Методическая статья

Выделение и культивирование первичных мышиных адипоцитов у худых мышей и мышей с ожирением

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67846

⸱

24 января 2025 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Размер и хрупкость зрелых адипоцитов ограничивают доступные методы и инструменты для их изучения и выделения. Здесь описан протокол выделения зрелых адипоцитов мышей, которые могут быть легко адаптированы для различных жировых депо и рационов мышей.

Аннотация

Жировая ткань в основном состоит из зрелых, насыщенных липидами адипоцитов по объему. Эти постмитотические клетки играют решающую роль в накоплении и мобилизации энергии, терморегуляции и секреции эндокринных факторов. Расширение белой жировой ткани из-за дисбаланса калорий приводит как к увеличению существующих адипоцитов, так и к образованию дополнительных адипоцитов из клеток-предшественников адипоцитов. Вызванные ожирением изменения в белой жировой ткани, в том числе поражающие адипоциты, связаны с многочисленными сопутствующими заболеваниями, такими как диабет 2 типа и 13 видов рака. Существенным препятствием для изучения того, как адипоциты способствуют заболеванию, является неспособность легко изолировать и культивировать зрелые адипоциты. В данной статье описан протокол выделения мышиных худых и тучных адипоцитов из подкожных и висцеральных жировых депо самцов и самок мышей C57BL/6. В протоколе подробно описано, как выделенные первичные адипоциты могут быть культивированы в мембранной агрегатной системе адипоцитов в течение 2 недель, облегчая их функциональный анализ в экспериментах по совместному культивированию, анализах липолиза или путем сбора кондиционированных сред, содержащих факторы, секретируемые адипоцитами. Кроме того, в протоколе описаны методы культивирования эксплантов жировой ткани в куполах матрицы базальной мембраны и визуализации первичных изолированных адипоцитов. Важно отметить, что этот подход может быть интегрирован с существующими протоколами выделения клеток-предшественников адипоцитов, резидентных в жировой ткани, с использованием сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Вместе эти протоколы предоставляют исследователям инструменты для функционального изучения адипоцитов, клеток-предшественников адипоцитов и всей жировой ткани худых и тучных, самцов и самок мышей.

Введение

Ожидается, что распространенность ожирения среди взрослых в Соединенных Штатах достигнет 50% к 2030году1, что делает необходимым лучшее понимание клеточных и физиологических эффектов ожирения. Ожирение характеризуется дисбалансом калорий, приводящим к расширению белой жировой ткани из-за увеличения запасов энергии в виде жира. Расширение жировой ткани может происходить как за счет образования новых адипоцитов (гиперплазия), так и за счет увеличения размеров существующих адипоцитов (гипертрофия). Хотя оба процесса приводят к расширению жировой ткани, гипертрофическое расширение совпадает со снижением метаболического здоровья и более высокой частотой метаболических нарушений 2,3. Лучшее понимание сложностей жировой ткани даст представление о молекулярных механизмах, регулирующих метаболические нарушения и другие сопутствующие заболевания, связанные с ожирением, включая диабет 2 типа и рак.

Жировая ткань уже давно ценится за ее роль в хранении энергии и терморегуляции. Однако в последнее время жировая ткань стала важной метаболической сигнальной тканью, ответственной за секрецию метаболитов, липидов и пептидов. Эти молекулы, полученные из жировой ткани, называемые адипокинами, сигнализируют локально и системно и могут регулировать энергетический гомеостаз, иммунную функцию, сосудистую динамикуи многое другое. Зрелые адипоциты составляют примерно 50% клеток жировой ткани и представляют собой подавляющее большинство объема жировой ткани8. Важно отметить, что исследования показали, что адипоциты состоят из многих субпопуляций 9,10. Таким образом, клетки-предшественники адипоцитов генерируют различные популяции зрелых адипоцитов на основе таких факторов, как пол и депо жировой ткани. Эти зрелые адипоциты могут быть дополнительно модулированы изменениями в диете и ожирением, создавая субпопуляции адипоцитов, которые являются транскрипционно различными и экспрессируют различные паракринные сигнатуры 9,11,12,13,14,15,16 . Несмотря на их сложность и физиологическую важность, способность выделять и культивировать зрелые адипоциты остается явным барьером для изучения этих клеток.

Доступные в настоящее время методы, используемые для выделения зрелых адипоцитов, включают дифференцировку от клеток-предшественников адипоцитов (APC), сортировку флуоресцентных активированных клеток и методы, основанные на центрифугировании, хотя все они имеют свои недостатки. Дифференцировка АПК в зрелые адипоциты in vitro или ex vivo широко используется для развития зрелых адипоцитов. Тем не менее, эти искусственно дифференцированные клетки являются мультилокулярными, содержащими множество мелких липидных капель, а не одногнездным фенотипом зрелых адипоцитов in vivo, которые содержат одну большую липидную каплю17. Кроме того, исследования показали, что дифференцированные клетки in vitro транскрипционно отличаются от изолированных зрелых адипоцитов, обнаруженных in vivo17. Важно отметить, что дифференцировка in vitro не в состоянии уловить разницу между худыми и тучными адипоцитами. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) обычно используется для выделения определенных клеточных популяций из ткани; однако зрелые адипоциты могут легко лопнуть в условиях FACS из-за их большого размера и хрупких мембран, что делает этот метод неэффективным для выделения зрелых адипоцитов. Другие существующие протоколы приводят к накоплению большого количества свободных липидов, которые могут быть токсичными для зрелых адипоцитов в культуре с течением времени.

Здесь мы описываем протокол выделения зрелых адипоцитов мышей из белой жировой ткани. Этот протокол был адаптирован из протокола для зрелых культур агрегатов адипоцитов, первоначально разработанного Harms et al.17; Тем не менее, описанный здесь подход, основанный на центрифугировании, использует обычное лабораторное оборудование и способен эффективно выделять адипоциты из небольших количеств (~0,5 г) жировой ткани. Это легко адаптируемая система, и в нее включены модификации для выделения зрелых адипоцитов мышей из самцов и самок мышей, висцеральных и подкожных жировых депо, а также различные условия питания.

Протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по использованию животных и уходу за ними Университета штата Юта. Этот протокол был оптимизирован для выделения зрелых адипоцитов от самцов и самок мышей C57BL/6 в возрасте 8-16 недель с массой тела от 20 до 45 г. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Приготовление раствора

  1. Приготовьте коллагеназный буфер. Добавьте 100 мг порошка коллагеназы, 1 мл 1 М буфера HEPES, 500 мкл 100x P188, 50 мкл 1 М CaCl2, 0,05 г БСА и 48,45 мл среды 199. Стерильно отфильтруйте раствор, аликвотуйте, и храните при температуре -20 °С.
  2. Изготавливают клеточные питательные среды. Смешайте 500 мл DMEM, 50 мл FBS, 5 мл пенициллин-стрептомицина и 5 мл добавки L-глутамина.

2. Сбор депо белой жировой ткани от мышей

  1. Подготовьте тарелку размером 1 x 10 см с 200 μл HBSS для каждого отдельного депо и соответствующего состояния и положите ее на лед.
  2. Заберите животных из домика для животных и усыпьте мышей в соответствии с указаниями Комитета по уходу за животными и их использованию учреждения. Здесь животных усыпляли путем вывиха шейки матки под глубокой анестезией.
  3. При необходимости взвесьте и запишите вес каждой мыши.
  4. Простерилизуйте мышь, распылив 70% этанол для покрытия внешней поверхности.
  5. Заготавливаем соответствующие жировые подушечки у мыши18,19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь об удалении лимфатических узлов из подкожного депо, прежде чем помещать ткань в чашку.
  6. Взвесьте каждый жир и запишите вес.
  7. Положите жировую подушку в подготовленную 10-сантиметровую пластину на лед.

3. Приготовление эксплантов белой жировой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным.

  1. Не менее чем за 12 ч до начала вскрытия разморозьте матрикс базальной мембраны (Матригель) при 4 °C на льду и охладите одну коробку стерильных наконечников для пипеток объемом 200 мкл при 4 °C.
  2. Используя охлажденные наконечники для пипеток, пипетка вводит 80 мкл матрицы базальной мембраны в центр каждой лунки 24-луночного планшета для создания купола (рис. 1A). Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2) на 30 минут для частичного затвердевания матрицы.
  3. Подготовьте ткань: с помощью стерильных ножниц для препарирования взвесьте 0,1 г ткани из каждого образца и поместите ее в PBS на лед.
  4. С помощью стерильных щипцов предварительно взвешенную ткань введут в частично затвердевший купол матрицы. Добавьте 30 мкл матрицы базальной мембраны поверх внедренной ткани. Верните планшет в инкубатор на 30 минут, чтобы ткань встала в матрицу базальной мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание ткани в матрицу базальной мембраны имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы ткань оставалась в культуре, а не плавала. Это сохраняет здоровье и качество тканей (Рисунок 1B).
  5. Добавьте по 1 мл питательной среды (DMEM с 10% FBS) в каждую лунку и верните в инкубатор.

4. Лечение коллагеназой

  1. Рассчитайте необходимое количество раствора коллагеназы. Смотрите таблицу 1.
  2. Приготовьте раствор коллагеназы с ДНКазой. Добавьте 0,00017 г ДНКазы на 1 мл раствора коллагеназы. Вихрь перемешать.
  3. С помощью бритвенного лезвия измельчите изолированную жировую ткань до тех пор, пока ткань не станет однородной (рисунок 2A). Переложите измельченную ткань в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не переусердствуйте. Измельчение считается завершенным, когда ткань выглядит однородной и пастообразной. Недостаточно измельченная ткань выглядит грубой и неоднородной, а измельченная ткань приведет к высвобождению свободных липидов (Рисунок 2B).
  4. Добавьте приготовленный раствор коллагеназы и ДНКазы в измельченную жировую ткань с использованием объемов, рассчитанных на шаге 4.1. Вихрь на максимальной скорости в течение 7-10 с тщательно перемешать. Поместите конические пробирки объемом 50 мл горизонтально в шейкер, установленный на 220 об/мин, 37 °C.
  5. Выдерживайте встряхивание в течение 10 минут, затем совершайте вихрь в течение 5 с и проверяйте образцы. Полностью переваренные образцы будут выглядеть однородными, без видимых комков или кусочков ткани. Если образцы не полностью переварены, продолжайте разложение в шейкере, проверяя каждые 2 минуты (Рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не переваривайте. Чрезмерное время в растворе коллагеназы может привести к распаду адипоцитов и высвобождению липидов.
  6. С помощью серологической пипетки пропустите переваренную ткань через сито в новую коническую форму объемом 50 мл. Добавьте объем FBS, равный объему ткани + раствора коллагеназы через сито, в коническую форму для нейтрализации коллагеназы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После фильтрации в сите останется небольшое количество ткани.

5. Промывание салфетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в капюшоне для стерильных культур тканей.

  1. Приготовьте 1 пробирку объемом 15 мл с 10 мл теплой питательной среды для каждого состояния.
  2. Вращайте пробирки с шага 4.6 при 300 x g в течение 3 минут при температуре, указанной в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температуру для центрифугирования необходимо изменять в зависимости от пола мышей, от которых была выделена жировая ткань; эти температуры приведены в таблице 1.
  3. Следите за тем, чтобы после отжима ткань разделилась на четыре слоя (рисунок 3А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самый верхний слой - это свободные липиды, второй слой - это слой зрелых адипоцитов, третий слой - коллагеназа и FBS, а четвертый слой - это стромальная васкулярная фракция (SVF), которая гранулируется на дно20,21.
  4. Аккуратно удалите верхний слой свободных липидов с помощью пипетки объемом 200 мкл.
  5. После снятия верхнего слоя с помощью пипетки p1000 с отрезанным нижним слоем перенесите зрелые адипоциты в подготовленную пробирку объемом 15 мл с 10 мл питательной среды (рис. 3В).
    1. Дополнительно: Чтобы выделить первичные клетки-предшественники адипоцитов (APC), снова вращайте пробирки при 300 x g в течение 10 минут. Затем приступают к выделению клеток-предшественников адипоцитов с помощью Liu et al.22, Cho et al.23 или аналогичных.
  6. Аккуратно переверните 15 мл пробирок со зрелыми адипоцитами 3-5 раз, пока белый слой не рассеется по всей среде.
  7. Дайте пробиркам постоять в вертикальном положении в течение 10 минут при температуре, указанной в таблице 1 , чтобы обеспечить разделение слоев адипоцитов и среды.
  8. После 10-минутного отдыха вращайте трубки при давлении 100 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре, чтобы еще больше способствовать разделению слоев. После вращения образцы будут снова разделены на четыре слоя, как показано на рисунке 3А.
  9. Удалите и выбросьте верхний слой свободных липидов с помощью пипетки.
  10. С помощью иглы 21 G, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл, проведите иглу вниз по краю трубки, пока дно иглы не освободится от зрелого слоя адипоцитов (рисунок 3C). Следите за тем, чтобы верхняя часть иглы и нижняя часть шприца не нарушали зрелый слой адипоцитов.
  11. Медленно потяните шприц вверх, чтобы удалить питательную среду и любой клеточный мусор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления среды убедитесь, что кончик иглы свободен от зрелого слоя адипоцитов.
  12. Аккуратно добавьте 10 мл питательной среды в каждую пробирку.
  13. Повторите шаги 5.6-5.11. Не добавляйте больше питательных сред.
  14. С помощью гелеобразных наконечников для пипеток сдвиньте наконечник пипетки вниз по краю пробирки, чтобы удалить оставшуюся среду из-под зрелого слоя адипоцитов.

6. Упаковка

  1. Центрифугируйте ячейки при давлении 100 x g в течение 1 мин при температуре, указанной в таблице 1. Удалите свободные липиды (прозрачный слой масла поверх клеток) с помощью пипетки. Удалите питательную среду ниже адипоцитов с помощью гелезагрузочного наконечника. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму нарушение работы слоя адипоцитов (рисунок 4).
  2. Повторяйте шаг 6.1 до тех пор, пока не будут удалены все питательные среды и свободные липиды (обычно 3-5 раз). Пакет клеток должен быть белого цвета без видимых свободных липидов над клетками или сред под клетками (Рисунок 4).

7. Гальванические и функциональные анализы

  1. Осаждение зрелых адипоцитов для культивирования клеток
    1. Извлеките вкладыши для клеточных культур из обработанного тканевой культурой 24-луночного планшета и поместите их мембранной стороной вверх на поверхность колпака.
    2. Чередующиеся лунки планшета заполнить 1 мл теплой питательной среды.
    3. С помощью разрезанного наконечника для пипетки p200 поместите 30 мкл упакованных зрелых адипоцитов из шага 6.2 в верхнюю часть вкладыша transwell (рис. 5A, B).
    4. Осторожно возьмите и переверните вставку Transwell и поместите ее в предварительно заполненную лунку в 24-луночной пластине (Рисунок 5A). Осторожно поместите планшет в инкубатор, установленный при температуре 37 °C и 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно упакованные адипоциты должны образовывать непрозрачный слой без видимых прозрачных свободных липидных капель при наблюдении сверху (рис. 5C).
    5. Меняйте среду на зрелых адипоцитах каждые 2-7 дней в течение 14 дней.
      1. Чтобы удалить фильтрующий материал из лунок, удерживайте транслун на месте и с помощью пипетки p200 осторожно удалите фильтрующий материал через небольшие отверстия на боковой стороне вкладыша транслунга (рис. 5D).
      2. После удаления среды, продолжая удерживать трансвелер на месте, очень медленно добавьте 1 мл среды в боковую стенку лунки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы добавлять и удалять медиафайлы очень медленно. Адипоциты могут легко вытесняться из мембраны при быстрой смене среды.
  2. Анализ на липолиз
    1. Пластинчатая жировая ткань эксплантирует, как описано в шаге 3.4, или зрелые адипоциты, как описано в шаге 7.1.
      Примечание: Клетки или ткани должны быть культивированы в среде, не содержащей фенола, в течение не менее 24 ч перед проведением анализа липолиза.
    2. Приготовление раствора: Приготовьте раствор 5% BSA в DMEM (без фенолового красного), растворив 5 г BSA в 100 мл DMEM. Аккуратно переверните до полного растворения BSA.
      1. Подготовка рабочих растворов для сред управления и стимуляции. Для рабочих сред комбинируйте 5% BSA DMEM с транспортным средством. Для стимуляции среды смешайте 5% BSA DMEM среды с 5 мкМ CL-316,243. Перед использованием нагрейте среду управления и стимуляции до 37 °C.
    3. Удалите среду из лунок и промойте 1 мл теплой DPBS. Заполняйте лунки 500 μL на лунку средой для контроля или стимуляции. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2.
    4. Через 1 ч, 2 ч, 4 ч и 24 ч после начала анализа липолиза соберите по 100 мкл среды из каждой лунки в микроцентрифужную пробирку и замените ее 100 мкл соответствующей контрольной или стимулирующей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент образцы можно хранить при температуре -20 °C.
    5. Проведите колориметрический анализ глицерина, используя коммерчески доступный набор свободного глицерина (см. Таблицу материалов) или аналогичный.
      1. Приготовьте реактивы в соответствии с указаниями в наборе.
      2. Разморозьте образцы и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.
      3. Приготовьте стандартную кривую с семиточечным 2-кратным серийным разведением с использованием стандартного раствора глицерина.
      4. Перелейте 25 мкл образца или стандарта в каждую лунку 96-луночного планшета с прозрачным дном.
      5. Добавьте 100 мкл реагента для анализа свободного глицерина в каждую лунку, содержащую образец или стандартный раствор.
      6. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, затем измерять абсорбцию при 540 нм (рисунок 6A-D).
  3. Отображение
    1. Подготовьте слайды для визуализации. Чтобы подготовить слайды, снимите слой подложки с каждой распорки изображения и поместите его на предметное стекло. На каждом предметном стекле можно разместить рядом друг с другом две прокладки для визуализации.
    2. С помощью отрезанного наконечника для пипетки объемом 200 мкл перенесите 30 мкл упакованных адипоцитов с шага 6.2 в микроцентрифужную пробирку.
    3. Приготовьте красящую смесь. Приготовьте 200 мкл на образец раствора для окрашивания плазматической мембраны в концентрации 5 мкг/мл и в концентрации Hoechst 4,5 мкг/мл в PBS. Добавьте к образцам смесь для морилки и аккуратно встряхните.
    4. Окрашивать образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Защищайте образцы от света.
    5. После того как окрашивание будет завершено, промойте образцы. Добавьте 500 μL PBS в каждый образец и осторожно встряхните, чтобы перемешать. Дать постоять 5 минут. Отжимайте при давлении 100 x g в течение 1 минуты, затем удалите среду из-под ячеек с помощью гелезагрузочного наконечника для пипетки.
    6. Подготовьте горки. Снимите прозрачную пластиковую пленку с верхней стороны распорок для визуализации, чтобы обнажить липкий слой.
    7. Добавьте 500 μL PBS в пробирку с окрашенными адипоцитами и аккуратно перемешайте.
    8. Быстро, чтобы не дать зрелым адипоцитам подняться на поверхность, используйте отрезанный наконечник пипетки p200 для размещения 35 мкл адипоцитов в спейсере на предметном стекле.
    9. Поместите крышку на распорку.
    10. Немедленно приступайте к визуализации (рисунок 6C). Задержка в визуализации может привести к кровотечению мембранного маркера.

Результаты

Как показано на рисунке 2, правильное измельчение (рисунок 2B) и пищеварение (рисунок 2C) важны для выделения интактных зрелых адипоцитов. Недостаточное измельчение и недостаточное переваривание могут привести к низкому выходу зрелых адипоцитов из-за недостаточного отделения от соединительной ткани. Визуально это можно наблюдать по волокнистой ткани, оставшейся после измельчения, и видимым комочкам в растворе коллагеназы. Кроме того, чрезмерное измельчение и переваривание также приводят к низкому выходу из-за разрыва зрелых адипоцитов. Визуально это приводит к потере белого непрозрачного слоя и накоплению большого, прозрачного, свободного липидного слоя. Ненадлежащий уровень измельчения или пищеварения приведет к плохой изоляции адипоцитов.

Правильная подготовка и переваривание жировой ткани приведет к разделению ткани на четыре отдельных слоя, как показано на рисунке 3. Некоторый разрыв адипоцитов, приводящий к высвобождению свободных липидов, неизбежен; Тем не менее, правильное измельчение и пищеварение обеспечат минимальный разрыв адипоцитов. Оставшийся свободный липидный слой и среда будут удалены во время упаковки адипоцитов (Рисунок 4). Правильная упаковка адипоцитов имеет важное значение для эффективной изоляции зрелых адипоцитов. Любые оставшиеся свободные липиды или среды приведут к плохой изоляции и негативно повлияют на последующие функциональные анализы, такие как гальваническое покрытие, липолиз и визуализация клеток.

Этот протокол генерирует чистый препарат зрелых адипоцитов. Визуализация клеток и анализы липолиза могут быть выполнены для оценки клеточной функции и демонстрации того, что зрелые адипоциты сохраняют функцию после изоляции и после культивирования в течение двух недель. Анализ липолиза показывает, что зрелые адипоциты сохраняют способность реагировать на клеточную сигнализацию путем высвобождения свободного глицерина при стимуляции адренергического рецептора β-3 (рис. 6A, B). Эта способность сохраняется даже после 2 недель в культуре и в значительной степени сопоставима с липолизной активностью эксплантов жировой ткани, культивируемых в течение 24 ч (рис. 6C, D). У некачественных адипоцитов будет наблюдаться ослабленный липолиз. При визуализации клеток выделенных адипоцитов видны круглые и неповрежденные однокамерные зрелые адипоциты, содержащие одну крупную каплю липидов. При некачественном выделении адипоцитов будут наблюдаться в первую очередь крупные внеклеточные капли масла, указывающие на лопнувшие адипоциты.

figure-results-1
Рисунок 1: Встраивание эксплантов жировой ткани. (A) Изображение частично затвердевшего купола матрицы базальной мембраны до встраивания ткани. (В) Репрезентативные изображения неправильного и надлежащего встраивания тканей. Неправильное заделывание видно, когда ткань частично или полностью парит над куполом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема правильного измельчения и переваривания жировой ткани. (А) Схематическое изображение этапов измельчения и переваривания тканей 4.2-4.6. (B) Репрезентативные изображения нижней, оптимальной и измельченной ткани. Недоизмельченная ткань имеет крупные куски, которые сохраняют свою первоначальную форму. Чрезмерное измельчение ткани приводит к заметному увеличению свободных липидов, окружающих ткань, которые кажутся прозрачными и маслянистыми. (C) Репрезентативные изображения недостаточной, оптимальной и переваренной ткани. Недоваренная ткань содержит кусочки целой ткани, оставшиеся в растворе. Переваренная ткань имеет большой свободный липидный слой, который быстро отделяется от раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Разделение слоев переваренной жировой ткани. (A) Схематическое и репрезентативное изображение слоев, которые присутствуют после шага 5.3. (B) Использование отрезанного наконечника для пипетки для удаления зрелого слоя адипоцитов из конической пробирки объемом 50 мл. (C) Правильная техника и расположение иглы и шприца для удаления питательной среды из-под зрелого слоя адипоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Последовательная упаковка зрелых адипоцитов. Последовательные изображения упаковки зрелых адипоцитов. Слои свободных липидов, адипоцитов и сред мечаются. После каждого вращения свободные липиды и медиа удаляются. Это повторяется до тех пор, пока после спина от адипоцитов не отделится среда или свободные липиды. Итоговое изображение является репрезентативным для хорошо упакованных зрелых адипоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Осаждение и культивирование зрелых адипоцитов. (А) Схема покрытия зрелых адипоцитов. С помощью разрезанного наконечника пипетки p200 упакованные адипоциты помещаются на мембрану вкладыша для клеточной культуры. Затем вкладыш инвертируется в предварительно заполненные лунки питательной среды. (B) Репрезентативное изображение покрытия зрелых адипоцитов с изображением разрезанного наконечника пипетки, откладывающего адипоциты на трансвелл-вкладыш. (C) Схемы и репрезентативные изображения правильно упакованных и плохо упакованных адипоцитов, покрытых трансвеллами, как видно сверху лунок. Правильно упакованные адипоциты выглядят белыми и непрозрачными, в то время как плохо упакованные адипоциты приводят к образованию прозрачных липидных капель. (D) Схема метода, используемого для изменения питательных сред. Наконечник для дозатора p200 используется для осторожного извлечения фильтрующего материала через отверстия в боковой стенке вкладыша Transwell. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Визуализация зрелых адипоцитов и анализ липолиза. (А,Б) Высвобождение глицерина из подкожных (А) и висцеральных (В) зрелых адипоцитов. Адипоциты были выделены от 16-недельных самцов мышей C57BL/6, которых кормили обычной пищей. 30 мкл адипоцитов платировали, как описано на шаге 7.1, и культивировали в течение 1 или 10 дней. Адипоциты обрабатывали 5 мкМ CL-316,243 в течение 1 ч, 2 ч и 4 ч, а надосадочную жидкость собирали и анализировали на наличие свободного глицерина. (К,Г) Высвобождение глицерина из эксплантов подкожной (C) и висцеральной (D) жировой ткани. Жировая ткань была выделена у 18-недельных самок мышей C57BL/6, которых кормили обычной пищей. 0,1 г эксплантов жировой ткани платили, как описано на этапах 3.1-3.4, и культивировали в течение 24 ч. Адипоциты обрабатывали 5 мкМ CL-316,243 в течение 1 ч, 2 ч и 4 ч, а надосадочную жидкость собирали и анализировали на наличие свободного глицерина. N = 3 технических повторения для A-D. Все данные являются средними ± стандартным отклонением. (E) Репрезентативные изображения изолированных подкожных и висцеральных зрелых адипоцитов. Адипоциты были выделены от 16-недельных самцов мышей C57BL/6J, которых кормили обычной пищей. Адипоциты окрашивали с помощью красителя плазматической мембраны (красный) и окрашивания ядер Хёхста (синий). Масштабные линейки: 50 мкм; увеличение: 60x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

СексДиетаСкладСложность измельченияКоллагеназа: соотношение тканейРекомендуемое время сбраживания (мин)Температура отжима.Температура стирки.
ЖенскийОбычный чау-чауПодкожныйТрудный2:112РТ37 °C
Относящийся к внутренностямТерпимая1:18РТ37 °C
Диета с высоким содержанием жировПодкожныйЛёгкий1:18РТ37 °C
Относящийся к внутренностямЛёгкий1:18РТ37 °C
МужскойОбычный чау-чауПодкожныйТрудный2:1144 °CРТ
Относящийся к внутренностямТерпимая1:1104 °CРТ
Диета с высоким содержанием жировПодкожныйЛёгкий1:1104 °CРТ
Относящийся к внутренностямЛёгкий1:1104 °CРТ

Таблица 1: Пол, депо и модификации в зависимости от диеты. Сложность измельчения каждой ткани, описываемая как «Легкая», «Средняя» или «Твердая» по отношению к другим депо. Обратите внимание, что фактическое время измельчения будет варьироваться в зависимости от исследователя и ткани. Коллагеназа: Отношение тканей указывается как объем (мл) коллагеназы + раствора ДНКазы, приготовленного на шаге 4.1, к весу ткани (г). Время переваривания является приблизительной оценкой, но фактическое время переваривания будет варьироваться в зависимости от измельчения и ткани. Исследователи должны оценить пищеварение так, как описано в протоколе. Температура отжима и промывки различается у самцов и самок мышей. RT обозначает комнатную температуру.

Обсуждение

Первичные адипоциты, как известно, трудно изолировать и культивировать, потому что они легко разрываются, а их большой размер исключает использование обычных инструментов выделения первичных клеток, таких как проточная цитометрия. Описанный здесь протокол позволяет получить чистые и функциональные зрелые адипоциты, которые могут быть использованы для различных последующих применений. Важно отметить, что этот протокол позволяет отделить зрелые адипоциты от других клеточных остатков и свободного липидного слоя, что позволяет проводить эффективные анализы визуализации, культивирования и липолиза. Протокол может быть легко объединен с опубликованными протоколами 22,23 по выделению стромально-васкулярной фракции и АПК. В этом протоколе также подробно описана процедура получения и культивирования цельных тканевых эксплантов из жировой ткани, которые могут быть использованы для последующих применений, таких как анализ липолиза и сбор секретируемых факторов из цельной жировой ткани.

Важнейшие аспекты включают правильное измельчение, пищеварение и удаление свободного липидного слоя. Чтобы обеспечить правильное измельчение, важно внимательно следить за внешним видом ткани на протяжении всего процесса. Время и усилия, необходимые для достижения оптимального измельчения ткани, будут варьироваться в зависимости от депо жировой ткани, диетических вмешательств (например, диеты с высоким содержанием жиров) и исследователя. При необходимости можно использовать и другие инструменты для измельчения, такие как ножницы, но этот вопрос здесь не рассматривался. Следует отметить, что следует избегать чрезмерного измельчения, так как это приведет к разрыву адипоцитов, что не только снижает непосредственный выход, но и снижает общий выход и качество адипоцитов из-за вредного воздействия свободного липидного слоя на оставшиеся адипоциты. Правильное пищеварение, как и правильный фарш, будет зависеть от депо жировой ткани, диетических вмешательств, возраста мышей и т.д. Добавление ДНКазы к коллагеназе помогает предотвратить агрегацию адипоцитов во время пищеварения, которая может произойти в результате клеточного мусора. Таким образом, время переваривания тканей сильно варьируется. Приведенные оценки времени переваривания служат ориентиром, с которыми можно ознакомиться в таблице 1. Тем не менее, лучший способ убедиться, что ткани правильно перевариваются, — это визуально осматривать ткани на протяжении всего процесса и в соответствии с протоколом. Различные температуры центрифугирования и промывки, описанные в таблице 1, предложенные в зависимости от пола, необходимы для правильного отделения зрелых адипоцитов как от свободного липидного слоя, так и от другого клеточного мусора и SVF; Использование альтернативных температур может привести к потере зрелых адипоцитов из-за агрегации и разрыва адипоцитов.

Удаление свободного липидного слоя на каждом этапе имеет решающее значение, и невыполнение этого требования приведет к осложнениям при нанесении покрытий, визуализации и анализе липолиза. Кроме того, постоянное присутствие свободного липидного слоя на протяжении всей процедуры приведет к дополнительной гибели адипоцитов из-за липотоксичности, что значительно повлияет на общий выход и качество. В то время как максимизация эффективности выделения зрелых адипоцитов в целом желательна, удаление свободного липидного слоя, даже за счет некоторых зрелых адипоцитов, приведет к общему увеличению выхода зрелых адипоцитов в конце протокола.

К ограничениям процедуры можно отнести количество образцов. Из-за строгости и времени, затрачиваемого на удаление среды и свободного липидного слоя, процедура, как правило, ограничена шестью образцами за один раз. Обработка значительно большего количества образцов приведет к тому, что первичные адипоциты будут слишком долго подвергаться воздействию свободных липидов и снизят общий выход. Тем не менее, дополнительный персонал может позволить увеличить количество образцов. Время от измельчения до функционального анализа имеет решающее значение, так как чрезмерные задержки в удалении среды и свободного липидного слоя приводят к дополнительному разрыву зрелых адипоцитов. Протокол также ограничен в способности разделять субпопуляции зрелых адипоцитов.

Современные методы изучения зрелых адипоцитов в первую очередь опираются на выделение АПК и последующую дифференцировку этих клеток ex vivo. Начали разрабатываться дополнительные методы, в том числе модель «орган на чипе» и кокультуры транс-лунок18,24. Тем не менее, было показано, что эти дифференцированные адипоциты ex vivo транскрипционно и морфологически отличаются от зрелых адипоцитов в жировой ткани17. Морфологически дифференцированные адипоциты ex vivo являются мультилокулярными, в то время как изолированные адипоциты in vivo являются однолокулярными. Этот протокол был модифицирован и оптимизирован по сравнению с предыдущими отчетами17,25 для успешной изоляции и культивирования зрелых адипоцитов из всего лишь 0,5 г жировой ткани по сравнению с другими протоколами, которые требуют не менее 5 г жировой ткани25. Наконец, это исследование было направлено на то, чтобы наглядно проиллюстрировать успешное выполнение ключевых этапов протокола вместо конкретного времени, температуры центрифугирования и количества коллагеназы, хотя рекомендации включены в таблицу 1. Эти параметры должны быть скорректированы в соответствии с такими факторами, как депо жировой ткани, пол и ожирение животного, все из которых могут повлиять на эффективность пищеварения и чистое отделение зрелых адипоцитов в этом протоколе.

В общей сложности процедура занимает 3-4 часа, в зависимости от количества объединенных мышей и количества отдельных образцов жировой ткани. Ожидается, что возможность культивирования и оценки функциональной роли зрелых адипоцитов позволит использовать множество последующих приложений для изучения биологии адипоцитов как таковой (например, метаболизма, использования питательных веществ и отслеживания) и взаимодействия адипоцитов с другими типами клеток, такими как APC, раковые клетки и клетки иммунной системы.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность за грантовую поддержку от 5 For The Fight и Huntsman Cancer Institute (KIH), V Foundation for Cancer Research (KIH) и DK133455 (KIH). Схемы протокола, созданного с помощью Biorender. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Стефани Джаньокаво и Центр клеточной визуализации Университета штата Юта за помощь в визуализации, а также Марка Ли за отзывы о рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100x Poloxamer 188 растворSigmaP5556-100mL
15 мл коническийCellstar188261
21 г иглаBD305165
5 мл шприцBD309646
50 мл коническийCellstar227261
6,5 мм Transwell с 0,4 и микро; m Поровая поликарбонатная мембранная вставкаCorning3413
Бычья сыворотка Альбумин (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Plasma Membrane StainsThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 динатриевая сольTocris1499
Коллагеназа ПорошокSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM без феонола RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
фетальная бычья сыворотка (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientific
Гелевая загрузка Pipet TipFisher scientific02-707-181
Добавка GlutaMAXGibco35050061
набор для анализа глицеринаAbcamAB133130
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Центрифуга Megafuge 16R ThermoScientific 
Hoechst 33342 РастворThermo Fisher Scientific62249
Инкубационный мини-шейкерVWR12620-942
Medium 199Sigma-AldrichM4530
Чехол для микроскопаVWR16004-302
PBSGibco10010023
пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
SecureSeal Прокладки для визуализацииGrace Biolabs654006
Seive (SteeL Мелкоячеистое ситечко для коктейлей)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
151884875004271

Ссылки

  1. Ward, Z. J., et al. Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity. N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).
  2. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  3. Longo, M., et al. Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications. Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).
  4. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  5. Johnston, E. K., Abbott, R. D. Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity. Cells. 12 (3), 407(2023).
  6. Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction. Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).
  7. Liu, P., et al. Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates. Sci Data. 10 (1), 453(2023).
  8. Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).
  9. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  10. Nahmgoong, H., et al. Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics. Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).
  11. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  12. Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. Adipose tissue at single-cell resolution. Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).
  13. Gao, Y., et al. Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).
  14. Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation. Cells. 8 (9), 1100(2019).
  15. Verma, S., et al. Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis. Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).
  16. Min, S. Y., et al. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).
  17. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).
  18. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  19. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice. J Vis Exp. 167, e62005(2021).
  20. Farrar, J. S., Martin, R. K. Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes. Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).
  21. You, X., Gao, J., Yao, Y. Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review. Regen Ther. 27, 120-125 (2024).
  22. Liu, Q., et al. Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction. STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).
  23. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. J Vis Exp. 162, e61694(2020).
  24. Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. Next-generation human adipose tissue culture methods. Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).
  25. Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. 156, e60485(2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Transwell

Похожие статьи