Методическая статья

Анализ экспрессии онкогенов с изменениями pH в линии протоковых клеток поджелудочной железы

DOI:

10.3791/67843

⸱

11 апреля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Research Centre, Asian Healthcare Foundation, AIG Hospitals, 2Department of Biochemistry, Osmania University, 3Department of Medical Gastroenterology, Asian Institute of Gastroenterology (AIG) Hospitals

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании описан протокол изучения влияния измененного pH на экспрессию онкогена с помощью анализа РНК-секвенирования линии протоковых клеток поджелудочной железы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Четвертая по значимости причина смертности, связанной с раком, протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), имеет 12% пятилетнюю выживаемость. Это заболевание имеет плохой прогноз и характеризуется жестким стромальным микроокружением, что представляет собой ощутимую проблему в его лечении. Пациенты с хроническим панкреатитом имеют в 10 раз больший риск развития PDAC; У этих пациентов рН протоков снижается с рН 8,0 до рН 6,0 из-за недостаточности бикарбоната и воспалительной среды. Наша цель состояла в том, чтобы понять роль кислой среды, наблюдаемой при хроническом панкреатите, на экспрессию онкогенов в линии протоковых клеток поджелудочной железы.

Таким образом, 80% сливающихся эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы человека инкубировали при pH от 6,0 до pH 7,2 в течение 6 ч. Общая РНК из клеток была обработана для обогащения общей мРНК в образцах. Экспрессия генов оценивалась с помощью секвенирования нового поколения (NGS) биологических репликатов. С помощью онлайн-инструмента был проведен анализ РНК-секвенирования и идентифицированы дифференциально экспрессируемые гены (ФК < ± 2.0); было 90, 148 и 109 повышенных генов и 20, 14 и 23 пониженных гена при pH 6,0, 6,5 и 7,0 соответственно. Четыре онкогена были повышены при pH 6,0, семь — при pH 6,5 и семь — при pH 7,0. Общими генами, которые были повышены при pH 6,0, pH 6,5 и pH 7,0, были специфичный для клеток лимфоцитов белоктирозинкиназа (LCK) [pH 6,0, FC: 2,93; pH 6,5, FC: 2,93; pH 7,0, FC: 3,32], протоонкоген FGR, тирозинкиназа семейства Src (FGR) [pH 6,0, FC: 4,17; pH 6,5, FC: 5,25; pH 7,0, FC: 5,09], и ArfGAP с доменом SH3, анкириновый повтор и домен PH 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC: 2,37; pH 6,5, FC: 3,84; pH 7,0, FC: 2,51]. Кислая среда вызывает активацию протоонкогенов, что может спровоцировать начало образования опухоли при хроническом панкреатите.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из основных видов рака и занимает четвертое место среди онкологических заболеваний по количеству связанных смертей1. Более высокий уровень смертности очевиден среди пациентов с PDAC, и, согласно последним исследованиям, пятилетняя выживаемость составляет всего 12%. Пациенты с документально подтвержденным хроническим панкреатитом, заболеванием, приводящим к воспалению поджелудочной железы2, более склонны (примерно в 15-16 раз) к развитию PDAC3. Существуют различные типы ЦП с разной этиологией, такие как алкогольный, наследственный и идиопатический ЦП4. Известно, что состояния, которые существуют во время ДЦП, приводят к образованию кальцинированных камней, развитию раковых клеток и даже диабету. Распространенность PDAC высока у пациентов с наследственным хроническим панкреатитом5.

Некоторые физиологические состояния поджелудочной железы у пациентов с ДЦП могут быть полезны для возникновения других заболеваний; к ним относятся воспалительная среда, активные пищеварительные ферменты и кислый pH панкреатического сока6. В области воспаления проводится широкий спектр исследований, так как воспаление создает хаос в нормальном функционировании органа 7,8,9. Тем не менее, дисбаланс в регуляции pH является еще одним явлением, которое может вызвать начало неконтролируемогороста клеток. Сок поджелудочной железы здоровых людей является щелочным, что помогает нейтрализовать кислый химус, вырабатываемый желудком. Напротив, сок поджелудочной железы остается кислым у пациентов с ДЦП из-за недостаточной секреции бикарбоната. Низкий уровень бикарбоната не может полностью нейтрализовать сок, что приводит к образованию слабокислой среды внутри протока11.

Более ранние исследования показывают, что раковые клетки адаптируются к кислой среде и процветают в ней12. В таких случаях условия, существующие в процессе хронического панкреатита, предполагают благоприятную среду для пролиферации и метастазирования этих клеток13. Таким образом, наше исследование было направлено на оценку морфологических изменений в протоковых клетках поджелудочной железы человека и оценку экспрессии онкогенов в слабокислых условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Возрождение клеточной линии

  1. Получить нормальную линию протоковых клеток поджелудочной железы человека (HPDEC/H6C7) и оживить клетки в свежей среде.
    1. Разморозьте ячейки при 37 °C на водяной бане.
    2. Свежеприготовленную готовую среду и процедите ее с помощью шприцевого фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовая среда содержит модифицированную среду Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    3. Добавьте 6 мл готовой среды в свежую коническую пробирку объемом 15 мл, добавьте размороженную клеточную суспензию и тщательно перемешайте.
    4. Центрифугируйте суспензию при 1 800 × г в течение 6 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в гранулу 1 мл питательной среды и аккуратно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда содержит DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пен/стрептококковыми антибиотиками.
    5. Добавьте клетки по каплям в колбу Т-25, содержащую 4 мл питательной среды, и инкубируйте при 37 °С, 5%СО2.

2. Изменение рН питательной среды

  1. Приготовьте 100 мл 0,5 М буферных растворов фосфата натрия со значениями pH 6,0, 6,5 и 7,0, как указано в таблице 1.
  2. Проверьте pH с помощью pH-метра и отрегулируйте его с помощью 1 N HCl/1 M NaOH.
  3. Фильтруйте и стерилизуйте буферы в ламинарном колпаке с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  4. Питательные среды готовят со значениями рН 6,0, 6,5 и 7,0 путем добавления 20 мл стерильного 0,5 М буфера фосфата натрия с соответствующим рН к 80 мл питательной среды.
  5. Добавьте среду с измененным pH к 85-90% сливающихся протоковых клеток поджелудочной железы человека и проверьте морфологические изменения под светлопольным микроскопом с интервалом в 1 ч в течение 6 ч.

3. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения РНК из клеток необходимо использовать стерильные перчатки, а поверхность должна быть обеззаражена с использованием 100% этанола.

  1. Удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS).
  2. Поставьте тарелку на лед, добавьте в лунку PBS, а затем соскребите ячейки скребком для клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавленного PBS должно быть достаточным для покрытия ячеек для скребка. Нет необходимости добавлять большой объем PBS.
  3. Соберите суспензию в свежую пробирку и центрифугируйте ее при давлении 8 000 ×г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Добавьте в гранулу буфер для лизиса, содержащий β-меркаптоэтанол, и пипеткой вверх и вниз в течение 5-10 минут на льду.
  5. Добавьте в лизат равный объем 70% этанола и тщательно перемешайте. Не делайте вихрей.
  6. Добавьте раствор в колонну с кремнеземной мембраной, центрифугируйте при >8 000 ×g в течение 30 с и сбросьте поток.
  7. Добавьте промывочный буфер в образец и центрифугируйте при >8 000 ×г в течение 30 с. Центрифугируйте пустую пробирку в течение 1 минуты при >8 000 ×г.
  8. Добавьте в колонку 30-50 μл воды, не содержащей нуклеаз, и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. Центрифугируйте колонку при >8 000 ×g в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы РНК можно хранить при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

4. РНК-секвенирование/транскриптом

  1. Оценка целостности РНК
    1. Проверьте целостность РНК в биоанализаторе, взяв 1 мкл (25-500 нг) и смешав его с 5 мкл буфера для красителя.
    2. Перемешайте раствор при давлении 500 ×g в течение 1 минуты и кратковременно вращайте.
    3. Запустите одноэтапную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для каждого образца при температуре 72 °C в течение 3 минут, а затем возьмите пробирки и инкубируйте их на льду в течение 2 минут перед анализом с помощью биоанализатора.
  2. Обедненная рРНК
    1. Добавьте 5 г общей РНК, 50 мл буфера для гибридизации и 1-3 л смеси зондов в свежую пробирку для ПЦР.
    2. Выполните следующие этапы: первый этап, денатурация при 70 °C в течение 10 минут; второй этап, гибридизация при 37 °C в течение 20 мин; и инкубация при 37 °C до использования.
    3. В свежую пробирку добавьте 500 мкл магнитных шариков и образец; Поместите смесь на магнитную подставку на 1 минуту, пока раствор не станет прозрачным.
    4. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Извлеките тюбик, промойте шарики, добавив 500 μл воды, не содержащей нуклеаз, и поместите смесь обратно на магнитную подставку на 1 минуту. Удалите надосадочную жидкость, как только раствор станет прозрачным.
    5. Повторите процесс 5-7 раз. Добавьте 200 μL буфера для гибридизации и тщательно перемешайте. Держите пробирки при температуре 37 °C в течение 5 минут.
    6. Добавьте к вышеуказанной смеси 100 μL РНК-зонда, аккуратно перемешайте и инкубируйте смесь при 37 °C в течение 15 минут.
    7. Кратковременно покрутите трубку, прежде чем поместить ее на магнитную подставку на 1 минуту.
    8. Соберите прозрачную надосадочную жидкость, содержащую обедненную рРНК РНК, в свежую пробирку.
  3. Фрагментация РНК
    1. В свежую пробирку для ПЦР добавьте 8-10 мкл обедненной рРНК общей РНК (500 нг/г), 1 мкл 10-кратного буфера и 1 мкл РНКазы III.
    2. Перемешайте раствор, постукивая и быстро вращая.
    3. Поместите пробирки в термоамплификатор на 10 минут при температуре 37 °C.
    4. В свежую пробирку добавьте 5 μL гранул, связывающих нуклеиновые кислоты, а затем добавьте 90 μL концентрата связующего раствора.
    5. Добавьте в указанную смесь 30 мкл фрагментов РНК и 150 мкл 100% этанола. Перемешайте образец с помощью пипетирования 10 раз и инкубируйте его в течение 5 минут при комнатной температуре.
    6. Поместите пробирки на магнитную подставку до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
    7. Промойте шарики 150 μл этанола, пока трубки находятся на магнитной подставке; Дайте смеси постоять 30 секунд, а затем удалите надосадочную жидкость.
    8. Оставьте пробирки на магнитной подставке на 1-2 минуты, чтобы оставшийся этанол испарился.
    9. Добавьте в гранулы 12 мкл предварительно подогретой воды, не содержащей нуклеаз, и перемешайте образец пипетированием 10 раз.
    10. Инкубируйте образец в течение 1 минуты при комнатной температуре. Поместите трубки на магнитную подставку и соберите надосадочную жидкость, как только она станет прозрачной.
  4. Подготовка библиотеки и кДНК
    1. Добавьте 3 мкл фрагментированного образца РНК в ПЦР-пробирку, а затем добавьте 5 мкл гибридизационной смеси. Перемешайте образец с помощью пипетирования несколько раз, а затем кратковременно открутите образец.
    2. Держите пробирки в термоамплификаторе в течение 10 минут при температуре 65 °C, а затем 5 минут при 30 °C.
    3. Добавьте в указанный раствор 10 μл буфера для лигирования и 2 μл смеси ферментов лигирования. Инкубируйте реакцию в термоамплификаторе в течение 1 ч при 30 °C.
    4. Добавьте мастер-смесь обратной транскриптазы в смесь для лигирования и инкубируйте при 70 °C в течение 10 мин с последующей инкубацией на льду.
  5. Амплификация кДНК
    1. Добавьте 6 мкл кДНК (500 нг) в свежую ПЦР-пробирку, а затем добавьте 46 мкл смеси для ПЦР со штрих-кодом из пробирки, содержащей 46 мкл высокоточного фермента полимеразы и 1 мкл 3'-праймеров со штрих-кодом.
    2. Установите следующие условия ПЦР: первый этап, держать при температуре 94 °C в течение 2 минут; вторая ступень - циклы при 94°С в течение 30 с и 50°С в течение 30 с; третья ступень, 16 циклов при 94 °C в течение 30 с, 62 °C в течение 30 с и 68 °C в течение 30 с. Держите реакцию при температуре 68 °C в течение 5 минут.
    3. Очистите амплифицированную кДНК путем повторения этапов с 4.3.5 по 4.3.10 и замените фрагментированный образец РНК продуктом ПЦР, полученным на предыдущем этапе.
    4. Проанализируйте очищенный образец РНК на секвенсоре (NGS) для генерации данных в виде файлов FASTq.

5. Биоинформатика

  1. Откройте доступный в Интернете инструмент «Галактика», скопировав и вставив ссылку: https://usegalaxy.org во вкладку поиска браузера.
  2. При первом посещении этого сайта зарегистрируйтесь для получения профиля, нажав на кнопку входа или опцию регистрации в правом верхнем углу.
  3. После создания учетной записи войдите в учетную запись, заполнив публичное имя/логин и пароль.
  4. Загрузите файлы FASTq, полученные после анализа РНК-секвенирования, нажав на опцию загрузки на левой боковой панели.
  5. Выберите инструмент cutadapt в разделе инструментов на левой боковой панели. Этот инструмент будет обрезать некачественные последовательности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь этот файл можно использовать для сопоставления.
  6. Нажмите на кнопку инструмента на левой боковой панели и найдите инструмент «Звезда РНК». Заполните детали следующим образом: Используйте выходной файл cutadapt, выберите референсный геном как референсный геном человека (hg38) и измените длину геномной последовательности вокруг аннотированных соединений на 36. Выберите выходные данные в виде количества генов и нажмите на опцию «Запустить инструмент» в правом верхнем углу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент сгенерирует файл BAM.
  7. Выберите инструмент featurecounts из опций инструмента и загрузите файлы BAM, полученные после анализа РНК-звезд. Установите минимальное качество сопоставления на чтение в параметрах фильтрации чтения на 10 и нажмите на опцию запустить инструмент в правом верхнем углу.
  8. Откройте выходной файл featurecount на правой панели и скопируйте данные в электронную таблицу. Вычислите изменение свертки относительно элемента управления, разделив количество полученных в тесте счетчиков прочтений на количество прочитанных счетчиков, полученных в контроле с помощью команды =log (изменение свертки, 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение складки <-2.0 считается указанием на понижение регуляции, а изменение складки > 2.0 считается повышающей регуляцией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфологические изменения
Инкубация протоковых клеток поджелудочной железы человека в кислой среде изменяла морфологию клеток. Слияние и плотно упакованный клеточный паттерн приводил к дисперсию клеток в кислых условиях, и клеточная гибель со временем становится заметной. По сравнению с нормальными клетками, содержащими среду, протоковые клетки уменьшались и уменьшались в размерах. Резкое изменение смертности наблюдалось после 6 ч инкубации. Через 24 ч количество клеток уменьшилось, и клетки, казалось...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод был разработан для определения влияния кислотных условий на доброкачественные эпителиальные клетки протоков поджелудочной железы человека в биологических повторах. Изменение рН среды приводило к тому, что клетки находились в стрессовом состоянии, и наблюдалось изменение морфологии. Клетки культивировали при pH 6,0, 6,5 или 7,0 в течение 24 ч и контролировали каждый час для оптимизации инкубационного периода для дальнейших экспериментов. Мы наблюдали изменение морфологии через ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ренука Гаудшелвар благодарна DBT за предоставленную ей стипендию. Ренука Гаудшелвар выражает признательность за помощь, полученную от факультета биохимии Университета Османии (Хайдарабад) и доктору В. В. Равиканту за его руководство при анализе данных NGS. Д-р М. Сасикала выражает признательность за финансовую помощь, полученную от ICMR, Министерства здравоохранения, правительства Индии (грант No-94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужные пробирки с градуированной формой 15 мл (Falcon) Тарсоны 500031используется для пробоподготовки 
Центрифужные пробирки для градуированных 50 мл (Falcon)Tarsons 500041используется для пробоподготовки 
Agilent 2100 БиоанализаторAgilent AgilentG2938AInstrment для оценки качества РНК 
Антибиотический антимикотический раствор 100x жидкийHimediaA002-100 млИспользуется для предотвращения загрязнения 
Скребок для ячеек с вращающимся лезвиемHimedia TCP223Соскоб и сбор клеток
CO2 incubator Нью-БрансуикGalaxy 170 SИспользуется для инкубации культуры 
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы HimediaAL007S-500 млСреда для культивирования клеток
Dulbecco's Phosphate Buffered Salt 1xHimediaTL1006-500mLпромывка клеток
Galaxy (https://usegalaxy.org)Онлайн-инструмент для обработки данных NSG 
HI FBS (происхождение: Австралия)Gibco10100-147Используется для роста клеток 
Линия эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы человека (HPDEC/H6C7)Addex BioT0018001Линия протоковых клеток поджелудочной железы
Ion Total RNA-Seq Kit v2Thermo fisher Scientific4475936Набор для подготовки образцов
РНК Laminar Air
Na2HPO4 DiabasicSigma AldrichS3264-250GSodium phosphate Подготовка буфера 
2PO4 ОдноосновнойSigma AldrichS3139-250Gфосфата натрия 
NovaSeq 6000Illumina3376672Секвенсор 
Nunclon Delta Surface (6-луночный планшет)Thermo Scientific140675Культивирование клеток 
Охлаждаемая настольная центрифугаThermo Scientific Sorvall ST 8RИспользуется для центрифугирования
RiboMinus Eukaryote System v2Thermofisher scientificA15026набор для истощения рРНК 
Комплект Rneasy Mini Qiagen74104Набор для выделения общей РНК из клеток 
ТермоамплификаторEppendorfE950040025реакции ПЦР 
Водная баня Эквитрон#8406MРазмораживание образца
Flow буферный препарат

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franck, C., et al. Advanced pancreatic ductal adenocarcinoma: Moving forward. Cancers (Basel). 12 (7), 1955(2020).
  2. Kong, X., Sun, T., Kong, F., Du, Y., Li, Z. Chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Gastrointest Tumors. 1 (3), 123-134 (2014).
  3. Jura, N., Archer, H., Bar-Sagi, D. Chronic pancreatitis, pancreatic adenocarcinoma and the black box in-between. Cell Res. 15 (1), 72-77 (2005).
  4. Kloppel, G. Chronic pancreatitis, pseudotumors and other tumor-like lesions. Mod Pathol. 20 (Suppl 1), S113-S131 (2007).
  5. Schneider, A., Whitcomb, D. C. Hereditary pancreatitis: a model for inflammatory diseases of the pancreas. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 16 (3), 347-363 (2002).
  6. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  7. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
  8. Balkwill, F., Mantovani, A. Inflammation and cancer: back to Virchow. Lancet. 357 (9255), 539-345 (2001).
  9. Clevers, H. At the crossroads of inflammation and cancer. Cell. 118 (6), 671-674 (2004).
  10. Kato,, et al. Acidic extracellular microenvironment and cancer. Cancer Cell Int. 13 (1), 89(2013).
  11. Hegyi, P., Maléth, J., Venglovecz, V., Rakonczay, Z. Jr Pancreatic ductal bicarbonate secretion: challenge of the acinar acid load. Front Physiol. 2, 36(2011).
  12. Ibrahim-Hashim, A., Estrella, V. Acidosis and cancer: from mechanism to neutralization. Cancer Metastasis Rev. 38 (1-2), 149-155 (2019).
  13. Vakkila, J., Lotze, M. T. Inflammation and necrosis promote tumour growth. Nat Rev Immunol. 4 (8), 641-648 (2004).
  14. Zepecki, J. P., et al. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38 (10), 1734-1750 (2019).
  15. Kim, R. K., et al. Role of lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK) in the expansion of glioma-initiating cells by fractionated radiation. Biochem Biophys Res Commun. 402 (4), 631-636 (2010).
  16. Hu, Y., et al. Requirement of Src kinases Lyn, Hck and Fgr for BCR-ABL1-induced B-lymphoblastic leukemia but not chronic myeloid leukemia. Nat Genet. 36 (5), 453-461 (2004).
  17. Sharp, N. A., Luscombe, M. J., Clemens, M. J. Regulation of c-fgr proto-oncogene expression in Burkitt's lymphoma cells: effect of interferon treatment and relationship to EBV status and c-myc mRNA levels. Oncogene. 4 (8), 1043-1046 (1989).
  18. Hui, A. B., Lo, K. W., Yin, X. L., Poon, W. S., Ng, H. K. Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based comparative genomic hybridization. Lab Invest. 81 (5), 717-723 (2001).
  19. Fang, Z. Y., et al. Proteomic identification and functional characterization of a novel ARF6 GTPase-activating protein, ACAP4. Mol Cell Proteomics. 5 (8), 1437-1449 (2006).
  20. Okabe, H., et al. Isolation of development and differentiation enhancing factor-like 1 (DDEFL1) as a drug target for hepatocellular carcinomas. Int J Oncol. 24 (1), 43-48 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pH

Похожие статьи