установленные на канальном агаре. (A) Светлопольное изображение животного в двусторонней DV-ориентации. Анатомический ориентир для ориентации DV: спиралевидная S-образная кишка (более темная ткань обозначена стрелкой), пересекающая среднюю линию ~60% расстояния от носа до хвоста. (B) Флуоресцентное изображение нейронов в ориентации DV, то же животное, что и A. (C) Светлопольное изображение животного в широтной ориентации. Анатомический ориентир для ориентации широчайших: вульва обращена боком. (D) Флуоресцентное изображение нейронов в широчайшей ориентации, то же животное, что и C. (Д) Ориентация с регенерацией (стрелкой) в более глубокую (дальнюю) сторону животного. (F) Ориентация с регенерацией у более мелкого бокового животного ближе к цели; очиститель регенерации (стрелка). Масштабные линейки = 20 μм. Сокращения: DV = дорсально-вентральный; lat = боковой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.