В этом отчете описывается метод измерения времени до нокдауна взрослой особи Drosophila melanogaster с помощью монитора активности дрозофилы (DAM2) в ответ на тепловой стрессор воздушной проводимости в камере инкубатора. DAM2 измеряет активность, записывая движения отдельных мух, когда они пересекают инфракрасный луч. Анализ данных облегчается новым исполняемым файлом, созданным авторами.
Методическая статья
Анализ термостойкости с использованием системы мониторинга активности дрозофилы : руководство по исполняемому приложению для анализа данных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение устойчивости к жаре у Drosophila melanogaster представляет особый интерес для исследователей на протяжении десятилетий, при этом общий подход к оценке устойчивости к жаре заключается в мониторинге времени до нокдауна (TKD) после воздействия повышенной температуры. Классически мух помещают в отдельные флаконы и помещают внутрь водяной бани с подогревом. Затем ТКД контролируется исследователями вручную. Несмотря на то, что эти исследования хорошо известны, остаются проблемы субъективности и последовательного применения осязаемого определения прекращения всех движений, включая мышечные спазмы, при проведении этих ручных анализов. Мы разработали высокопроизводительный метод автоматизации анализов термостойкости с использованием мониторов активности дрозофилы TriKinetics (DAM2). Для сопровождения системы DAM2 мы написали программу и создали простой в использовании исполняемый файл для автоматического считывания последнего времени движения по сгенерированным данным об активности. Затем этот скрипт записывает в файл .csv время до теплового паралича (TKD) для каждой мухи. Наши данные показывают, что этот автоматизированный метод DAM2 является последовательным и надежным. Между тем, профили активности, созданные на основе данных о количестве активности, представляют интерес. Эти профили активности могут быть составлены и имеют потенциал для расширения анализов термотолерантности, чтобы включить в них относительно неизученные поведенческие компоненты термотолерантности. В этом протоколе будет подробно описано, как пользоваться системой DAM2 и HoTDAM! программное обеспечение для оценки теплостойкости у D. melanogaster.
Введение
Эктотермы обычно реагируют на тепловой стресс повышенной локомоторной активностью. Этот феномен был очевиден исследователям на протяжении десятилетий, а характерная поведенческая реакция была описана Коулзом и Богертом в 1944году. Они описали, как организм при тепловом стрессе сначала проявляет повышенную двигательную двигатель. По мере нарастания теплового стресса короткие всплески активности перемежаются периодами бездействия. Температура, при которой организм больше не может демонстрировать скоординированное движение, является критическим тепловым максимумом (CTmax). Далее следует мышечный спам, и в конечном итоге организм разрушается 1,2. Этот коллапс трудно поддается определению, и он представляет собой нечто сродни «тепловому истощению, коме или смерти»2. Здесь мы будем использовать термин «физиологический коллапс» для теоретического обозначения этой размытой конечной точки теплового стресса.
Drosophila melanogaster и другие мелкие насекомые были ценными моделями для изучения теплового стресса. Чтобы оценить, по крайней мере, часть сложного набора признаков, составляющих устойчивость к жаре, многие исследователи вручную наблюдали за временем и температурой, при которой происходит физиологический коллапс, представляя время до нокдауна (TKD) и CTmax соответственно. Несмотря на то, что эти методы ручного анализа очень хорошо зарекомендовали себя, они имеют некоторые недостатки. Операционное определение физиологического коллапса может быть трудно установить и надлежащим образом применять ко всем случаям, особенно когда наблюдатели менее опытны. Например, в какой момент организм переходит от мышечных спазмов к коллапсу? Характер мышечных спазмов и судорожной активности до коллапса может быть непредсказуемым и может затруднить точное наблюдение 2,3, угрожая точности и аккуратности. Между тем, сложность наблюдения также ограничивает количество организмов, которые могут быть проанализированы одновременно, ограничивая масштабируемость.
Поскольку увеличение активности является последовательной реакцией на тепло, а TKD и CTmax в конечном итоге являются точкой, в которой активность прекращается, мы решили использовать мониторы активности дрозофил (DAM2) от TriKinetics для автоматизации анализов термоустойчивости. Недавно мы опубликовали метод автоматизированного анализа, а также простое в использовании программное обеспечение с использованием системы DAM24. Анализ был валидирован путем сравнения показателей термостойкости с точки зрения ТКД с классическим ручным анализом ТКД, основанным на наблюдении, по нескольким факторам. Мы также исследовали компонент локомоторной активности в анализах TKD для дальнейшей характеристики фенотипа индуцируемой термотолерантности. Мы назвали тест и сопутствующее программное обеспечение HoTDAM! (Анализ термоустойчивости с использованием системы мониторинга активности дрозофилы). Здесь мы приводим подробное описание автоматизированного метода определения термостойкости с использованием системы DAM2 и HoTDAM! программное обеспечение. Анализ прост в использовании и легко масштабируется, что позволяет измерять множество организмов одновременно.
В данной рукописи мы выполнили анализ ТКД на термосенсорных мутантных мухах (транзиторный рецепторный потенциал анкирин 1; TRPA1) и их генетический контроль (белый1118; w1118). Эти организмы были выбраны для того, чтобы подчеркнуть важность для анализа характерной повышенной активности, наблюдаемой во время теплового стресса. А именно, организмы TRPA1 не демонстрируют такого поведения побега, что иллюстрирует внутреннюю связь между консервативными поведенческими реакциями и оценками устойчивости к жаре, такими как TKD. Мы провели анализ как для женщин, так и для мужчин, а также провели предварительную термозакалку. Представленные здесь репрезентативные результаты представляют собой данные совершенно новых анализов, чем те, которые использовались в оригинальных валидационных анализах, опубликованных ранее.
Протокол
1. Разведение мух
- Выберите подходящий материал/линию для исследования.
Примечание: Чтобы проиллюстрировать анализ, мы использовали нокаутный запас транзиентного рецептора TRPA1 и его генетический контроль, запас w1118 . - При необходимости поддерживайте поголовье мух в постоянных условиях. Чтобы следовать этому протоколу, храните запасы при температуре 25 °C в суточном цикле 12:12 на стандартных продуктах питания (кукурузная мука, патока и дрожжи торула).
- Разделите самцов и самок с помощью легкой анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от эксперимента, могут использоваться девственные или спаренные мухи.- Дайте взрослым самцам и самкам (отдельно для обеих стад) спариться и отязать яйца в течение 5 дней. Очистите взрослых от бутылок.
- Когда взрослые начнут закрываться через несколько дней, снова очистите бутылки. Через 2 дня разделите самцов и самок с помощью легкой эфирной анестезии и дайте им созреть отдельно при плотности 25 мух во флаконе.
2. Предварительная обработка
- Примените предварительную обработку или независимую переменную, которая будет определять экспериментальные группы (генетические, экологические, фармакологические или иные).
- Чтобы следовать этому протоколу, разделите взрослых особей по половому признаку, а через 5 дней предварительно обработайте половину взрослых особей, погрузив герметичный флакон с микроорганизмами в водяную баню при температуре 37 °C на 1 час. Держите органы управления в инкубаторе при температуре 25 °C. Дайте мухам восстановиться в течение 24 часов после предварительной обработки, перед анализом на устойчивость к жаре.
3. Настройка системы DAM2
- Загрузите мух в трубки монитора DAM2 и закройте трубки с обоих концов ватой. Если необходимо немедленно оценить устойчивость мух к жаре, не используйте анестезию во время загрузки микроорганизмов в трубки монитора, чтобы избежать любых потенциальных искажающих эффектов, связанных с воздействием анестезии. Вместо этого аспирируйте отдельных мух из флаконов в контрольные трубки.
- Вставьте пробирки для анализа в мониторы активности, обращая внимание на номера слотов в различные группы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут быть рандомизированы в зависимости от эксперимента, если расположение внутри монитора может считаться искажающей переменной. - Программное обеспечение для сбора данных DAM2
ПРИМЕЧАНИЕ: Система и программное обеспечение DAM2 подробно описаны в техническом описании программного обеспечения DAMSystem3, доступном на веб-сайте компании (см. Таблицу материалов). Обратитесь к инструкциям DAM2 для устранения конкретных неполадок и общих функций. Здесь мы даем рекомендации по использованию системы в контексте нашего анализа термостойкости.- Система DAM2 отслеживает, сколько раз отдельная муха в каждой трубе прерывает инфракрасный луч. Затем программное обеспечение для сбора данных индексирует и сбрасывает это число каждый определенный интервал времени. В разделе «Настройки» выберите интервал считывания , который будет использоваться в анализе. Мы нашли интервал чтения в 15 секунд для достижения хорошего баланса между разрешением и ошибками чтения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы интервал считывания не был короче в секундах, чем количество используемых мониторов. Более короткий интервал чтения обеспечит лучшее временное разрешение анализа, но также потенциально увеличит количество ошибок чтения. Программное обеспечение может отставать при попытке индексировать показания. Кроме того, более новый и быстрый компьютер имеет большое значение для предотвращения ошибок чтения. - При рассмотрении ошибок чтения убедитесь, что компьютер, на котором запущено программное обеспечение для сбора данных DAM2, настроен на то, чтобы никогда не переходить в спящий режим или гибернацию, чтобы не прерывать анализ. Кроме того, убедитесь, что автоматические обновления (включая любые сетевые обновления, контролируемые учреждением) отключены во время сбора данных.
- Убедитесь, что все мониторы подключены и обмениваются данными с программным обеспечением. Убедитесь, что состояние каждого монитора отображается зеленым цветом на вкладке текущих данных .
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите техническое описание программного обеспечения DAMSystem3 для получения подробной информации о проблемах, к которым относятся различные цветовые коды. - Программное обеспечение для сбора данных автоматически записывает данные о количестве действий в текстовые файлы в папке «Данные » в системных файлах. Чтобы упростить анализ данных, удалите все текстовые файлы в этой папке данных перед запуском программного обеспечения для сбора данных для любого анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Текстовые файлы будут автоматически заполнены, поэтому допустимо удалить их из этой папки, чтобы очистить старые данные, не мешая работе программы.
- Система DAM2 отслеживает, сколько раз отдельная муха в каждой трубе прерывает инфракрасный луч. Затем программное обеспечение для сбора данных индексирует и сбрасывает это число каждый определенный интервал времени. В разделе «Настройки» выберите интервал считывания , который будет использоваться в анализе. Мы нашли интервал чтения в 15 секунд для достижения хорошего баланса между разрешением и ошибками чтения.
4. Тест на термостойкость
- Загрузите мониторы в пробирный инкубатор.
- Запустите программное обеспечение для сбора данных и оставьте индекс программного обеспечения на определенный период времени (например, 40 индексов или 10 минут, если интервал считывания установлен на 15 с) перед применением теплового напряжения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет в некоторой степени акклиматизироваться к трубкам и восстановиться после движения мониторов во время их настройки. Особенно если анализируется активность во время анализа, то это время акклиматизации установит исходную активность до возникновения теплового стресса. В зависимости от специфики проводимого анализа, эту фазу акклиматизации можно пропустить, поместив мониторы непосредственно в инкубатор уже при стрессовой температуре. - При проведении статического анализа (TKD) установите инкубатор на ускорение до заданной вредной температуры после периода акклиматизации. Переменная отклика будет операционализирована как последнее зарегистрированное время движения (т.е. последний ненулевой индекс) для оценки TKD.
- Если вы проводите динамический анализ, определите скорость, с которой температура будет повышаться после периода акклиматизации. Здесь измеряемая переменная отклика технически снова является временем. Время, в которое записывается последнее движение, будет совпадать с температурой (CTmax), в зависимости от скорости нарастания.
- Отслеживайте подсчет активности в режиме реального времени на дисплее системы DAM в программном обеспечении для сбора данных или непосредственно изучайте текстовые файлы в папке данных в файлах программы DAMSystem3. Скопируйте текстовые файлы и откройте копию, а не исходный файл в папке данных, чтобы не вызвать проблем с записью данных в реальном времени.
- После того как в течение нескольких минут ни у одной из мух не будет видно движения, остановите работу программного обеспечения для сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью наших анализов мы обнаружили, что от нескольких до нескольких минут бездействия указывают на физиологический коллапс из-за теплового стресса, подобный тому, который наблюдается при классических ручных анализах TKD. Это, однако, зависит от спонтанного поведения бегства. Таким образом, рассмотрите возможные смешанные переменные, если конкретное лечение в исследовании может изменить эту поведенческую реакцию. Кроме того, в зависимости от конкретных параметров анализа (например, температуры, обработки), продолжительность анализа, очевидно, будет варьироваться.
5. Организация и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительном видео S1 вы найдете пошаговое руководство по загрузке исполняемого приложения с GitHub, а также основные функциональные возможности программного обеспечения.
- После получения данных отсканируйте текстовые файлы на наличие ошибок с помощью указанного программного обеспечения (см. Таблицу материалов) и выберите конкретные начальные и конечные точки для группирования данных о действиях. Если был реализован интервал акклиматизации в 10 минут, начните группирование через 10 минут после начала записи активности. Дополнительные сведения о группировании см. в обсуждении.
- Откройте HoTDAM! и импортировать отсканированные файлы данных монитора, нажав Файл | загрузить данные монитора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение и исполняемое приложение доступны на GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) или на веб-сайте компании в разделе «Программное обеспечение для анализа ». Обратите внимание, что в настоящее время исполняемое приложение совместимо только с операционными системами Windows. - Добавьте обозначения групп, чтобы указать, какие группы обработки соответствуют той или иной ячейке в мониторах DAM2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Макет интерфейса программного обеспечения соответствует макету мониторов. - Нажмите кнопку Начать определение нескольких групп, чтобы открыть диалоговое окно для добавления обозначения группы, которое будет применено к нескольким ячейкам. После того, как обозначение группы будет принято, нажмите на ячейки, чтобы применить обозначение группы, затем нажмите «Остановить обозначение нескольких групп».
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение организует и экспортирует данные DAMSystem3 в .csv файлы для анализа в статистическом программном обеспечении. - Экспортируйте TKD (т.е. последний ненулевой индекс) для каждой мухи в мониторах в файл .csv, нажав Файл | Экспорт данных о нокдауне | Экспортируйте все мониторы или экспортируйте выбранные мониторы. TKD для каждой мухи будет организован в выходе по групповому обозначению.
- Экспортируйте данные об активности для каждой мухи, нажав на Файл | Экспорт данных о действиях | Экспортируйте все мониторы или экспортируйте выбранные мониторы в файл .csv, сохраняя только временные метки и данные подсчета, что упрощает работу с файлом данных, а также назначает назначенные групповые метки для каждого полета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первые несколько столбцов в файлах данных DAMSystem3 соответствуют внутренним данным для мониторов (например, данные о мониторинге освещенности или сообщения об ошибках) во время сбора данных. Данные подсчета находятся в столбцах 11-42 (подробнее см. в техническом описании DamSystem3). При экспорте данных о действиях с помощью аналитического программного обеспечения будут удалены все столбцы, кроме метки времени и столбцов данных о количестве. - При выполнении эксперимента с CTmax используйте TKD для определения CTmax по скорости нарастания температуры.
Примечание: Программное обеспечение для анализа было написано объектно-ориентированным образом на C# (исходный код доступен на GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) таким образом, что аспекты программы могут быть легко изменены для настройки под конкретные цели.
6. Статистика
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных TKD можно использовать множество различных тестов, в зависимости от специфики экспериментальной установки.
- Используйте анализ выживаемости (например, регрессию Кокса, Каплана-Мейера) для концептуализации нокдауна как события, которое испытает каждая муха в рамках анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный обзор см. в серии статей Брэдберна и Кларка, посвященных анализу выживаемости и его реализации 5,6,7,8. - Используйте ANOVA для оценки различий в группах и сравнения модальностей, особенно при валидации автоматического анализа для конкретных условий.
- Проанализируйте данные ТКД с помощью анализа выживаемости Каплана-Мейера. Разбейте файл по акциям таким образом, чтобы анализ выполнялся отдельно (например, для линий TRPA1 и w1118 акций). Выберите переменную времени в качестве TKD (в минутах), нокдаун в качестве события, предварительную обработку в качестве фактора и пол в качестве страты.
- Проведите тесты логарифмического ранга, Бреслоу и Тарона-Уэра для сравнения предварительной обработки для каждого слоя (т.е. пола) в иллюстративных целях, показав несколько методов.
- Стройте сюжеты для выживания.
Результаты
Анализ акций TRPA1 и w1118 проводился отдельно. Процентиль умножения TKD и другие описательные данные можно найти в таблице 1.
| Процентилиa | ||||||||
| Секс | Лечение | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | Оценивать | Стандартная ошибка | Оценивать | Стандартная ошибка | Оценивать | Стандартная ошибка | ||
| В1118 | ||||||||
| Женский | Контроль | 16 | 42.50 | 0.43 | 40.75 | 2.00 | 38.75 | 0.43 |
| Закалённый | 16 | 48.75 | 4.55 | 43.25 | 2.50 | 38.50 | 1.95 | |
| Мужской | Контроль | 16 | 43.25 | 1.88 | 39.75 | 0.25 | 37.00 | 2.38 |
| Закалённый | 16 | 46.50 | 5.63 | 35.50 | 2.00 | 30.75 | 3.03 | |
| ТРПА1 | ||||||||
| Женский | Контроль | 16 | 34.25 | 2.17 | 29.25 | 7.50 | 21.50 | 0.72 |
| Закалённый | 15 | 37.25 | 4.84 | 28.75 | 1.77 | 25.75 | 0.86 | |
| Мужской | Контроль | 15 | 38.25 | 3.29 | 32.00 | 1.29 | 24.50 | 7.92 |
| Закалённый | 16 | 27.50 | 0.72 | 25.75 | 1.00 | 22.75 | 6.06 | |
Таблица 1: Описательная статистика для анализа выживаемости мух w1118 и TRPA1 по методу Каплана-Мейера. Значения процентиля TKD указываются в минутах. Закаливание относится к предварительной обработке при температуре 37 °C с последующим восстановлением в течение 24 часов до теплового шока при 39 °C. Контроль поддерживали при температуре 25 °C в течение всей предварительной обработки. ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе выживаемости75-й процентиль – это самое позднее время, когда 75% образца продолжают проявлять активность.
Для мух w1118 логарифмическое ранговое тестирование показало значительную разницу в вероятности нокдауна между закаленными и контрольными самками (p = 0,026), так что закаленные самки имели меньшую вероятность быть сбитыми с ног тепловым стрессором в ходе анализа. Между тем, логарифмическое ранжирование не выявило существенной разницы в вероятности нокдауна между закаленными и контрольными самцами w1118 (p = 0,798). Для самок TRPA1 не было обнаружено существенной разницы в вероятности нокдауна между закаленными и контрольными организмами (p = 0,547) с помощью логарифмического рангового тестирования. Наконец, для самцов TRPA1 логарифмическое рейтинговое тестирование показало значительную разницу в вероятности нокдауна между закаленными и контрольными организмами (p = 0,014), так что контрольные организмы имели меньшую вероятность быть сбитыми с ног тепловым стрессором. В таблице 2 приведены все результаты анализа выживаемости (включая обобщенные тесты Вилкоксона и Тарона-Уэра) и кривые выживаемости на рисунке 1 .
| Секс | χ2 | ДФ | p-значение | |
| В1118 | ||||
| Женский | Бревенчатый ранг (Мантел-Кокс) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| Бреслоу (генерализованный Уилкоксон) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| Тароне-посуда | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| Мужской | Бревенчатый ранг (Мантел-Кокс) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| Бреслоу (генерализованный Уилкоксон) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| Тароне-посуда | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| ТРПА1 | ||||
| Женский | Бревенчатый ранг (Мантел-Кокс) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| Бреслоу (генерализованный Уилкоксон) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| Тароне-посуда | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| Мужской | Бревенчатый ранг (Мантел-Кокс) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| Бреслоу (генерализованный Уилкоксон) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| Тароне-посуда | 5.20 | 1 | 0.023 |
Таблица 2: Тест значимости, сравнивающий вероятность сохранения активности между предварительно обработанными и контрольными самками и самцами мух w1118 и TRPA1 . Под закалкой понимается предварительная обработка при температуре 37 °C с последующим восстановлением в течение 24 часов до теплового шока при 39 °C. Контрольные организмы содержались при температуре 25 °C в течение всей предварительной обработки.
Рисунок 1: Кривые выживаемости, показывающие долю организмов с остаточной активностью в ходе анализа TKD для мух w1118 и TRPA1 . Под закалкой понимается предварительная обработка при температуре 37 °C с последующим восстановлением в течение 24 часов до теплового шока при 39 °C. Контрольные организмы содержались при температуре 25 °C в течение всей предварительной обработки. TKD измеряется в минутах с момента введения теплового стресса при температуре 39 °C. Сокращения: TKD = время до нокдауна; TRPA1 = анкирин 1 транзиентного рецепторного потенциала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Средняя активность, построенная на графике во времени, показана на рисунке 2 для закаленных и контрольных TRPA1 и w1118 самцов и самок.
Рисунок 2: Средняя активность в зависимости от времени для мух w1118 и TRPA1 в течение всего анализа TKD. Сокращения: TKD = время до нокдауна; TRPA1 = анкирин 1 транзиентного рецепторного потенциала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Вероятно, существуют многочисленные и новые способы анализа данных об активности, особенно с учетом групповых эффектов и включения TKD. Поскольку анализ активности во время устойчивости к жаре относительно не изучен, мы не изучали потенциально новые статистические подходы к анализу данных об активности. Такое статистическое тестирование заслуживало бы гораздо более обширного обзора литературы и обсуждения, чем это уместно здесь. Вместо этого мы просто построили график средней активности для каждой группы (до лечения или контроля) в зависимости от времени, потому что мы ранее публиковали этот метод, чтобы проиллюстрировать активность соответствующим обзором литературы.
Дополнительное видео S1: Пошаговое руководство по загрузке исполняемого приложения с GitHub и основным функциям программного обеспечения. Самый последний выпуск (в настоящее время совместимый только с Windows) можно найти на GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) или по индексированной ссылке в разделе «Программное обеспечение для анализа » на веб-сайте компании. Как только релиз будет загружен, файлы нужно будет извлечь, и HoTDAM! Приложение можно открыть. Антивирусное программное обеспечение может препятствовать запуску приложения; Возможно, потребуется предоставить приложению разрешения. После запуска интерфейса можно загрузить отсканированный DAM2 (File Scan Software) (File | Загрузить данные монитора). Интерфейс «Обозначение групп » представляет собой макет монитора активности и позволяет пользователю назначать группы лечения для трубок по отдельности или сразу по несколько с помощью функции «Определение группы с несколькими выборами ». Все мониторы являются взаимоисключающими в отношении функциональности обозначения группы и должны быть определены отдельно. Затем данные о TKD и активности можно экспортировать в .csv файлы (Файл | Экспорт данных или файла Knockdown | Экспорт данных о действиях) для выбранного монитора по отдельности или для всех мониторов сразу. Если все мониторы экспортируются одновременно, данные TKD или активности будут экспортированы в один файл .csv, но данные для каждого монитора будут отделены в файле. Экспортированные файлы TKD будут группировать мух в группы, отображающие ненулевой индекс последней активности для каждой трубки. Файлы действий будут хранить все трубки отдельно, но будут связывать обозначения групп и удалять всю информацию из файлов, кроме временных меток и данных количества для каждой трубы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Обсуждение
Метод определения термостойкости, который мы описываем здесь, является универсальным и масштабируемым. Ранее мы опубликовали валидационное исследование, в котором сравнили тест HoTDAM! к классическому, основанному на наблюдении анализу TKD и обнаружил, что автоматический анализ показывает одну и ту же общую тенденцию по нескольким факторам4 (Рисунок 3). Другими словами, точно так же, как и классический ручной анализ TKD, автоматизированный анализ DAM2 смог дифференцировать организмы по полу, температуре анализа, предварительной обработке затвердевания и времени восстановления после предварительной обработки затвердеванием до анализа. В то время как автоматический анализ считается более объективным в том смысле, что TKD не зависит от наблюдений исследователя, наши данные не позволяют предположить, что это делает анализ DAM2 заметно превосходящим ручной анализ с точки зрения обнаружения эффекта. Мы обнаружили, что анализы очень похожи с точки зрения точности, и, во всяком случае, размеры эффектов в рамках автоматизированного анализа немного меньше (см. дополнительный материал Rokusek et al.4 для получения подробных описательных статистических данных и данных ANOVA как для автоматизированных DAM2, так и для ручных анализов, основанных на наблюдениях, из наших валидационных исследований). Причина этого, вероятно, связана с внутренней разницей в том, что анализы измеряют с точки зрения TKD, что подробно обсуждается ниже.
Рисунок 3: Сравнение автоматизированного анализа DAM2 с классическим анализом TKD, основанным на наблюдениях. Графики показывают среднее значение TKD в минутах, а полосы погрешности представляют собой стандартную погрешность среднего значения. Независимыми сравниваемыми факторами являются: (A) пол по температуре анализа, (B) закаливание по температуре анализа, (C) пол по времени восстановления, (D) закаливание по полу, (E) температура анализа по времени восстановления и (F) затвердевание по времени восстановления. Абсолютный TKD, как правило, дольше в автоматическом анализе, но общие тенденции по всем факторам согласуются между анализами. Этот рисунок был взят из Rokusek et al. 4. Сокращение: TKD = время до нокдауна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Представленные здесь иллюстративные данные представляют собой совершенно другие эксперименты по сравнению с нашими первоначальными проверочными испытаниями, в которых также использовались другие нахлыстовые лески. Анализ (TKD и активность) был чувствителен к эффектам предварительной обработки затвердеванием в прикладе w1118 (в первоначальных экспериментах мы использовали штамм Canton S дикого типа), что подтверждает, что базовая функциональность анализа стабильна в изменяющихся условиях, хотя до сих пор было протестировано только несколько линий. Анализ универсален в том смысле, что он не ограничивается измерением TKD. Поскольку TKD в нашем анализе определяется как прекращение двигательной активности, CTmax может быть определен, если известна скорость нарастания температуры. Наконец, анализ полностью автоматизирован и может быть легко масштабирован путем добавления большего количества мониторов активности, что позволяет использовать гораздо большие размеры выборки, чем это было бы возможно при ручном методе наблюдения.
Ниже приведены некоторые ключевые моменты, которые следует учитывать при проведении анализа и анализа. Используйте инкубатор, который может быстро достигать заданной температуры, чтобы мониторы можно было загрузить в инкубатор при температуре выращивания и дать им спокойно посидеть для акклиматизации к новой среде перед применением теплового стрессора. Если температура нарастает слишком медленно, то анализ начинает больше напоминать динамический анализ CTmax, а не статический анализ TKD. Например, если программному обеспечению было разрешено индексировать 40x до индукции теплового напряжения для установления базового уровня, программное обеспечение может вывести файл данных, начиная с индекса 40, для определения TKD и анализа данных. Отправной точкой является временная метка, записанная программным обеспечением, поэтому помните об интервале индекса (например, 40 индексов — это 10 минут, если интервал индекса составляет 15 секунд).
Программное обеспечение для сканирования файлов также может использоваться для «объединения» индексов и может либо суммировать, либо усреднять счетчики. Например, когда мы построили график данных об активности (см. ниже), мы объединили каждые четыре индекса, суммируя количество (т. е. мы экспортировали активность каждую минуту, а не каждые 15 секунд). Обратите внимание, что программное обеспечение для сканирования файлов не позволяет использовать частичное минутное время запуска при группировании с точки зрения временной метки. Например, если первый индекс был в 12:10:15 с интервалом 15 с, то биннинг в 1 минуту начнется в ближайшую минуту (например, в 12:11:00). Таким образом, если для анализа будет использоваться активность с минутным приращением, но желательно разрешение в 15 с интервалов для TKD, запустите программное обеспечение сбора данных в течение 15 с от ближайшей полной минуты (например, после 12:09:45 и до 12:10:00). Эта сложность связана с тем, что программное обеспечение для сбора данных использует часы компьютерной системы в качестве временной метки, поскольку DAMSystem3, вероятно, был создан с учетом исследований сна.
С точки зрения статистических подходов к сравнению ТКД, мы утверждаем, что анализ выживаемости дает больше информации, чем простое сравнение среднего или медианного времени нокдауна между группами. Кривые выживаемости могут дать визуальное представление о временном ходе нокдауна для популяций во время анализа. Аналогичным образом, статистическое тестирование может быть адаптировано к конкретному вопросу, заданному в рамках исследования. Например, обобщенные тесты Вилкоксона придают больший вес ранним событиям, в то время как логарифмические ранговые тесты придают одинаковый вес всем временным точкам и более чувствительны к различиям в более поздних временных точках. Если отношения рисков не пропорциональны (т.е. кривые выживаемости пересекаются), Тарон-Уэр является более строгим. Поскольку не должно быть никакой цензуры данных, так как все организмы испытают это событие (нокдаун), можно привести аргумент в пользу использования непараметрических рейтинговых тестов, таких как тесты Манна-Уитни У и Краскала-Уоллиса, наряду с кривыми выживаемости Капана-Мейера9. Если исследование заинтересовано в нокдауне через определенный промежуток времени, а не в TKD после того, как все организмы были сбиты с ног, использование анализа выживаемости и логарифмических или обобщенных тестов Вилкоксона будет устойчивым к цензурированным данным (т.е. сценарий, при котором не все организмы перестанут двигаться или разрушатся к концу анализа). Для иллюстрации мы привели результаты логарифмического ранга, обобщенного Уилкоксона и Тарона-Уэра в таблице 2 .
Во время теплового стресса и до CTmax поведенческие изменения (например, поведение побега) служат механизмами преодоления. Эти врожденные поведенческие стратегии сохраняются во всем животном царстве, но особенно важны для эктотерм, учитывая их меньшую способность к метаболическойтерморегуляции. Очевидно, что поведение является важным аспектом фенотипа эктотермического теплового стресса, но относительно скудные исследования изучали эти поведенческие аспекты термоустойчивости. Учитывая, что описываемый нами анализ основан на характерном увеличении двигательной активности в ответ на тепловой стресс, он хорошо подходит для изучения локомоторных аспектов реакций на тепловой стресс. В то же время эта опора на спонтанную деятельность несет в себе некоторые ограничения. Важно помнить, особенно при изучении компонентов двигательных реакций на тепловой стресс, что и ТКД, и активность неразрывно связаны. Чтобы продемонстрировать ситуацию, в которой это может быть предельным для нашего анализа, мы привели здесь данные о микроорганизмах TRPA1, которые испытывают дефицит термочувствительности. Когда организмы испытывают дефицит рецептора TRPA1, мухи не проявляют характерной локомоторной реакции на тепло12. В репрезентативных данных, показанных здесь, реакция активности у организмов TRPA1 притуплена. Измерения TKD было бы нелегко сравнить с показателями организмов дикого типа, поскольку эти измерения представляют собой другую двигательную реакцию.
Возможность обобщения и прямого сравнения результатов, особенно с классическими тестами на термостойкость, также является потенциальным ограничением (рис. 3). Часто анализы, основанные на наблюдениях, включают в себя механический или другой стимул, чтобы убедиться, что неподвижный организм действительно испытывает физиологический коллапс, а не просто демонстрирует отсутствиеспонтанной активности. Поскольку наш анализ основан на спонтанной активности, существует неотъемлемая разница в операционном определении ТКД, которая может усложнить сравнение. Другими словами, мы определили ТКД как прекращение двигательной активности, в то время как классические анализы в целом определяют ТКД как физиологический коллапс. Кроме того, автоматизированные анализы, подобные описанному нами, основаны на нагретом воздухе, в то время как ручные анализы обычно включают водяную баню и, таким образом, более эффективную теплопередачу. Все эти ограничения для сравнения между методами анализа представляют собой недостатки для обобщаемости автоматизированного метода. В то же время, сообщалось, что методы, основанные на наблюдении, страдают от осложнений при прямом сравнении между исследованиями 2,14,15. Мы утверждаем, что, несмотря на ограничения, автоматизированные анализы являются жизнеспособным средством оценки термостойкости с точки зрения TKD или CTmax.
Другие автоматизированные анализы термостойкости для TKD и CTmax были реализованы и описаны ранее в литературе 16,17,18,19, причем в некоторых из них использовались мониторы активности DAM2 18,19. Кроме того, по меньшей мере в нескольких исследованиях использовались видеометоды 16,20,21, а также мониторы активности 20 DAM2 для изучения профилей активности плодовых мушек в их отношении к толерантности к жаре в контексте острого теплового стресса. Таким образом, автоматизация анализа термостойкости, в том числе с помощью системы DAM2, не является новой идеей. Что является новым и ценным в нашем анализе, так это простота управления данными, чему способствует HoTDAM! (аналитическое) программное обеспечение. С данными о действиях трудно работать, и может быть трудоемко и громоздко извлекать даже самые простые измерения (например, TKD) из больших наборов данных без использования программного обеспечения или скриптов, которые необходимо создавать индивидуально для каждого сценария. HoTDAM! является бесплатным и доступен в виде полнофункционального исполняемого приложения с простым и удобным в использовании интерфейсом. Предварительный опыт программирования не требуется. Кроме того, программное обеспечение было написано в объектно-ориентированном ключе с документацией для облегчения модификации. Таким образом, HoTDAM! может быть легко настроен в соответствии с конкретными потребностями. Исходный код доступен вместе с исполняемым приложением. Мы надеемся, что HoTDAM! может обслуживать лаборатории, не знакомые с анализами на термоустойчивость, предлагая простые средства для измерения TKD и CTmax, а также обслуживать лаборатории, имеющие опыт проведения анализов на термоустойчивость, предлагая настраиваемое программное обеспечение для облегчения управления данными.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Описанный проект был поддержан грантами Премии за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (5P20GM103427 и 1U54GM115458). Программа научных сотрудников бакалавриата UNK и летняя исследовательская программа UNMC для студентов-медиков.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 14 мл полистирольных пробирок | Falcon | 352057 | |
| 30 галлонов | Wal-mart | ||
| 8 унций | Genesee | 32-129F | |
| Постоянная климатическая камера | Memmert | HPP750eco | |
| кукурузная мука | Lab Scientific | FLY801010 | |
| DAM2 Монитор активности дрозофилы | TriKinetics | DAM2 | (DAMSystem3 Data Sheet) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| программное обеспечение для сбора данных DAMSystem | TriKinetics | скачать | |
| бесплатно Drosophila agar | Lab Scientific | FLY80201 | |
| этанол | Fisher Scientific | BP82011 | |
| эфир | Программное обеспечение Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan | TriKinetics | для сканирования текстовых ошибок, группировки данных и вывода | |
| Флаги FlyStuff для бутылок | Genesee | 49-100 | |
| Флаги FlyStuff для флаконов | Genesee | 49-102 | |
| флаконы FlyStuff | Genesee | 32-113RL | |
| HoTDAM программное обеспечение | Github или Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| Погружной циркуляционный нагреватель | PolyScience | MX-CA11B | |
| патока | Lab Scientific | FLY80084 | |
| пропионовой кислотой | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Стеклянные трубки 5 x 65 мм для DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| маленькая кисть для рисования | Wal-mart | ||
| SPSS Statistics | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| торула дрожжи | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 mutant stock | Bloomington Stock center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | Bloomington Stock center | 3605 |
Ссылки
- Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
- Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
- Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
- Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
- Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
- Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
- MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
- Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
- Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
- Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).
Перепечатки и разрешения
