Method Article

Идентификация и классификация позиционно-специфичных вариантов миссенс-субъединицы рецептора ГАМКА по их роли в пирамидальных нейронах гиппокампа

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование представляет многоуровневую структуру, охватывающую от ДНК до функции белка и нейронного поведения. В нем представлен новый подход к исследованию предсказанных патогенных мутаций в субъединице рецептораГАМК А , предполагая, что эпилептогенные мутации и проксимальные мутации, прогнозируемые как патогенные, могут оказывать аналогичное воздействие на модель пирамидального нейрона CA1.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание эффектов функционально неизвестных вариантов в генах, связанных с эпилепсией, имеет решающее значение для выяснения патофизиологии заболевания и разработки персонализированной терапии. С помощью многоуровневой структуры, охватывающей от последовательности ДНК до функции белка и поведения нейронов, мы описываем новый подход к прогнозированию и исследованию патогенных мутаций, предполагая, что эпилептогенные мутации в субъединице рецептора ГАМКА и близлежащих предсказанных мутациях могут оказывать аналогичное воздействие на модель пирамидального нейрона CA1. Изучая характерные взаимосвязи между предсказанными патогенными мутациями и проксимальными эпилептогенными мутациями, исследование направлено на оценку эффектов прогнозируемых мутаций на основе влияния эпилептогенных мутаций на моделирование пирамидальных нейронов гиппокампа.

Методология начинается со сбора генетических данных γ2-субъединицы рецептора ГАМКА , за которым следует очистка и форматирование данных в R с использованием пользовательского скрипта. Далее будут применены ансамблевые предикторы для идентификации и приоритизации патогенных миссенс-вариантов субъединицы γ2 . Будет проиллюстрировано картирование конкретного патогенного варианта (предсказанного) на субъединичные структурные домены, общие для эпилептогенных мутаций, с молекулярным моделированием их эффектов и рассмотрением эволюционного сохранения. Затем будет проведен мета-анализ и нормализация параметров, а затем корреляционный анализ для выявления любых значимых взаимосвязей между прогнозируемыми мутациями и проксимальными эпилептогенными мутациями. С помощью нейронного симулятора на основе Python будет описана многокомпонентная модель нейронов на основе проводимости, отражающая влияние мутантов дикого типа и эпилептогенов. Для грубой оценки влияния прогнозируемых патогенных вариантов на нейронный ответ будет рассмотрено моделирование нейронных реакций, генерируемых эпилептогенным подтипом рецептора ГАМКА . Насколько нам известно, это первый протокол, в котором исследуется многоуровневая структура для оценки влияния вариантов рецептора ГАМКА на поведение нейронов, что имеет решающее значение для исследований эпилепсии. Этот протокол может служить основой для усиления прогнозирования клеточных фенотипов, вызванных потенциально патогенными вариантами рецепторов ГАМКА , ассоциированных с эпилепсией.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почти для всех заболеваний человека генетическая изменчивость играет значительную роль в индивидуальной восприимчивости. Таким образом, понимание того, как вариации последовательностей связаны с риском заболевания, предлагает ценный способ выявить ключевые процессы, участвующие в развитии заболевания, и определить новые подходы к профилактике и лечению1. Это также относится к нарушениям развития нервной системы, которые относятся к числу наиболее распространенных хронических заболеваний в педиатрической первичной медико-санитарной помощи2. Такие состояния, как расстройство аутистического спектра, умственная отсталость и эпилепсия, иллюстрируют, как генетическая изменчивость существенно влияет на индивидуальную восприимчивость вовремя развития.

Развивающийся мозг более восприимчив к эпилептическим припадкам, чем мозг взрослогочеловека, из-за генетически запрограммированного несоответствия в развитии нервной системы в критическом балансе между возбуждением и торможением. Поскольку ГАМК (гамма-аминомасляная кислота), основной тормозной нейромедиатор в мозге взрослого человека, является возбуждающим во время эмбрионального и раннего постнатального развития, это не благоприятно сказывается на стабильности, необходимой для предотвращения судорог в молодом мозге. Это временное состояние, вызванное отсутствием достаточной экспрессии котранспортеров K-Cl5, может способствовать повышенному риску судорожной активности в присутствии дисфункциональных рецепторов ГАМКА. Рецепторы ГАМК А опосредуют возбуждающее и ингибирующее действие ГАМК в зависимости от внутриклеточной концентрации Cl- ion6. Таким образом, по мере созревания мозга мутации в генах, кодирующих рецептор ГАМКА, а также в других ионных каналах, искажают возбудимость, а мутации в генах, участвующих в нейронном метаболизме, передаче сигналов в клеткахи образовании синапсов, могут вызывать такие состояния, как детская абсансная эпилепсия.

Клинические вмешательства все чаще используют генетический анализ для повышения точности лечения нарушений развития нервной системы2. Генетическое тестирование при детской эпилепсии представляет собой потенциальные мишени для подходов точной медицины9, подчеркивая важность генетических вариантов при принятии решений о лечении. Кроме того, ~25% пациентов с эпилепсией с мутациями de novo получают генетические диагнозы, которые определяют потенциальные мишени для точной медицины, что подчеркивает значительную ценность генетических вариантовпри принятии решений о лечении. Этому способствовали достижения в области технологий секвенирования нового поколения, такие как целевые генные панели, полноэкзомное секвенирование и полногеномное секвенирование, которые значительно ускорили генетические открытия. Тем не менее, растущее число открытий новых генов сопряжено с проблемой, когда в результате появляется вариант неизвестного значения (VUS), классификация, которая отражает противоречивые данные или недостаточную информацию о молекулярной роли варианта в патогенезе заболевания. Варианты, классифицируемые как ВУС, относятся к одной категории в рамках пятиуровневой системы классификации вариантов, предложенной Американским колледжем медицинской генетики и геномики (ACMG) и Ассоциацией молекулярной патологии (AMP)12.

Решение проблемы функционально неизвестных генетических вариантов требует усилий в двух ключевых измерениях: клинической практике и исследованиях. С клинической точки зрения, неопределенность, связанная с ВУС, может осложнить ведение пациента и принятие решений13. С точки зрения научных исследований, выявление патогенных вариантов среди растущего числа вариантов с неопределенной значимостью и определение их роли в патофизиологии заболевания и фенотипических эффектах имеют решающее значение1. Один из идеальных сценариев должен включать в себя точное прогнозирование молекулярных, нейронных и сетевых эффектов всех функционально нехарактерных вариантов, тем самым минимизируя ресурсы, время и усилия, необходимые для лабораторных исследований. Эти аспекты подчеркивают важность точной классификации генетических вариантов для точной диагностики генетической эпилепсии, поддержки персонализированного лечения и облегчения обнаружения потенциальных фармакологических мишеней. Современные прогностические инструменты 14,15,16,17 являются относительно точными, но, как правило, обеспечивают только бинарную классификацию (патогенные и доброкачественные) и не имеют специфического для заболевания понимания молекулярной патофизиологии, фенотипических последствий и лежащих в их основе механизмов. Сосредоточившись на неизвестных миссенс-вариантах отдельных генов, кодирующих субъединицу рецептораГАМК А, в данной статье представлена структура, направленная на совершенствование руководства исследованиями путем включения контекстуальных факторов вариантов, таких как молекулярные, эволюционные и структурные аспекты, а также моделирование нейронной патологии, полученное на основе биофизических данных in vitro мутаций, ассоциированных с эпилепсией. Наша методология направлена на идентификацию неизвестных патогенных вариантов γ2-субъединицы рецептора ГАМКА, ключевой субъединицы, участвующей в патофизиологии эпилепсии 18,19,20. За этим следует исследование позиционно-специфического соответствия этих предсказанных вариантов с мутациями, связанными с эпилепсией, характеризующимися структурными и электрофизиологическими данными. Эти данные затем используются для оценки вариационного влияния на модель пирамидального нейрона гиппокампа, экспрессирующего подтип рецептора ГАМКА, состоящий из γ2, α1 и β3 субъединиц (рецепторы γ2-ГАМКА), ответственного за быстрое синаптическое торможение6. Важно отметить, что рецепторы ГАМКА собираются из большого пула субъединиц (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π и ρ1-ρ3) и в зависимости от состава субъединиц рецепторыГАМК А различаются по своей модуляции, биофизическим характеристикам, а также по региональным, клеточным и субклеточным паттернам экспрессии в сочетании со специфическими функциями 6,21,22,23, 24,25. Таким образом, в настоящем исследовании основное внимание уделяется только γ2-ГАМКА рецепторам или γ2-содержащим ГАМКА рецепторам.

Субъединицы рецептора ГАМКА состоят из характерных структурных особенностей – длинного N-концевого внеклеточного домена (ECD), четырех трансмембранных охватывающих доменов (TM1 – TM4), внутриклеточного линкера, соединяющего TM1 и TM2, внеклеточного линкера, соединяющего TM2 и TM3, большой внутриклеточной петли между TM3 и TM4 (петля TM3-TM4) и короткого внеклеточного C конца 6,26, 27. Предполагается, что рецептор ГАМКА функционирует по сложному механизму «блокировки и вытягивания», при котором связывание с ГАМК блокирует β и α субъединицы, заставляя их притягивать внеклеточные домены (ECD) субъединиц, вращая их против часовой стрелки27. Это движение изгибает трансмембранные домены (TMD), тем самым открывая ионный канал27. Таким образом, активность канала, по-видимому, координируется вместе со структурными кассетами внутри рецепторов ГАМКА. Оказывается, что мутации при эпилепсии вызывают дисфункцию в активности каналов из-за искажения этих структурных кассет28. Следовательно, наше исследование основано на идее о том, что предсказанные патогенные варианты в непосредственной близости от функционально идентифицированных эпилептогенных мутаций в специфических структурных кассетах субъединиц рецептора ГАМКА могут демонстрировать аналогичные паттерны электрофизиологических или биофизических искажений в функции канала, как это наблюдается в случаях этих эпилептогенных мутаций. В то время как присутствие эпилептогенных структурных кассет в субъединицах28 рецептора ГАМКА косвенно подтверждает эту идею, наше исследование демонстрирует сложность и проблему корреляции биофизических параметров эпилептогенных мутаций с параметрами прогнозируемых патогенных мутаций. Чтобы выявить эти сложные взаимосвязи, наша концепция имеет важное значение, поскольку она подчеркивает многоуровневый подход, начиная от ДНК и заканчивая функцией белка и нейронным поведением, критически важным для исследований эпилепсии. Этот подход объединяет вычислительную генетику с молекулярным моделированием и нейронным моделированием, а также подчеркивает важность дополнительных методов, таких как машинное обучение, обученное на больших наборах данных, которые могут зафиксировать влияние мутаций на структуру канала, активность и возбудимость нейронов. Кроме того, моделирование активности эпилептогенного γ2-ГАМКрецептора А на модели пирамидального нейрона гиппокампа позволяет воспроизводить in vitro клеточный фенотип, связанный с каналопатией рецептора ГАМКА, и демонстрировать измененные ответы одного нейрона в центре дисфункции сети.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Прогнозирование in silico патогенных вариантов

  1. Сбор данных о вариантах
    1. Используя базу данныхClinVar 29, выполните поиск вариантов неопределенной значимости (VUS) в кодирующей области интересующего гена через веб-сайт: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Введите символ гена (например, GABRG2) в строку поиска и отфильтруйте результаты, чтобы включить только желаемые типы вариантов, такие как однонуклеотидные, миссенс-варианты с неопределенной значимостью. Загрузите и сохраните данные в формате data.xlxs (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S1). Запишите дату загрузки данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе будет проанализирована человеческая γ2-субъединица рецептора ГАМКА, а именно субъединица гамма-аминомасляной кислоты гамма-2 (GABRG2) Homo sapiens гамма-аминомасляной кислоты типа А, вариант транскрипта 1, мРНК (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), также известная как γ2L. Важно записывать референсный транскрипт интересующего гена, а также другие соответствующие идентификаторы в различных базах данных (UniProt, ENSEMBL, PDB), поскольку для разных методов вычисления могут потребоваться разные идентификаторы (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S2). В случае, если база данных или вычислительный инструмент не распознает номера версий идентификаторов последовательности, попробуйте использовать идентификатор как с номером версии (NM_198904.4), так и без номера версии (NM_198904).
    2. Справочная информация о белке
      1. В https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ базы данных NCBI выберите Nucleotide в опциях поиска и введите NCBI Ref. seq. ID интересующего гена (NM_198904.4). Затем, прокрутив вниз в правой колонке, нажмите на «Белок » в категории «Связанная информация », чтобы найти белок (NP_944494.1), закодированный в транскрипте NM_198904.4. Используя информацию, приведенную для белка NP_944494.1, запишите последовательности конкретных областей в виде таблицы (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S3).
        Примечание: Важно определить предварительную известную информацию о положении последовательностей функционально и структурно критических областей, мотивов или остатков, таких как белковые домены, сайты фосфорилирования, сайты связывания лигандов и интерфейсы молекулярных взаимодействий. Это может быть достигнуто путем объединения баз данных (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) и поиска литературы.
  2. Организация данных о вариантах
    1. Организуйте данные в соответствии с входными требованиями для выбранных предикторов. Убедитесь, что формат извлекаемых данных организован в соответствии с требованиями сервера dbNSFP http://database.liulab.science/dbNSFP. Для этого удалите ненужные столбцы из файла data.xlsx (Supplementary File 4: Supplementary Table S1 from step 1.1.1), оставив только следующие столбцы в указанном порядке:
      "GRCh38Хромосома", "GRCh38Расположение", "Название", "Изменение белка".
    2. Сохраните файл под новым именем: "data1.xlsx" (Дополнительная таблица S4). Отформатируйте файл data1.xlsx в R, выполнив код (Дополнительный файл 1: Data_GABAA. R), который сохранит отформатированные данные как data1_output.xlsx (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S5) в рабочем каталоге, относящемся к проекту R.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для разных вычислительных методов требуются разные типы и форматы данных. Сбор и организация данных в соответствии с определенными требованиями к формату, даже для дюжины вариантов, может быть подвержена ошибкам и отнимать много времени, поэтому этот шаг важен, если пул вариантов не состоит всего из нескольких вариантов. В этом случае может быть возможна ручная организация данных.
  3. Прогнозирование патогенности
    1. Перенесите содержимое файла data1_output.xlsx в академическую версию сервера dbNSFP30,31, доступ к которому осуществляется через http://database.liulab.science/dbNSFP. Для этого скопируйте/вставьте или напрямую загрузите файл в формате .txt.
    2. Перед отправкой убедитесь, что на сервере предварительно выбраны и подтверждены следующие параметры: HG38 (сборка генома), ClinPred32 и BayesDEL33 . В течение нескольких минут сервер сгенерирует результаты.
      Примечание: В настоящем протоколе два ансамблевых предиктора, а именно BayesDEL33 и ClinPred32, были выбраны за высокую точность34 и практичность. Тем не менее, можно выбрать и другие предикторы, такие как AlphaMissense, который доступен в базе данных dbNSFP30,31. Выбор инструментов in silico зависит от нескольких факторов, в том числе от создания достаточного количества вычислительных доказательств для мощногопрогнозирования. Для этой цели могут служить ансамблевые предикторы, интегрирующие анализ нескольких прогностических алгоритмов.
    3. Скачайте выходной файл (в формате .txt) и сохраните его как data2.xlsx (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S6).
    4. Установите фильтры в data2.xlsx (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S6), нажав на опцию фильтра в меню, и определите варианты консенсуса в обоих столбцах путем фильтрации по D. Это даст список наиболее патогенных вариантов; сохраните его (см. вкладку «Консенсус » в Дополнительной таблице S6 [ Дополнительный файл 4]).
  4. Выбор варианта
    1. Среди консенсусных патогенетических прогнозов определите варианты в непосредственной близости эпилептогенных мутаций, полученных из литературы. Убедитесь, что последние обладают структурными и биофизическими параметрами, подходящими для моделирования нейронов.
      Примечание: Этот этап является исследовательским и также связан с изучением интересующего белка с точки зрения его структурных, физико-химических и биофизических параметров. В настоящем исследовании эти данные были получены от Brünger et al.35 и Guo et al.36 в дополнение к обзору мутаций, связанных с эпилепсией. Кроме того, в качестве альтернативы, оценка AlphaMissense37 была получена из базы данных dbNSFP 30,31 с повторением шага 1.3 (Дополнительный файл 4: Дополнительная таблица S7). Более подробная информация приведена в разделах протокола 2.1.1 и 2.1.2 и в Результатах (см. раздел «Варианты кластеризации по структурным и биофизическим параметрам»).
    2. Для базовой визуализации используйте серверы Protter38 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/) и HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) для изучения вариантов на предыдущем шаге в контексте выбранных мутаций гена GABRG2 : P302L40 и K328M (или K289M41, если исключить сигнальный пептид с 39 остатками).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за огромной сложности структурная оценка эффектов вариантов должна проводиться на нескольких уровнях анализа. Такие инструменты, как Protter38 , позволят четко визуализировать варианты в контексте топологических особенностей белка, а удобные для пользователя серверы, такие как HOPE39 , дадут представление об эффекте вариантов с помощью молекулярного моделирования. Кроме того, всесторонний обзор литературы об интересующем белке имеет решающее значение для выявления и интеграции информации о мутациях, связанных с эпилепсией.
    3. Анализ эволюционного сохранения и структурных представлений
      1. Open Jalview 42,43,44, программа с открытым исходным кодом для редактирования, визуализации и анализа белков.
      2. Импорт последовательностей для выравнивания. Нажмите на «Файл» в верхнем меню | Выборка последовательностей; выберите базу данных в диалоговом окне (например, UniProt); нажмите на вкладку «Получить идентификаторы»; и, как описано в диалоговом окне, введите идентификаторы присоединения UniProt интересующего гена (GABRG2) человека и других видов позвоночных: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Нажмите OK.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Регистрационные номера UniProt белков, кодируемых GABRG2 , следующие: P18507 (P18507-2) для Homo sapiens, P22723 для Mus musculus, A0A2I3TKX0 для Pan troglodytes, F1RR72 для Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 для Canis familiaris и A0A8M1P4D6 для Danio rerio.
      3. В зависимости от интересующего гена некоторые последовательности могут быть не аннотированы; поэтому выполните поиск BLAST, чтобы определить релевантную информацию и потенциальные гомологи для лучшего понимания контекста. В этом случае загрузите белковые последовательности в формате FASTA с помощью опции текстового поля «Добавить последовательности/От» в меню «Файл », чтобы создать несколько выравниваний последовательностей нужных последовательностей.
      4. После загрузки выравнивания наблюдайте за последовательностями, отображаемыми для многократного сравнения последовательностей. Каждая строка представляет последовательность, а каждый столбец представляет позицию в выравнивании. Чтобы определить наилучший метод юстировки, используйте разные подходы; Например, нажмите на Web services в меню Sequence и выберите опцию Run T-Coffee with preset , которая обеспечивает оптимальное выравнивание.
      5. Щелкните правой кнопкой мыши по последовательности P18507 Homo sapiens (референсная последовательность в данном исследовании) и установите ее в качестве референсной последовательности. Выберите «Формат» в верхнем меню и нажмите « Обтекание » для визуализации полного выравнивания на экране. В том же меню «Формат» нажмите на шкалу выше , чтобы улучшить визуализацию конкретных номеров остатков. Чтобы еще больше улучшить визуализацию, настройте цветовые схемы, перейдя в раздел «Цвет » и выбрав различные параметры (например, «Цвет куста», «Химическое свойство»); При необходимости измените размер шрифта.
      6. Нажмите « Рассчитать » в строке меню и выберите «Авторасчет консенсуса », чтобы выделить сохраненные регионы.
      7. Сосредоточьтесь на положении вариантов, представляющих интерес, выявленных на этапе прогнозирования in silico , и изучите конкретные позиции вариантов. Аннотируйте определенные остатки, щелкнув по ним правой кнопкой мыши и выбрав «Добавить аннотацию». Напишите этикетку (например, идентификатор варианта) с соответствующим цветовым кодом и сохраните.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем анализе P302L (фиолетовый) и A303T (красный) были выбраны для визуализации их в множественной последовательности вместе со структурными данными (см. следующий раздел).
    4. Трехмерная реконструкция полного белка с указанием выбранных консервативных остатков
      1. В файле, полученном на предыдущем шаге, щелкните правой кнопкой мыши по эталонной последовательности (GABRG2 человек) и выберите 3D-данные структуры.
      2. Определите соответствующие структурные данные (7QNE, цепочка C)26 в раскрывающемся меню и выберите « Открыть новый вид структуры» с помощью Jmol.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит включать остатки, выбранные в ходе множественного выравнивания последовательностей, в структурные данные с помощью Jmol, средства просмотра 3D-химических структур с открытым исходным кодом на основе Java.

2. Подбор параметров и биофизическое моделирование

  1. Вариантно-специфичный метаанализ и нормализация параметров
    1. Обзор современной литературы для сбора идентифицированных вариантов субъединиц с электрофизиологической проводимостью канала передачи данных (gGABAA), временем дезактивации (τдеактивация), временем нарастания (τнарастания) и максимальной амплитудой тока (Imax). Укажите состав субъединиц, тип ячейки и измерения дикого типа для каждого случая. Соответствующим образом обозначьте варианты и их контроль (например, известные для вариантов с идентифицированными биофизическими характеристиками и известные контрольные для измерений дикого типа для каждого варианта).
    2. Получение баллов патогенности AlphaMissense для вариантов с идентифицированными биофизическими характеристиками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации см. раздел протокола 1.3.
    3. Создайте фрейм данных с субъединицей и положением аминокислот для каждого варианта, исходными и измененными аминокислотами, оценкой патогенности и биофизическими параметрами, полученными из литературы. Чтобы избежать экспериментальных расхождений, нормализуйте биофизические параметры для идентифицированных вариантов как x-кратные изменения при измерениях дикого типа.
  2. Сравнительный вариантный анализ по структурно-функциональным характеристикам
    1. Организация прогнозируемых вариантов на фрейме данных; соответствующим образом пометить (например, спрогнозировано для вариантов без доступной литературы по их биофизическим характеристикам).
    2. Классифицируйте варианты по их расположению в аминокислотной последовательности и третичной структуре. Добавьте параметры структурной классификации (например, локализацию в альфа-спиралях, спиралях, бета-листах, внеклеточных, внутриклеточных или трансмембранных доменах, выстилание пор, связывание агонистов, белок-белковые взаимодействия) в кадр данных и предоставьте информацию для каждого варианта в отношении их аминокислотного положения.
    3. Классифицируйте варианты по их расстоянию до центра мембраны и оси пор. Добавьте расстояние до оси пор и расстояние до параметров центра мембраны на кадре данных.
    4. Анализ корреляции между структурными и биофизическими параметрами по известным вариантам. По возможности оцените прогнозируемые варианты относительно полученных корреляций.
  3. Построение моделей синапсов и нейронов
    1. Используйте Brian245, нейронный симулятор с открытым исходным кодом, разработанный на Python для моделирования и симуляции спайковых нейронных сетей, для создания многокомпонентной биофизической модели ГАМКергического синапса на пирамидальном нейроне гиппокампа, основанном на многокомпонентной проводимости.
    2. Спроектируйте модель на основе проводимости, определив кинетику стробирования ионных каналов, пассивные и активные параметры, а также постсинаптическую проводимость. Определите модель, основанную на проводимости, как показано в дополнительном файле 2, в котором описаны уравнения, используемые в модели.
      1. Емкость мембраны (Cm) установить равной 1 мкФ/см2 и внутриклеточное сопротивление (Ra) равной 200 Ω см.
      2. Используйте модифицированные проводимости типа Ходжкина-Хаксли для пирамидных нейронов гиппокампа39 с gL= 0,0003 См/см2, gK= 0,036 См/см2, EL = -76,5 мВ, ENa = 50 мВ, EK = -90 мВ.
      3. Отрегулируйте распределение плотности каналов NaV по gNa как 0,05 См/см2 для сомы, 0,5 См/см2 для начального сегмента аксона (AIS) и узла Ранвье (NR) и 0,005 См/см2 для дендритов. Установите gK и gNa как 0 в миелинизированных сегментах.
      4. Постройте кинетику стробирования ионного канала для NaV и KV , как описано в дополнительном файле 2.
      5. Введите синаптические токи (Isyn) как сумму всех глутаматергических и ГАМКергических синапсов в одном отсеке. Включите в глутаматергический ток (IGLU) как быстрый ток, опосредованный рецептором AMPA (IAMPA), так и медленный ток, опосредованный рецептором NMDA (INMDA). Включайте только быстрый ток, опосредованный рецепторомГАМК А, в ГАМКергический ток (IГАМК). Предположим, что при каждом пресинаптическом всплеске в синапс выделяется постоянное количество глутамата; Таким образом, активация рецепторов зависит от времени спайка (sAMPA и sNMDA), а общая проводимость рецепторов (gAMPA и gNMDA) отражает количество глутамата, которое высвобождается каждым событием.
      6. Используйте синаптическую модель, как описано в Дополнительном файле 2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное объяснение уравнений см. в дополнительном файле 2 , описывающем уравнения, используемые в модели.
    3. Получить экспериментально измеренный диаметр сомы и нейритов, а также длину каждого нейритного отсека и характер ветвления из предыдущей литературы46,47. Сведите реальную морфологию нейронов к многокомпартментной модели, разделив клетку на несколько компартментов, что точно сохранит основную ветвящуюся структуру и поддерживает двустороннюю симметрию.
    4. Установите морфологические (длина и диаметр сегмента; т.е. d_soma: 30 мкм; l_AH: 5 мкм; d_AH_i: 1,5 мкм; d_AH_f: 1,3 мкм; l_AIS: 40 мкм; d_axon: 1 мкм; l_myseg: 100 мкм; l_NR: 2 мкм; l_AxTer: 4 мкм; d_AxTer: 2 мкм; l_approx: 100 мкм; l_apmed: 100 мкм; l_apdis: 200 мкм; d_approx_i: 4 мкм; d_approx_f: 3 мкм; d_apmed : 2 мкм; d_apdis: 2 мкм; l_apLM: 70 мкм; d_apLM: 2 мкм; l_nAcDbasal: 400 μм; d_nAcDbasal: 1,4 мкм; l_nAcDbasal_stem: 20 мкм; d_nAcDbasal_stem: 1,5 мкм) и биофизические параметры (как указано в разделе 2.3.2) для каждого компартмента модели пирамидального нейрона 46,47, как также подробно описано в скрипте Python (Дополнительный файл 3: GABAAvar.py).
    5. Определите биофизические параметры для модели ГАМКергического синапса путем оценки контрольных измерений дикого типа, полученных на шаге 2.1.1.
  4. Проектирование топологии модели нейрона и присвоение морфологических и биофизических параметров, что включает в себя уточнение пространственного расположения и взаимосвязей компартментов, на основе ранее полученной морфологической и ветвящейся информации. Назначьте соответствующие морфологические (например, длина и диаметр сегмента) и биофизические параметры (раздел 2.3.2) каждому отсеку модели, как указано в дополнительном файле 3: GABAAvar.py.
  5. Построение синапсов и инжекция тока
    1. Создайте пресинаптическую активность с помощью SpikeGeneratorGroup (класс из библиотеки Brian2), как указано в "GABAAvar.py" (дополнительный файл 3). Подключите генератор спайков к целевому отсеку модельного нейрона с помощью класса Synapses для моделирования синаптических связей.
    2. Установите устойчивый постоянный ток (Iinj) равным 0,85 нА и поместите его в сому, чтобы имитировать подпороговую активность, вызванную базовой нагрузкой ионного тока в данный момент времени, как описано в дополнительном файле 3: GABAAvar.py.
  6. Чтобы создать записывающие мониторы, записывайте трассировки напряжения из целевых отсеков с помощью StateMonitor.
  7. Постройте и запустите сеть.
    1. Постройте сеть с помощью модели нейрона, подключений и мониторов с помощью функции «Сеть».
    2. Установите временной шаг моделирования с помощью defaultclock.dt (например, 0,01 мс).
    3. Запустите моделирование в сети с помощью network.run(T*ms), где в примере T установлено как 1 000 мс.
  8. Исследование влияния миссенс-мутаций рецептора ГАМКА
    1. Определите влияние каждой миссенс-мутации на кинетику канала с помощью биофизических параметров, собранных на шаге 2.1.1.
    2. Запустите стимуляцию, изменив эти параметры, и постройте график результатов с помощью "matplotlib.pyplot", как указано в "GABAAvar.py" (Дополнительный файл 3).
  9. Тестирование комбинаций параметров для анализа изменений в схемах стрельбы и скоростях. Построение графика результатов для сравнения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании используется многоуровневый подход для прогнозирования и характеристики патогенных вариантов в γ2-субъединице рецептора ГАМКА , ключевого компонента патофизиологии эпилепсии. Благодаря использованию прогностических моделей, молекулярного моделирования, эволюционного сохранения, структурного исследования, корреляционного анализа и нейронного моделирования этот подход улучшает классификацию вариантов, что имеет большое значение для исследований эпилепсии и, во...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применяя комбинацию вычислительной генетики, молекулярного моделирования и нейронного моделирования, подход, представленный в этой статье, может улучшить классификацию вариантов рецептора ГАМКА, предлагая ценные идеи как для исследований эпилепсии, так и для клинического применения. Представлен всесторонний анализ для идентификации и приоритизации прогнозируемых патогенных мутаций, который расширен в рамки, которые потенциально устраняют разрыв между влиянием вариантов на бело...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, связанного с данной работой.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Чаглу Коджу за помощь в построении модельного нейрона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Брайан2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, France; Имперский колледж Лондона, Великобритания2.8.0.4Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP сервер   ООО «Генос Биоинформатика», СШАВерсия 3.0Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
НАДЕЖДА   Центр молекулярной и биомолекулярной информатики CMBI, Университет Радбуда, Нидерланды 1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview   Университет Данди, ВеликобританияСП2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Записная книжка JupyterПроект Jupyter, СШАhttps://jupyter.org/install 
ФитонPython Software Foundation, США3.13https://www.python.org/downloads/
Проттер   ETH Zurich, ШвейцарияВерсия 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
Р Фонд статистических вычислений R, СШАR версия 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioPosit software, PBC, СШАRStudio 2023.12.1+402 Релиз "Океанский шторм"https://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles