Методическая статья

Разработка и оценка моделей внутриклеточных инфекций золотистого стафилококка

DOI:

10.3791/67834

⸱

17 января 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Research Institute, Southwest University, 2National Engineering Research Center of Immunological Products, Third Military Medical University, 3School of Pharmacy, University of South China

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Золотистый стафилококк (S. aureus) обладает способностью распространяться по всему организму, вызывая стойкие и рецидивирующие инфекции. Чтобы лучше понять эти процессы, в данном исследовании была создана модель внутриклеточной инфекции S. aureus. Эта модель обеспечит важнейшую основу для исследования механизмов внутриклеточных инфекций.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus может вторгаться и сохраняться в клетках хозяина, включая иммунные клетки, что позволяет ему уклоняться от иммунного обнаружения и клиренса. Эта внутриклеточная персистенция способствует развитию хронических и рецидивирующих инфекций, осложняя лечение и продлевая болезнь. Следовательно, существует острая потребность в модели внутриклеточной инфекции для лучшего понимания, профилактики и лечения инфекций, вызванных S. aureus. Это исследование показало, что антибиотики эффективно устраняют внеклеточные бактерии, но не могут уничтожить те, которые проникли в клетки. Таким образом, была установлена стабильная внутриклеточная инфекция in vitro от RAW264.7, инфицированного S. aureus и совместного культивирования их с антибиотиками. Впоследствии была создана модель внутриклеточной инфекции у мышей путем введения перитонеальных макрофагов, содержащих внутриклеточную инфекцию. Ванкомицин эффективно выводил бактериальную нагрузку у мышей, пораженных планктоником S. aureus; Тем не менее, он был неэффективен против мышей, инфицированных равным или меньшим уровнем внутриклеточных бактерий в перитонеальных макрофагах. Это указывает на то, что модель внутриклеточной инфекции S. aureus была успешно создана, предлагая потенциальные идеи для профилактики и лечения внутриклеточных инфекций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus является высококонтагиозным патогеном, который может вызывать ряд инфекций, включая инфекции кожи и мягких тканей, сепсис, менингит, пневмонию и эндокардит1. Клиническое неправильное использование антибиотиков привело к повышению резистентности S. aureus и появлению метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA), который представляет значительную угрозу общественному здравоохранению во многих странах2.

Хотя S. aureus традиционно не классифицируется как внутриклеточный патоген, новые данные свидетельствуют о том, что он может устойчиво колонизировать клетки-хозяева после инвазии. Способность S. aureus выживать внутриклеточно в фагоцитах хозяина все чаще признается в качестве механизма, способствующего метастатической инфекции и ее распространению по всему хозяину 4,5,6. S. aureus выделяет различные факторы вирулентности, которые создают иммунную среду, способствующую его выживанию и затрудняющую способность хозяина полностью его ликвидировать7. Дополнительный регулятор гена (agr) и стафилококковые хелперные элементы (Sae) являются двумя важными регуляторами вирулентности, которые тесно связаны с выживаемостью Staphylococcus aureus в фагоцитах 8,9. Система agr представляет собой механизм чувства кворума, который регулирует экспрессию многочисленных факторов вирулентности у S. aureus. Он контролирует выработку токсинов и других факторов, способствующих выживанию и распространению бактерий. Во время внутриклеточной инфекции система AGR играет решающую роль в регуляции факторов вирулентности, которые необходимы для способности бактерии уклоняться от иммунных реакций хозяина и выживать в клетках хозяина. Исследования показали, что система AGR влияет на способность бактерии убегать от фагосом и сохраняться в макрофагах. Отсутствие agr может привести к снижению выживаемости бактерий в клетках хозяина и снижению вирулентности10,11. Система Sae представляет собой двухкомпонентную регуляторную систему, которая контролирует экспрессию нескольких факторов вирулентности в S. aureus. Он участвует в регуляции токсинов и ферментов, которые способствуют способности бактерии проникать в ткани хозяина и повреждать их. Система Sae также играет решающую роль во внутриклеточном выживании S. aureus. Он влияет на способность бактерии сопротивляться уничтожению фагоцитами хозяина и уклоняться от аутофагической деградации12,13.

Когда патогены вторгаются, макрофаги выполняют фагоцитарные функции, которые могут поглощать и убивать чужеродные патогены и активировать адаптивный иммунный ответ14. Большинство вторгшихся бактерий фагоцитируются макрофагами, которые затем активируют различные механизмы уничтожения для их уничтожения. Тем не менее, некоторые бактерии S. aureus могут выживать в макрофагах, что приводит к стойкому инфицированию хозяина. В дополнение к бактериальным белкам, хозяин также влияет на выживание и пролиферацию S. aureus в макрофагах, секретируя цитокины 15,16,17. Некоторые исследования показывают, что S. aureus может уклоняться от деградации, пребывая в аутофагосомах, создавая внутриклеточную нишу, способствующую распространению18. S. aureus избегает аутофагической деградации, блокируя поток аутофагии (например, LC3-II, p62) и повышая pH в аутолизосомах после инвазии макрофагов19. Это уклонение от иммунитета достигается за счет регуляции факторов вирулентности S. aureus и аутофагии, что приводит к стойким, скрытым инфекциям.

Избавление от внутриклеточных инфекций S. aureus имеет решающее значение для лечения персистирующих и латентных инфекций в клинической практике. В настоящее время антибиотики являются основным средством лечения инфекций S. aureus, а ванкомицин служит последней линией защиты от инфекций MRSA20,21. Тем не менее, многочисленные исследования показали, что существующие антибиотики неэффективны для устранения внутриклеточного S. aureus, как invivo, так и in vitro 22,23,24.

В настоящее время не существует единого стандарта для различных моделей внутриклеточной инфекции S. aureus 25,26,27, так как условия каждой модели существенно различаются. Следовательно, те же критерии не могут быть применены для оценки эффективности этих моделей. В этом исследовании мы создали универсальную модель внутриклеточной инфекции золотистого стафилококка путем оптимизации условий эксперимента. Эта модель предлагает большее удобство по сравнению с другими, так как она позволяет сначала заражать бактерии в клетки in vitro, а затем доставлять эти инфицированные клетки в организм.

Чтобы лучше понять механизмы внутриклеточной инфекции S. aureus и разработать родственные препараты, мы создали модели in vitro и in vivo . Была успешно создана стабильная модель внутриклеточной инфекции in vitro путем инфицирования RAW264.7 и их совместного культивирования с антибиотиками. Затем экстрагировали перитонеальные макрофаги, из которых формировались внутриклеточные инфекции. Модель внутриклеточной инфекции у мышей была создана путем введения этих перитонеальных макрофагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные животные, 6-8-недельные самки мышей BALB/c без специфических патогенов (SPF), были приобретены в Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Пекин, Китай). Все исследования на животных были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета и проводились в соответствии с институциональной и национальной политикой и рекомендациями по использованию лабораторных животных. Мышей содержали и вакцинировали в учреждениях SPF и обеспечивали свободный доступ к стерильной пище и воде. Животные были случайным образом разделены на группы и им было предоставлено время адаптации не менее чем за 7 дней до начала экспериментов.

1. Подготовка к S. aureus

  1. Извлечение штамма: Возьмите пробирку с замороженным MRSA252, прижгите и охладите инокуляционное кольцо для получения кольца бактериального раствора, инокулируйте бактерии на пластинах триптического соевого агара (TSA) (см. Таблицу материалов) методом стречковой пластины28 и культивируйте в течение ночи при 37 °C.
  2. Бактериальная активация: На следующий день возьмите одну колбу шейкера объемом 50 мл и добавьте 20 мл среды Триптический соевый бульон (TSB) (см. Таблицу материалов). Выберите одну колонию с наконечником для дозатора объемом 10 мкл и добавьте ее в шейкер. Инкубируйте колонии в течение ночи при 220 об/мин, 37 °C.
  3. Вторичная активация: На следующий день возьмите одну колбу шейкера объемом 50 мл, содержащую 15 мл среды TSB. Удалите 200 μL бактериального раствора из шейкера, содержащего первые активированные бактерии, добавьте в одну новую колбу, содержащую 20 мл среды TSB, и инкубируйте при 220 об/мин, 37 °C в течение 4 часов.
  4. Соберите вторичный активированный бактериальный раствор в центрифужную пробирку объемом 50 мл, центрифугируйте при 3000 x g в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Ресуспендируйте осажденные бактерии в 10 мл физиологического раствора и центрифугируйте при 3000 x g в течение 10 минут. Повторите этот шаг 2 раза.
  6. Измерьте значение OD600 в бактериальном растворе и отрегулируйте его до 1,0 с помощью физиологического раствора. В это время количество бактерий MRSA252 в этом эксперименте составляло 1,0 x 109 КОЕ/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальный раствор добавляют в среду без антибиотиков и разбавляют до нужной концентрации; Все бактерии, использованные в данном эксперименте, были получены вышеописанным методом.

2. Создание модели внутриклеточной инфекции in vitro

  1. Получение ячеек RAW264.7
    Примечание: Клеточные линии, использованные в этом исследовании, были получены из ATCC. Все клеточные линии дали отрицательный результат на контаминацию микоплазмами. Все эксперименты проводились на клетках в фазе логарифмического роста.
    1. Извлеките клетки из жидкого азота и разморозьте их на водяной бане при температуре 37 °C.
    2. Поместите клетки RAW264.7 в центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте 2 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM; см. Таблицу материалов) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (см. Таблицу материалов), пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл; см. Таблицу материалов; полная среда) при 37 °C при 5%CO2. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
    3. Затравить 3 x 106 клеток RAW264.7 в чашки 100 мм с 10 мл полной среды. Хранить в течение 12 часов в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C при 5%CO2 , чтобы слияние клеток составляло от 50% до 60%.
  2. Внутриклеточная инфекция in vitro
    1. Возьмите 10 μл клеточной суспензии и добавьте ее в клеточный счетчик, чтобы рассчитать концентрацию клеток. Подсчитайте и засейте 2 x 105 клеток RAW264.7 в 24-луночный планшет (см. Таблицу материалов), используя 1 мл готовой среды для каждой лунки, и выдержите ее в инкубаторе для клеточных культур в течение 10-12 часов.
    2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте в каждую лунку 1 мл полной среды, содержащей 2 раствора бактерий по10 6 КОЕ (шаг 1.6). Поместите его в инкубатор для клеточных культур на 2 ч. Множественность зараженных инфекций MRSA252
      (MOI) равно 10. (Для проверки корреляции между различными значениями множественности инфекции (MOI) и фагоцитозом бактерий клетками мы создали экспериментальные группы со значениями MOI 20, 30, 40 и 50).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовая среда, используемая при инфицировании клеток, не содержит пенициллина и стрептомицина.
    3. Удалите надосадочную жидкость и промойте ячейки 2 раза с помощью PBS (см. Таблицу материалов). Добавьте 800 мкл на лунку DMEM со 100 мкг/мл гентамицина (см. Таблицу материалов) и поместите в камерный инкубатор при 37 °C при 5%CO2 на 2 ч.
  3. Оценка модели внутриклеточной инфекции in vitro
    1. Внутриклеточный анализ S. aureus на уничтожение
      1. Соберите элементы RAW264.7 (шаги 2.2.2 и 2.2.3) по отдельности в центрифужные пробирки. Промойте ячейки 2 раза PBS, добавьте 0,1% раствор Triton X-100 (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку в течение 5 минут и соберите лизат в центрифужные пробирки.
      2. Используйте PBS для последовательного разбавления лизата. Возьмите 20 μL лизата и добавьте его в микроцентрифужную пробирку, содержащую 180 μL PBS, затем тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Разводите пошагово, следуя этой процедуре. Нанесите каждое разведение лизата на планшеты TSA и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Подсчитайте колонии на планшетах TSA на предмет лизата (рисунок 1A).
        Примечание: Кроме того, мы исследовали оптимальные экспериментальные условия для внутриклеточного инфицирования MRSA252 в перитонеальных макрофагах. Бактериальная нагрузка в перитонеальных макрофагах, инфицированных MRSA252 и получавших различные концентрации гентамицина, показана на рисунке 1В, в то время как бактериальная нагрузка после обработки гентамицином в дозе 100 мкг/мл в течение разного периода времени показана на рисунке 1В.
      3. Разведите надосадочную жидкость и лизат последовательно с PBS, как описано в разделе 2.3.1.2, и наблюдайте за колониями на планшетах TSA на наличие надосадочной жидкости и лизата (рисунок 2A).
    2. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM)
      1. Развести клетки RAW264.7 (шаг 2.2) до 2 x 105 клеток/мл на конфокальной чашке Петри (см. Таблицу материалов) и поместить их в клеточный инкубатор для адгезии на ночь при 37 °C при 5%CO2. Добавьте 1 мл готовой среды, содержащей 2 x 106 КОЕ и 4 x 106 бактериального раствора (шаг 1.6) в каждую конфокальную чашку Петри и поместите ее в клеточный инкубатор на 2 ч, сделав MOI 10 и 20 соответственно.
      2. Удалите надосадочную жидкость и промойте клетки 3 раза PBS, добавьте 100 мкг/мл гентамицина DMEM в течение 2 ч и удалите внеклеточные бактерии. Затем удалите надосадочную жидкость и промойте ячейки 2 раза PBS, добавьте рабочую жидкость DIL (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут в темноте.
      3. Удалите рабочую жидкость DIL и промойте 3 раза PBS, а затем зафиксируйте 4% раствором параформальдегида (см. Таблицу материалов) в течение 20 минут.
      4. Удалить раствор параформальдегида и 3 раза промыть PBS, добавить краситель DAPI (см. Таблицу материалов) и выдержать 5 минут в темноте. Удалите раствор красителя DAPI и промойте 5 раз PBS. Используйте CLSM для наблюдения за ячейками (рис. 2B).
        Примечание: В данной работе использован MRSA252 сконструирован зеленый флуоресцентный белок (GFP), который был сконструирован с использованием метода гомологичной рекомбинации29.

3. Создание модели внутриклеточной инфекции in vivo

  1. Получение перитонеальных макрофагов у мышей
    1. Приготовьте 6% крахмальный бульон. В соответствии с массовым соотношением 3:10:5 (масса/масса) добавьте в стеклянную емкость последовательно три вида вспомогательных веществ (порошок говяжьего экстракта, триптон, хлорид натрия; см. Таблицу материалов). Добавьте 1 л ddH2O в стеклянную емкость, перемешайте, чтобы она растаяла, и нагрейте в микроволновой печи. Добавьте растворимый крахмал (см. Таблицу материалов) с массовым соотношением 6, перемешайте до плавления и обеспечьте автоклавирование стеклянной тары при 121 °C в течение 30 минут. Хранить в холодильнике при температуре 4 °C, пока он не превратится в пасту.
    2. Соберите перитонеальные макрофаги мыши, следуя инструкциям, описанным ниже.
      1. Выберите двух мышей Balb/c. Используйте левую руку, чтобы схватиться за шею мыши и управлять хвостом. Переверните мышь и опустите голову вниз, а живот вверх (рисунок 3А). Введите внутрибрюшинное введение 6% крахмального бульона по 3 мл на мышь (рис. 3В).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Под действием силы тяжести органы в брюшной полости будут падать назад к грудной клетке, предотвращая повреждение других органов шприцем.
      2. Через 72 ч обезболите мышей 3% изофлураном, а затем принесите их в жертву из-за вывиха шейки матки. Продезинфицируйте их 75% этиловым спиртом. С помощью офтальмологических ножниц разрежьте брюшную полость мыши, чтобы полностью обнажить брюшину (рисунок 4A-C).
      3. Введите мышам 10 мл среды DMEM для промывания брюшной полости путем внутрибрюшинной инъекции (рис. 4D). После введения DMEM в брюшную полость мышей осторожно растирайте брюшную полость мыши в течение примерно 1 минуты, чтобы более тщательно промыть брюшную полость. С помощью шприца наберите жидкость для промывания в центрифужную пробирку объемом 50 мл (рисунок 4E).
      4. Центрифугируйте жидкость для промывания при давлении 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
      5. Используйте 10 мл DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл; полная среда) для обдува и отсасывания собранных клеток, подсчитайте их и разбавьте концентрацию клеток до 2 x 106/мл и нанесите на 6-луночные планшеты (см. Таблицу материалов), 1 мл на лунку.
      6. Поместите 6-луночный планшет при температуре 37 °C с 5%CO2, инкубируйте в течение 4 часов, а затем удалите надосадочную жидкость. Промойте клетки 2 раза стерильным PBS и заквашивайте в течение ночи 1 мл DMEM на лунку при 37 °C при 5%CO2.
  2. Приготовление внутриклеточных бактериальных
    1. Инкубируйте перитонеальные макрофаги (шаг 3.1.2) с MRSA252 в течение 2 ч. Удалите надосадочную жидкость и промойте ячейки 2 раза с PBS. Добавьте полную среду DMEM со 100 мкг/мл гентамицина (1 мл на лунку) и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C при 5%CO2.
    2. Удалите надосадочную жидкость и промойте ячейки 3 раза с PBS. С помощью скребка для клеток соберите перитонеальные макрофаги мыши в центрифужные пробирки объемом 50 мл, центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут. Внутриклеточные бактерии MRSA252 были успешно подготовлены в перитонеальных макрофагах.
    3. Для расчета внутриклеточных бактерий к перитонеальным макрофагам, инфицированным внутриклеточными MRSA252, добавляют лизоцим (10 мкг/мл, см. таблицу материалов) при 37 °С в течение 10 мин и затем промывают PBS 2x. Затем добавьте 1 мл PBS для ресуспендирования клеток. Лизируйте клетки, добавив 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут.
    4. Разбавьте лизис сериями разведений и капните его на планшет TSA. Культивировать в течение ночи при 37 °C. Рассчитайте внутриклеточные бактерии MRSA252 в перитонеальных макрофагах, которые составляли 1,8 x 106 КОЕ на мышь, подсчитав колонии бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда скребок для клеток собирает клетки, действие должно быть щадящим. Клетки соскабливают в одном направлении, чтобы избежать поломки клеток, которая может повлиять на последующий эксперимент.
  3. Внутриклеточная бактериальная инфекция у мышей
    1. Случайным образом разделите 20 мышей Balb/c на четыре группы (n=5, рисунок 5A).
    2. Для группы I внутривенно вводят 3 x 106 КОЕ планктонных MRSA252 на мышь. Для группы II внутривенно вводят 3 x 106 КОЕ планктонных MRSA252 и ванкомицин (110 мг/кг; см. Таблицу материалов) на каждую мышь. Для группы III внутриклеточные бактерии (подготовленные на шаге 3.2) вводят внутривенно. Для группы IV внутривенно вводят внутриклеточные бактерии (приготовленные на шаге 3.2) и ванкомицин (110 мг/кг) на каждую мышь.
    3. Поместите мышей под инфракрасную физиотерапевтическую лампу до тех пор, пока их хвостовые вены не расширятся.
    4. Внутривенно ввести 3 x 106 КОЕ планктонных MRSA252 на каждую мышь I и II группы. Внутривенно вводят внутриклеточные бактерии (приготовленные на шаге 3.2) на каждую мышь III и IV групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании шприца для сбора жидкости, содержащей внутриклеточные бактерии, рекомендуется сначала аккуратно равномерно перемешать жидкость с помощью пипетки, чтобы обеспечить постоянный уровень инфекции у всех мышей.
    5. Через 30 мин внутривенно ввести ванкомицин в группу II и группу IV каждой мыши.
  4. Оценка модели внутриклеточной инфекции in vivo
    1. Оцените модель внутриклеточной инфекции мышей путем подсчета колонизации бактерий в почках. Через 24 ч после инъекции обезболите мышей 3% изофлураном и принесите их в жертву путем вывиха шейки матки. Продезинфицируйте их в 75% этиловом спирте.
    2. Обездвижите мышей, одной рукой приподнимайте кожу живота пинцетом, другой рукой разрежьте кожу живота мыши офтальмологическими ножницами, найдите почки в брюшной полости, и полностью обнажите почки. Поместите их в PBS.
    3. Добавьте 1 мл PBS в трубку для измельчения тканей. Переложите почки от каждой мыши в отдельные шлифовальные трубки и измельчите до тех пор, пока не останется твердой ткани. Разлейте гомогенизированную ткань по отдельным пробиркам EP и пометьте каждую пробирку соответствующей идентификацией мыши.
    4. Используйте PBS для последовательного разбавления гомогената ткани. Нанесите каждое разведение на отдельные планшеты TSA и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C. Подсчитайте колонии и проанализируйте данные (рисунок 5B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модели внутриклеточной инфекции S. aureus были успешно созданы как in vitro , так и in vivo. За счет оптимизации экспериментальных условий для фагоцитоза и увеличения концентрации и продолжительности лечения антибиотиками некоторые виды S. aureus выжили в пределах макрофагов (рис. 1). Для дальнейшей оценки антибиотикорезистентности S. aureus макрофаги, инфицированные MRSA252, обрабатывали антибиотиками в течение 2 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, как факультативный внутриклеточный патоген, может проникать и выживать в различных типах клеток, используя эту способность для уклонения от антибиотиков и иммунных реакций вовремя инфекции. Это исследование позволило создать модель внутриклеточной инфекции S. aureusin vivo , чтобы обеспечить основу для изучения механизмов внутриклеточной инфекции патогена. Путем изучения влияния различных значений MOI на фагоцитоз макрофагов S. aur...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC, грант No32300779, NO.32270989), Фондом естественных наук Чунцина (CSTB2022NSCQ-MSX0156), Исследовательским проектом по науке и технике Комиссии по образованию Чунцина (KJQN202312802) и Китайским фондом постдокторантуры (2024M754250).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночная пластинаCorning Incorporated, США3524
4 % раствор параформальдегидаBBI, ВеликобританияE672002-0500
6-луночная пластинаCorning Incorporated, США3516
Порошок говяжьего экстрактаBBI, ВеликобританияA600114-0500
Оборудование для биологически опасной безопасностиHeal force, КитайVS-1300L-u
Клеточный инкубаторESCO, СингапурCCL-170B-8
Скребок для клетокГнездо710001
Центрифуга M1416RRWD, КитайM1416R
Центрифужная трубкаGuanghou Labselect, КитайCT-002-50A Конфокальный
лазерный сканирующий микроскоп (CLSM)Zeiss,Германия 880
Конфокальная чашкаПетриBiosharp, КитайBS-20-GJM
DAPI красительШанхай Beyotime, КитайC1006
DIL рабочая жидкостьШанхай Бейотим, Китай C1991S
Dulbecco' s Модифицированный Eagle MediumThermo Gibco, СШАC11995500BT
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаHycloneSV30208.02
GentamycinShanghai Sangon, КитайB540724-0010
ИнкубаторShanghai Hengzi, КитайHDPF-150
LysozymeBeijing Solarbio, КитайL9070
MRSA252Third Military Медицинский университет, Китайnull
MRSA252(GPF)Третий военно-медицинский университет, Китайnull
пенициллин и стрептомицинShanghai Beyotime, Китай C0222
Раствор фосфатного буфераШанхай Бейотим, Китай ST476
Физиологический растворСычуань Келунь, КитайНулевой
хлорид натрияШанхай Маклин, КитайS805275
Растворимый крахмалШанхай Сангон,Китай A500904-0500
Triton X-100Шанхай Бейотим, Китай P0096-100мл
Триптический соевый агар (TSA) тарелкиBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,Китай02-130
Триптический соевый бульон (TSB) средаBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,Китай02-102K
ТриптонОКСОИД, ВеликобританияLP0042B
ВанкомицинШанхай Бейотим, Китай  ST2807-250mg
RAW264.7 клеткаСША, ATCCноль

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutton, J. A. F., et al. Staphylococcus aureus cell wall structure and dynamics during host-pathogen interaction. PLoS Pathog. 17 (3), e1009468(2021).
  2. Yang, H., et al. Lateral flow assay of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using bacteriophage cellular wall-binding domain as recognition agent. Biosens Bioelectron. 182, 113189(2021).
  3. Howden, B. P., et al. Staphylococcus aureus host interactions and adaptation. Nat Rev Microbiol. 21 (6), 380-395 (2023).
  4. Guo, H., et al. Biofilm and small colony variants-an update on Staphylococcus aureus strategies toward drug resistance. Int J Mol Sci. 23 (3), 1241(2022).
  5. Huitema, L., et al. Intracellular escape strategies of Staphylococcus aureus in persistent cutaneous infections. Exp Dermatol. 30 (10), 1428-1439 (2021).
  6. Pidwill, G. R., et al. Clonal population expansion of Staphylococcus aureus occurs due to escape from a finite number of intraphagocyte niches. Sci Rep. 13 (1), 1188(2023).
  7. Wang, M., et al. Autophagy in Staphylococcus aureus infection. Front Cell Infect Microbiol. 11, 750222(2021).
  8. Arya, R., et al. Identification of an antivirulence agent targeting the master regulator of virulence genes in Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1268044(2023).
  9. Münzenmayer, L., et al. Influence of sae-regulated and agr-regulated factors on the escape of Staphylococcus aureus from human macrophages. Cell Microbiol. 18 (8), 1172-1183 (2016).
  10. Chin, D., et al. Staphylococcus lugdunensis uses the agr regulatory system to resist killing by host innate immune effectors. Infect Immun. 90 (10), e0009922(2022).
  11. Podkowik, M., et al. Quorum-sensing agr system of Staphylococcus aureus primes gene expression for protection from lethal oxidative stress. Elife. 12, RP89098(2024).
  12. Purves, J., et al. Air pollution induces Staphylococcus aureus usa300 respiratory tract colonization mediated by specific bacterial genetic responses involving the global virulence gene regulators agr and sae. Environ Microbiol. 24 (9), 4449-4465 (2022).
  13. Wittekind, M. A., et al. The novel protein scra acts through the saers two-component system to regulate virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol. 117 (5), 1196-1212 (2022).
  14. Pidwill, G. R., et al. The role of macrophages in Staphylococcus aureus infection. Front Immunol. 11, 620339(2020).
  15. Lang, J. C., et al. A photoconvertible reporter system for bacterial metabolic activity reveals that Staphylococcus aureus enters a dormant-like state to persist within macrophages. mBio. 13 (5), e0231622(2022).
  16. Li, M., et al. Interactions between macrophages and biofilm during Staphylococcus aureus-associated implant infection: Difficulties and solutions. J Innate Immun. 15 (1), 499-515 (2023).
  17. Sun, L., et al. Staphylococcal virulence factor hlgb targets the endoplasmic-reticulum-resident e3 ubiquitin ligase amfr to promote pneumonia. Nat Microbiol. 8 (1), 107-120 (2023).
  18. Mulcahy, M. E., et al. Manipulation of autophagy and apoptosis facilitates intracellular survival of Staphylococcus aureus in human neutrophils. Front Immunol. 11, 565545(2020).
  19. Cai, J., et al. Staphylococcus aureus facilitates its survival in bovine macrophages by blocking autophagic flux. J Cell Mol Med. 24 (6), 3460-3468 (2020).
  20. Ahmad-Mansour, N., et al. Staphylococcus aureus toxins: An update on their pathogenic properties and potential treatments. Toxins. 13 (10), 677(2021).
  21. Davis, J. S., et al. How I manage a patient with MRSA bacteremia. Clin Microbiol Infect. 28 (2), 190-194 (2022).
  22. Fait, A., et al. Staphylococcus aureus response and adaptation to vancomycin. Adv Microb Physiol. 85, 201-258 (2024).
  23. Kelly, J. J., et al. Measurement of accumulation of antibiotics to Staphylococcus aureus in phagosomes of live macrophages. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (3), e202313870(2024).
  24. Rowe, S. E., et al. Recalcitrant Staphylococcus aureus infections: Obstacles and solutions. Infect Immun. 89 (4), e00694-e00720 (2021).
  25. Lehar, S. M., et al. Novel antibody-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus. Nature. 527 (7578), 323-328 (2015).
  26. Peyrusson, F., et al. Intracellular Staphylococcus aureus persisters upon antibiotic exposure. Nat Commun. 11 (1), 2200(2020).
  27. Pollitt, E. J. G., et al. Staphylococcus aureus infection dynamics. PLoS Pathog. 14 (6), e1007112(2018).
  28. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. 11 (63), e3064(2012).
  29. Qin, L., et al. Antibody-antibiotic conjugate targeted therapy for orthopedic implant-associated intracellular S. aureus infections. J Adv Res. 65, 239-255 (2024).
  30. Andie, S. L., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nat Rev Dis Primers. 31 (4), 18034(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MRSA 252

Похожие статьи