Методическая статья

3D-генерация ткани миокарда человека с использованием электроспиннинговой записи поликапролактонных скаффолдов и сердечных клеток, полученных из ИПСК

DOI:

10.3791/67847

⸱

28 марта 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Program, Enabling Technologies Division, CIMA Universidad de Navarra, and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 2Department of Cardiology, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 3Hematology and Cell Therapy Area, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 4Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC) CB16/12/00489, 5Hemato-Oncology Program, Cancer Division, CIMA Universidad de Navarra

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен воспроизводимый метод получения 3D тканей миокарда, сочетающий скаффолды поликапролактона (PCL) и фибриновые гидрогели с кардиомиоцитами и фибробластами, полученными из hiPSC. Этот метод обеспечивает точный контроль над архитектурой каркаса и может быть применен в доклинических испытаниях лекарств и моделировании сердечных заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка функциональных тканей сердца человека имеет значительные перспективы для продвижения приложений в скрининге лекарств, моделировании заболеваний и регенеративной медицине. Этот протокол описывает поэтапное изготовление трехмерных тканей миокарда с усовершенствованной имитацией нативной структуры сердца путем сочетания скаффолдов поликапролактона (PCL) электроспиннинговой записи из расплава (MEW) с фибриновыми гидрогелями и сердечными клетками, полученными из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC). Процесс включает в себя встраивание смеси кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) и сердечных фибробластов (hiPSC-CFs) в фибриновый матрикс для создания мини-тканей со структурной поддержкой, обеспечиваемой каркасами, созданными MEW. Эти фибриллярные каркасы изготавливаются в микро- и наномасштабе, что позволяет точно контролировать архитектуру волокна, которая играет ключевую роль в организации распределения и выравнивания клеток. Между тем, фибриновый матрикс способствует жизнеспособности клеток и имитирует внеклеточную среду. Характеристика сгенерированных тканей выявила хорошо организованные саркомеры в ИПСХ-СМ, а также стабильную сократительную активность. Ткани демонстрируют последовательное спонтанное биение уже через два дня после посева, с устойчивой функциональностью в течение долгого времени. Комбинация hiPSC-CF с hiPSC-CM улучшает структурную целостность тканей, поддерживая при этом долгосрочную жизнеспособность клеток. Этот подход предлагает воспроизводимый, адаптируемый и масштабируемый метод создания биомиметических моделей сердечной ткани, обеспечивая универсальную платформу для доклинических испытаний лекарств, механистических исследований сердечных заболеваний и потенциальных регенеративных терапий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изготовление функциональных тканей сердца, сконструированных человеческим сердцем, имеет большие перспективы для применения в условиях высоких ударопрочных нагрузок. Они простираются от разработки моделирования кардиотоксичности лекарств и сердечных заболеваний человека до создания терапевтических тканейсоответствующих размеров. Несмотря на то, что за последние 15 лет в этой области были достигнуты значительные успехи, производство миокарда человека с высокой степенью миметики в настоящее время затруднено из-за трудностей в воспроизведении сложной структурной и механической организации егоприродного аналога.

С биологической точки зрения, революционная технология перепрограммирования клеток открыла возможность разработки терапевтических клеток, специфичных для пациента. В настоящее время индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) являются единственным источником кардиомиоцитов человека в персонализированном контексте. Высокий выход кардиомиоцитов может быть получен с помощью робастных протоколов дифференцировки 3,4. Ключевым вопросом является степень созревания, поскольку кардиомиоциты человека, полученные из hiPSC (hiPSC-CMs), используемые в настоящее время, демонстрируют незрелый фенотип в обычных условиях 2D-дифференцировки5. Это связано с тем, что структурная организация сердечной ткани очень сложна, абсолютно не похожа на обычные 2D-культуры. Кроме того, миокард состоит из различных сердечно-сосудистых клеток, в том числе немиоцитов, таких как сердечные фибробласты, гладкие мышцы и эндотелиальные клетки, упорядоченно расположенные через специфическую трехмерную структуру, что позволяетэффективно перекачивать кровь. Таким образом, высокоструктурированные сердечные мини-ткани человека, состоящие из всех основных типов клеток, необходимы для создания физиологически значимых биомиметических тканей.

Применение новых подходов к биопроизводству может выйти из этого тупика. Среди них электроспиннинговая запись из расплава (MEW), передовая технология 3D-печати, способная обеспечить высокую точность и разрешение. В MEW электрическое поле используется для осаждения расплавленного полимера в виде волокон в диапазоне размеров ячейки, что на порядок меньше, чем при обычной 3D-печати методом моделирования методом наплавления (FDM), что приводит к созданию четко определенных структур каркаса 8,9. Было показано, что MEW способен преобразовывать сложный дизайн in silico в печатную матрицу и настраивать физические свойства в 3D, чтобы они соответствовали свойствам сердечной ткани10. С помощью технологии MEW можно печатать полимерные сетки различной формы и структуры, которые в сочетании с мягкими гидрогелями, дружественными клеткам, генерируют композитные ткани, имитирующие микро- и макромеханическую среду нативного взрослого миокарда 11,12. Было показано, что изменение конструкции 3D-каркаса MEW приводит к изменению результирующей функциональности (кальциевых переходных процессов)10, создавая основу для понимания взаимосвязи форма и функция в этой многообещающей 3D-системе.

Здесь представлен подробный протокол изготовления сократительных сердечных минитканей человека из hiPSC-CM и сердечных фибробластов, полученных из iPSC человека (hiPSC-CFs), и их комбинации в фибриновом гидрогеле, армированном 3D-печатными структурами. Добавление фибробластов широко использовалось в различных 3D-инженерных системах для повышения выживаемости гиперПСК-СМ и поддержания структуры тканей, но его использование в системах 3D-MEW еще не изучено. Описанная здесь технология предоставляет универсальную платформу для исследователей, стремящихся разрабатывать точные модели сердечной ткани с такими приложениями, как понимание механизмов заболевания, доклиническая токсикология и скрининг лекарств. Эта модель подходит для оценки кардиотоксичности признанных препаратов, таких как антрациклины (например, доксорубицин), ингибиторы тирозинкиназы, а также новых методов лечения, таких как клетки химерного антигенного рецептора Т (CAR-T), которые были связаны с сердечной дисфункцией. Кроме того, модель обладает значительным потенциалом в развитии регенеративной медицины, позволяя тестировать биоматериалы, биочернила и клеточную терапию, направленную на улучшение сердечной функции и восстановление ткани миокарда при таких состояниях, как инфаркт миокарда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Настройка среды и реагентов

  1. Предварительное покрытие планшетов для клеточных культур
    1. Подготовьте матригель с уменьшенным фактором роста (MGFr) аликвоты из запаса. Разморозьте один флакон MGFr на ночь в холодильнике на льду. В стерильной вытяжке, используя охлаждаемые наконечники и постоянно держа приклад и пробирки на льду, сделайте аликвоты подходящего объема, разбавив бульон 1:1 в холодном RPMI 1640 L-глутамине (RPMI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования hiPSC и посева hiPSC-кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) используют различные разведения MGFr. Разбавление покрытия MGFr для hiPSCs варьируется в зависимости от конкретной клеточной линии. Однако, как только стадия кардиомиоцитов достигнута, используется разведение 1:80 независимо от клеточной линии.
    2. Для нанесения покрытия на планшеты для клеточных культур медленно размораживают необходимое количество аликвот MGFr на льду и далее разбавляют их в холодном RPMI, 1:180 для культуры hiPSC (100 μL MGFr в 9 мл RPMI) и 1:80 для повторного покрытия hiPSC-CMs (100 μL MGFr в 4 мл RPMI).
      1. Немедленно добавьте разведенный MGFr в объеме 1 мл на лунку для 6-луночных планшетов (обслуживание hiPSC) и 0,5 мл на лунку для 12-луночных планшетов (повторное покрытие hiPSC-CMs). Перед использованием (до 1 недели) пластины храните при температуре 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с покрытием MGFr следует нагревать до 37 °C в течение 30 минут перед посевом клеток. Перед нанесением покрытия на клетки аспирируйте жидкость из пластины с покрытием MGFr.
    3. Для культивирования hiPSC-CF покройте колбы T75 или T175 0,1% желатином в течение не менее 15 минут при комнатной температуре (RT) перед использованием, в объеме 5 мл для T75 или 10 мл для колб T175. После инкубации аспирируйте жидкость перед посевом клеток.
  2. Среды для клеточных культур
    1. Для посева иПСК используйте Complete Essential 8 Medium (E8 medium), добавив добавку Essential 8 (50x) к Essential 8 Basal Medium.
    2. Для дифференцировки кардиомиоцитов подготовьте:
      1. RPMI/B27 без инсулина (среда -INS): Смешайте 500 мл RPMI и 10 мл B27 без добавки инсулина; RPMI/B27 (B27 средний): Смешайте 500 мл RPMI и 10 мл добавки B27.
    3. Для очистки кардиомиоцитов (лактатная среда) добавьте 2 мл 1 М лактата в 500 мл безглюкозного RPMI 1640. Среда может храниться при температуре 4 °C до 1 месяца.
    4. Для релатирования кардиомиоцитов (Replating Medium) добавьте среду B27 с 10% нокаутирующей заменительной сывороткой (KSR) и 10 мкМ Y27.
      ПРИМЕЧАНИЕ: KSR - это определенная бессывороточная форма, которая заменяет FBS в протоколах культивирования ESC и iPSC.
    5. Для дифференцировки и поддержания фибробластов (начиная с 11-го дня) приготовьте полную среду для роста фибробластов 3 (FGM3) в соответствии с указаниями производителя. Добавьте его упаковку добавок (0,1 мл/мл эмбриональной сыворотки теленка, 5 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека, FGF2) в базальную среду FGM3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стимулирования пролиферации фибробластов рекомендуется увеличить концентрацию FGF2 до 10 нг/мл.
    6. Для получения и поддержания сердечной ткани в 3D необходимо подготовить:
      1. Среда для генерации тканей: Добавьте среду B27 с 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 10% KSR и 10 μМ Y27. Среда для поддержания тканей: Приготовьте среду B27 с 1% P/S и апротинином (0,1% (масс./об.); 33 мкг/мл).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Апротинин обеспечивает целостность фибринового геля в течение всего времени в культуре, предотвращая его деградацию и поддерживая клетки внутри гидрогеля. Поэтому настоятельно рекомендуется добавлять его в среду в тот же день, когда образуется ткань.
  3. Исходные решения на основе малых молекул и факторов роста
    1. CHIR-99021 (CHIR): Для ингибитора GSK3 и активатора сигнализации Wnt приготовьте стоковый раствор массой 10 мМ, растворив его в ДМСО. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Линии гиПСК могут по-разному реагировать на лечение CHIR. Может потребоваться оптимизация концентрации CHIR. Рекомендуется тестирование CHIR на 6-10 мкМ.
    2. C59, Ингибитор Wnt: Приготовьте стоковый раствор 10 мМ, растворив его в ДМСО. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 6 месяцев.
    3. Y-27632, Ингибитор ROCK (Y27): Приготовьте 10 мМ бульон, растворив его в ДМСО. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 1 месяца. Конечная концентрация зависит от типа клеток-мишеней. Используйте 2 мкМ (1/5000) для ИПСК и 10 мкМ (1/1000) для ХМ-ХМ, ХИПСК-КФ и генерации тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Y27 способствует выживанию клеток, подавляя гибель клеток во взвешенном состоянии во время отслойки. Используйте его при сборе урожая, чтобы избежать чрезмерной гибели клеток.
    4. Ретиноевая кислота: Приготовьте стоковый раствор массой 30 мМ, растворив его в хлороформе. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 2 лет.
    5. FGF2 (Рекомбинантный фактор роста фибробластов человека, также FGF-b, способствует пролиферации фибробластов): Приготовьте стоковый раствор в концентрации 50 мкг/мл, растворив его в стерильной воде. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 6 месяцев.
    6. SB431542 (SB), ингибитор передачи сигналов TGFß1: Приготовьте стоковый раствор массой 10 мМ, растворив его в ДМСО. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте его в среду фибробластов для поддержания состояния МВ и предотвращения перехода миофибробластов (патологический фенотип, возникающий при фиброзе) в 2D-культуре.
  4. Стоковые решения для фибринового гидрогеля
    1. Фибриноген: Приготовьте стоковый раствор 200 мг/мл. Сначала измельчите комки фибриногена до мелкого порошка с помощью стерильных инструментов внутри клеточного колпака. Добавьте теплый 0,9% (масс./об.) раствор NaCl и держите его при температуре 37 °C до полного растворения. Хранить аликвоты при температуре -80 °C до года; при 4 °C в течение 1 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за его вязкости при 4 °C размораживайте его и храните при RT некоторое время до этапа образования ткани, чтобы его можно было точно пипетировать. Если аликвота не может быть легко отпижена при повторном использовании, рекомендуется выбросить ее и использовать новую.
    2. Тромбин: Приготовьте стоковый раствор в концентрации 100 Ед/мл, растворив тромбин в стерильном 60% PBS + 40% воды. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до года при температуре 4 °C до 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием разморозьте его и держите на льду до тех пор, пока не завершится этап генерации ткани.
    3. Апротинин: Приготовьте стоковый раствор в дозе 33 мг/мл, растворив апротинин в стерильной воде (100 мг порошка на 3,04 мл воды). Хранить аликвоты при температуре -20 °C до года.
  5. Решения для анализа
    1. FACS буфер (клеточная цитометрия): Приготовьте раствор PBS (Mg2+ и Ca2+-free) плюс 2,5 мМ ЭДТА и 5% (v/v) FBS.

2. Культура и пассаж иПСК человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь процедуры были выполнены с несколькими линиями hiPSC, включая UCSFi001-A (мужской, любезный подарок профессора Брюса Конклина, Институты Дэвида Дж. Гладстона), ESi044-A (мужской), ESi007-A (женский) и ESi044-C (женский) здоровые линии и ESi107-A (женский вид с сердечным амилоидозом) с незначительными адаптациями, относящимися к культуральной среде hiPSC, пассажному разведению и концентрации CHIR. Протокол содержит подробности, относящиеся к использованию UCSFi001-A. Все инкубации клеточных культур в соответствии с этим протоколом проводятся при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 96%.

  1. Культура линии hiPSC на 1:180 MGFr с предварительно нанесенным покрытием 6-луночными планшетами. Поддерживайте их на среде Е8, чтобы обеспечить плюрипотентность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить спонтанную дифференцировку, крайне важно избегать чрезмерного разрастания культур. Поэтому выполняйте проход ИПСК, когда клетки сливаются на 80%-90%.
  2. Для прохождения клеток необходимо аспирировать старую среду, дважды промыть лунки 1 мл 0,5 мМ раствора ЭДТА, разведенного в PBS (Mg2+- и Ca2+-free) на лунку, и инкубировать в течение 7 минут в ЭДТА/PBS при ЛТ, чтобы нарушить межклеточные спайки.
  3. Аспирируйте ЭДТА/PBS и собирайте клетки, отделяя их с помощью энергичного пипетирования с помощью микропипетки объемом 1000 мкл с 1 мл среды E8 по поверхности лунки до тех пор, пока клетки не отделятся. Соберите их в стерильную центрифужную пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пипетирования более 10-15 раз, так как это увеличит смертность от ИПСК
  4. Из этого объема сделайте разведения в соотношении 1:15-1:20 и затравите клетки на 6-луночные планшеты с покрытием MGF в среду E8 + 2 μМ Y27. Сохраняйте Y27 только в течение первых 24 ч после посева, чтобы избежать токсичности из-за чрезмерного воздействия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте коэффициент расщепления для других линий ИПСК для поддержания клеток в недифференцированном состоянии и здоровой морфологии в течение 4-5 дней.
  5. Через 24 ч отсадить старую среду и добавить свежую среду комнатной температуры Е8 хватит на двое суток (обычно 3-4 мл). После этого меняйте среду каждый день в течение 3-4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота прохождения зависит от каждой клеточной линии; Избегайте достижения 100% конфлюенции. ИПСК должны расти большими, плоскими и компактными колониями с полигональной геометрией, сглаженными краями и высоким соотношением ядра и цитоплазмы.

3. Дифференцировка кардиомиоцитов человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для генерации кардиомиоцитов из ИПСК (ИПСХ-КМ) описанный протокол основан на методологии дифференцировки монослоев, используемой Lian et al.3,15 и Burridge et al.4. При надлежащем техническом обслуживании hiPSC может быть дифференцирован на протяжении 30 последовательных проходов с высокой эффективностью дифференцировки. Признаки аномального поведения обнаруживаются по спонтанной дифференцировке или последовательному провалу более 4 дифференцировок. Рекомендуется регулярный контроль, включая тестирование на микоплазму.

  1. Чтобы инициировать сердечную дифференцировку, собирайте ИПСК при 80%-90% слиянии, как описано на шаге по прохождению клеток выше (шаг 2). Затравочные клетки в 12-луночных планшетах с покрытием MGFr в масштабе 1:180 с регулировкой разделенных разведений для получения монослоев компактных ячеек при 90% слиянии после 48-72 ч посева. Для этой клеточной линии сделайте разведение 1:10, и клетки достигнут конфлюенции через 72 ч. Меняйте среду E8 ежедневно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: в этом протоколе разведения были скорректированы по объему, а не по количеству клеток, чтобы избежать вариабельности, зависящей от пользователя. Если состояние монослоя не будет достигнуто в течение 72 ч после нанесения покрытия, то весьма вероятно, что процесс дифференцировки не будет успешным. В таком случае рекомендуется отказаться от попытки и начать заново, обеспечив оптимальную эффективность паса.
  2. Когда монослои стабилизируются, начинается процесс дифференцировки, который в дальнейшем рассматривается как день 0. Затем смените среду на среду -INS с добавлением 8 мкМ CHIR, активатора передачи сигналов Wnt, и инкубируйте планшет в течение 24 ч при 37 °C (1 мл на лунку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титровать концентрацию CHIR в диапазоне 6-12 мкМ для каждой линии iPSC для эффективной индукции мезодермы. На этом этапе ожидается высокий уровень гибели клеток, что является признаком оптимального процесса.
  3. День 1: На следующий день аспирируйте среду из каждой лунки и промойте клетки RPMI без добавок (0,5 мл на лунку). Затем добавьте 1,5 мл свежей среды -INS и инкубируйте клетки в течение 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы промывки выполняются во время каждой смены среды для удаления мусора, омертвевших клеток и остатков добавок.
  4. День 3: Для стимуляции кардиологической линии замените среду 1,5 мл среды -INS с добавлением 5 мкМ ингибитора Wnt C59 в течение 48 ч.
    Примечание: Здесь образуется комплекс GSK3, а ß-катенин разрушается, что приводит к сердечной мезодермальной линии. После этого шага также наблюдается некоторая гибель клеток.
  5. День 5: Промыть и заменить свежей средой -INS на 48 ч в объеме 1,5 мл на лунку, чтобы способствовать расширению сердечных предшественников.
  6. День 7: С этого дня клетки поддерживаются в среде B27, при этом среда меняется каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество среды до 2,5 мл на лунку, чтобы не менять среду в выходные дни, но только после достижения этого состояния. В норме ИПСХ-СМ начинают спонтанно биться на 7-9 день. Сначала сжатие будет наблюдаться в виде изолированных и нескоординированных кластеров, но через несколько дней культуры высокой чистоты должны образовать равномерный бьющий монослой.
  7. После получения эти сократительные монослои (обычно на 10-й день) подвергают процессу метаболической селекции, состоящему из 2 циклов по 72 ч в лактатной среде, разделенной стадией реплайкинга для элиминации некардиомиоцитарных клеток и обогащения чистоты культуры.
  8. День 10, первый этап очистки (1-й лактат): Промойте бьющие клетки лактатной средой (0,5 мл на лунку) и инкубируйте их с 1 мл лактатной среды на лунку в течение 72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап промывки должен быть выполнен с использованием лактатной среды или базальной безглюкозной среды RPMI 1640, чтобы полностью удалить все следы предыдущей глюкозной среды (B27).
  9. День 13: Промойте и дайте клеткам восстановиться после первого раунда очистки по 1,5 мл на лунку среды B27 в течение 2 дней.
  10. День 15 (этап повторного покрытия): Между двумя циклами очистки диссоциировать монослои путем промывки ЭДТА/PBS и инкубации с TrypLE в течение 10 минут при 37 °C (0,5 мл на лунку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от каждой клеточной линии.
  11. Отделите клетки с помощью микропипетки объемом 1000 мкл и извлеките их с помощью 0,5 мл на лунку среды B27 с добавлением 10% KSR (v/v) в стерильной центрифужной пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты чувствительны к напряжению сдвига и сильному пипетированию, поэтому старайтесь избегать повторных этапов пипетирования. Другими вариантами диссоциации hiPSC-CM с меньшим повреждением могут быть использование TrypLE 10x или коллагеназы с ДНКазой. Оптимизируйте время инкубации, чтобы убедиться, что оно достаточно для отслойки клеток, не вызывая повреждения клеток и не требуя чрезмерного пипетирования, которое может нарушить целостность клеток.
  12. Центрифугируйте в течение 10 мин при 100 x g при RT и повторно наденьте их в 12-луночные планшеты с покрытием 1:80 MGFr с восстанавливаемой средой. Высевайте их по 1 мл на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это удалит лишние мертвые клетки и матрикс, отложенные во время дифференцировки, так как они могут впоследствии оказать негативное влияние на генерацию тканей.
  13. День 16: Через 24 ч после повторного нанесения удалите Y27 и KSR и оставьте клетки в среде B27 до следующего этапа очистки (обычно 48-72 ч).
  14. День 18: Второй этап очищения (2-й лактат). Как и в первом цикле, промойте и инкубируйте клетки с лактатной средой в течение 72 ч (1 мл на лунку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Циклы очистки могут повысить чистоту культуры до 30%, как это видно при анализе проточной цитометрии кардиомиоцитарного маркера cTNT (сердечного тропонина T) (не показано). Этот процесс в первую очередь уменьшает загрязнение фибробластами и оставшимся иПСК Несмотря на то, что минимально допустимый уровень чистоты, необходимый для продолжения формирования тканей без ущерба для выхода, не определен, рекомендуется использовать культуры с чистотой не менее 85%-90%. Этот уровень чистоты способствует улучшению прикрепления кардиомиоцитов, повышает сократительную прочность конечной ткани и поддерживает воспроизводимость между экспериментами.
  15. День 21: Когда очищение лактата завершено, поддерживать очищенные кардиомиоциты в среде В27 до их применения, с частой сменой сред (каждые 2-3 дня).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка в использовании уменьшит производительность ячеек, так как их будет сложнее отсоединить. Следовательно, рекомендуется использовать их в период между днем окончания второй очистки лактата и менее чем через неделю.

4. Дифференцировка сердечных фибробластов человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения сердечных фибробластов человека (hiPSC-CFs) из hiPSCs следующий протокол основан на двухфазной методологии, используемой Zhang et al.16. Первым шагом является получение эпикардиальных клеток (hiPSC-EpiCs) путем реактивации сигнального пути Wnt после индукции кардиогенной мезодермы. Затем hiPSC-EpiC подвергаются воздействию ингибиторов развития сосудов и FGF2 для получения сердечных фибробластов в течение 18 дней.

  1. Обеспечьте техническое обслуживание, сбор урожая и плотность посева hiPSC, как описано в протоколе дифференциации hiPSC-CM. Культивируйте гиПСК на 12-луночных планшетах с покрытием MGFr в масштабе 1:180 для начала дифференцировки.
  2. При достижении компактных монослоев hiPSC (день 0) добавляют среду -INS с добавлением 5 мкМ ЦИР (1,5 мл на лунку) в течение 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титруйте концентрацию CHIR для каждой линии hiPSC для эффективной индукции мезодермы.
  3. День 2: Отсадите и выбросьте среду, промойте клетки с помощью RPMI и замените ее 1,5 мл свежей среды -INS на 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в протоколе hiPSC-CMs, промывайте клетки при любой смене среды; В зависимости от каждого этапа используйте соответствующую недополненную базальную среду.
  4. День 3: Инкубируйте клетки средой -INS, содержащей 5 мкМ C59 (ингибитор Wnt) в течение 48 ч (1,5 мл на лунку).
  5. День 5: Для восстановления мезодермальных клеток сердца отделите клетки путем промывания ЭДТА/PBS и инкубации с TrypLE в течение 5 минут при 37 °C (0,5 мл на лунку). Соберите клетки по 0,5 мл на лунку базальной среды Advance DMEM (ADMEM) и центрифугируйте в течение 5 мин при 300 x g при RT.
  6. Засейте их в 12-луночные планшеты с предварительным покрытием 1:180 MGFr (1 мл на лунку) с плотностью 20 000 клеток/см2. Для повторного покрытия используйте ADMEM с добавлением 5 мкМ CHIR, 2 мкМ ретиноевой кислоты, 10% KSR (v/v) и 10 μМ Y27.
  7. День 6: Через 24 часа после повторного нанесения покрытия обновите среду, чтобы удалить Y27 и уменьшить KSR до 2%. Поддерживайте те же концентрации CHIR и ретиноевой кислоты в течение еще 48 ч для достижения развития эпикардиального фенотипа.
  8. День 8: Культивирование клеток с добавкой ADMEM плюс 2% KSR в течение 72 ч для стимуляции образования монослоев эпикарда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: hiPSC-EpiCs представляют собой плоские или кубические большие клетки, сгруппированные в одиночные колонии. В этот момент, при проведении первых раундов дифференцировки, типичные маркеры эпикардиальных клеток, такие как WT1 (ядерный антиген), ZO1 (антиген цитоплазматической мембраны) и TCF21 (цитоплазматический антиген), могут быть проанализированы с помощью FACS (проточной клеточной цитометрии) или IF (иммунофлуоресцентного окрашивания) (не показано).
  9. День 11: Для повторного нанесения эпикардиальных клеток диссоциировать промывку hiPSC-EpiCs с помощью ЭДТА/PBS и инкубировать с TrypLE в течение 5 минут при 37 °C (0,5 мл на лунку). Соберите клетки в среду FGM3 (0,5 мл на лунку) и центрифугируйте в течение 5 мин при 300 x g при RT.
  10. Перепоставьте hiPSC-EpiC в 12-луночные планшеты, покрытые желатином с 0,1% желатиновым покрытием, при плотности клеток 10 000 клеток/см2. Используйте среду FGM3 с добавлением 10 мкМ SB (ингибитора передачи сигналов TGFß1 для предотвращения перехода миофибробластов, обычно во время культивирования на пластике) и 10 мкМ Y27 (только в течение первых 24 ч).
  11. На следующий день обновляйте среду фибробластов (FGM3 + 10 мкМ SB) каждые 2 дня до получения hiPSC-CF, что в общей сложности составляет около 18 дней для всего процесса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: hiPSC-CF должны иметь веретенообразную морфологию. В этом случае экспрессия маркера фибробластов DDR2 должна быть проанализирована методами FACS и IF (см. шаги 7.1-7.2).
  12. После того, как культура hiPSC-CF сливается, выполните пассаж клеток 1:3 в колбах T75 или T175, предварительно покрытых желатином. Клетки достигают 90% слияния примерно за 4-6 дней. Чтобы отсоединить hiPSC-CF, используйте протокол сбора TrypLE, описанный для восстановления hiPSC-EpiCs; здесь Y27 не требуется для прохождения.
  13. Поддерживайте hiPSC-CF в среде FGM3 + 10 мкМ SB до их использования или замораживайте их при низком пассаже при плотности клеток 1-3 миллиона клеток на криопробирку.
    Примечание: Рекомендуется поддерживать hiPSC-CF максимум в течение 6 пассажей перед размораживанием новых клеток, так как при длительном культивировании в пластиковых колбах клетки начинают дифференцироваться в более сократительный фенотип миофибробластов.

5. Изготовление электропрядильных скаффолдов из расплава

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется гомополимер поли ε-капролактона (PCL) медицинского класса для печати фибриллярных каркасов с использованием принтера MEW, специально разработанного для этой цели QUT, Квинслендским технологическим университетом10.

  1. Подготовьте полимерную заготовку PCL к печати. Загрузите гранулы PCL в пластиковый шприц Luer-lock объемом 3 мл, прикрепленный к игле 23 G, и растопите их при 80 °C в течение 2 часов в духовке, осторожно нажимая на поршень, чтобы удалить любые пузырьки во время плавления полимера. Подготовьте несколько шприцев и храните их в RT, так как PCL быстро затвердевает.
  2. В день печати введите шприц внутрь нагревательной камеры и подсоедините его к находящейся под давлением подающей трубе N2 . Включите оборудование MEW, установите регуляторы температуры на 80/65 °C (камера/сопло) и подержите шприц в течение 30 минут, чтобы обеспечить правильное плавление полимера.
  3. Под шприцем находится коллекторная пластина, моторизованная и перемещаемая в направлениях XY с помощью совместимого программного обеспечения (Mach3). Перемещайте коллекторную пластину (управление компьютерным курсором) до тех пор, пока печатающая головка не будет размещена на одном краю пластины или в любом желаемом месте, и отрегулируйте расстояние между камерой нагрева и коллекторной пластиной (расстояние коллектора) вручную с точностью до 10 мм (плоскость Z).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние должно быть экспериментально проверено для достижения заданного диаметра волокна. Чем меньше расстояние между коллекторами, тем толще волокно, и наоборот.
  4. Закройте дверцу оборудования, к которому автоматически подключается электроподача. Установите напряжение на 7 кВ и давление N2 на 2 бар, чтобы он мог выдавливаться через наконечник 23 G во время печати.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При подаче высокого напряжения создается разность потенциалов между кончиком шприца и коллекторной пластиной (изготовленной из нержавеющей стали). Затем капля, накопленная на сопле под действием подаваемого давления, становится электростатически заряженной, образуя конус Тейлора, который движется к коллекторной пластине. Напряжение и давление могут быть настроены для изменения конечных размеров волокна. Параметры высокого давления будут выдавливать более толстые волокна, требуя повышенного напряжения для стабилизации волокна. Программное обеспечение основано на числовом компьютерном управлении (ЧПУ), поэтому геометрия скаффолдов записывается в виде G-кода и подается в программу, которая управляет движением X-Y и скоростью двигателя коллекторной пластины. Таким образом, перед печатью окончательных скаффолдов рекомендуется напечатать любой G-код в качестве предыдущего шага, чтобы получить стабильную струю, которая строит определенные волокна без какой-либо скручивания или взбивания. Для этого каждый раз оптимизируйте параметры небольшими изменениями, например, 0,1 бар для давления воздуха, 0,1 кВ для напряжения и 60-100 мм/мин для скорости коллектора; Это обеспечит конусное поведение струи по Тейлору.
  5. Выберите разработанный G-код в программном обеспечении для печати скаффолдов с квадратной геометрией. В этом примере G-кода печатаются 15-слойные квадратные сетки размером 6 см x 6 см с квадратными порами размером 0,5 мм x 0,5 мм.
  6. Чтобы напечатать точно нанесенные волокна (т. е. волокна внахлест), отрегулируйте скорость коллектора до 1080 мм/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте параметры напряжения, давления, скорости коллектора и расстояния до коллектора на каждом оборудовании MEW, чтобы определить точный диаметр волокна (мкм). Помимо влияния ранее упомянутых параметров, увеличение скорости коллектора приводит к утончению волокон, в то время как уменьшение ее приводит к более толстым волокнам. Настройки параметров в этом протоколе позволяют печатать волокна диаметром 10-15 мкм.
  7. Нажмите кнопку СТАРТ в программном обеспечении, чтобы начать печать. Осторожно снимите скаффолд с коллектора после завершения печати.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения работы со скаффолдом после печати рекомендуется распечатать его на стеклянном куске размером больше каркаса, закрепленном на основании коллектора с помощью клейкой ленты.
  8. Разрежьте напечатанную сетку пуансоном диаметром 6 мм, чтобы получить окончательные каркасы для изготовления ткани.
  9. Поскольку сетки PCL обладают высокой гидрофобностью, обрабатывайте их в течение 5 минут плазмой O2/аргона, чтобы повысить их гидрофильность и способствовать взаимодействию с фибрином и клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, также работает обработка 0,1 Н NaOH в течение 15 минут, за которой следует обширное промывание PBS.
  10. Стерилизуйте сетки погружением в 70% этанол на 30 минут, тщательно промойте стерильной дистиллированной водой в течение 30 минут и дайте высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проделайте этот процесс в стерильной чашке Петри и в стерильной вытяжке. Не высушивайте сетки полностью до тех пор, пока они не будут использованы, чтобы избежать их прилипания к плите и последующей деформации.

6. Генерация и поддержание мини-тканей фибрина

ПРИМЕЧАНИЕ: Создание 3D-мини-тканей миокарда человека основано на инкапсуляции сердечных клеток, полученных из hiPSC, в фибриновых гидрогелях в сочетании с каркасами MEW, которые обеспечивают фибриллярную поддержку. Приведенный ниже протокол был адаптирован на основе подходов к инженерному проектированию, использованных Breckwoldt et al.17 и Ronaldson-Bouchard et al.18.

  1. Отсоедините hiPSC-CM, как описано выше на этапе повторного покрытия (3.10-3.11) протокола дифференцировки hiPSC-CM (сбор TrypLE). Повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде для генерации тканей для подсчета клеток в камере Нейбауэра.
  2. Отсоедините hiPSC-CF, как на этапе сбора данных hiPSC-CM, с помощью TrypLE. Используйте 3 мл TrypLE для T75, 5 мл для колб T175 и такой же объем для инактивации инкубации TrypLE. Наконец, ресуспендируйте клеточную гранулу в среде для генерации тканей, как и для КМ, так как они будут смешиваться и культивироваться в одной и той же среде.
  3. Подсчитайте ячейки в камере Нейбауэра. Рассчитайте точное общее количество клеток, необходимое для посева всех тканей.
    Примечание: В этом протоколе используется 1 миллион клеток на ткань, состоящая на 80% из КМ и на 20% из ЦВ, т.е. 800 000 КМ и 200 000 ЦВ. Другие величины, такие как 1,5 и 3 миллиона на ткань, также достижимы с практикой.
  4. Смешайте и гранулируйте необходимое общее количество клеток в новой пробирке (Cell Mix) в течение 5 минут при 300 x g при RT. Убедитесь, что гранула полностью высохла, и держите ее на льду до посева. Рассчитайте общий объем гидрогеля, необходимый для посева всех тканей.
    Примечание: Этот протокол требует 35 мкл на ткань (для размера каркаса 6 мм в диаметре) до конечной плотности, близкой к 30 миллионам клеток/мл, но ее можно увеличить, как уже упоминалось в шаге 6.4 выше. Каждый фибриновый гидрогель состоит из 6 мг/мл фибриногена плюс 5 ЕД/мл тромбина вместе со средой для генерации тканей, в которой клетки ресуспендированы. Для гидрогеля объемом 35 мкл соотношение фибриноген/тромбин составляет 1,05 мкл/1,8 мкл. Рекомендуется использовать на 10% больше конечного объема гидрогеля, чтобы избежать потери объема из-за ошибок пипетирования. Пример: для 10 тканей ресуспендировать клетки в 350 мкл + 10%, т. е. 385 мкл в качестве общего конечного объема.
  5. Суспендируйте клеточную смесь в необходимом объеме тканевой среды. Тщательно перемешивайте, не допуская образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 10 тканей ресуспендируйте 10 миллионов клеток (80 КМ:20 КФ) в 374,5 мкл среды для генерации тканей (общий объем гидрогелей за вычетом общего количества фибриногена, необходимого для всех тканей, т.е. 10,5 мкл).
  6. Добавьте необходимый объем фибриногена и тщательно перемешайте. Для 10 тканей добавьте 10,5 мкл фибриногена в клеточную смесь, образуя гидрогелевую смесь. Оставьте его на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать чрезмерно повторяющегося пипетирования, чтобы сдвиговые силы не влияли на жизнеспособность hiPSC-CM. Рекомендуется отрезать кусочек от кончика наконечника пипетки стерильным скальпелем, а затем повторно суспендировать с ним смесь гидрогелей , чтобы уменьшить повреждение сдвигом.
  7. Чтобы избежать прилипания фибрина к пластине, затравите гидрогелевую смесь на поверхность политетрафторэтилена (ПТФЭ). Пипеткой пипеткой направьте половину объема ткани (17,5 μл), которая останется в виде капли, и сделайте это на общее количество тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте более 10 салфеток за раз, так как они могут высохнуть.
  8. Поместите каркас PCL поверх каждой капли и добавьте оставшийся объем (17,5 мкл). Убедитесь, что строительные леса полностью погружены в воду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте готовы к пипетированию обеими руками, так как реакция происходит очень быстро. По одной салфетке за раз.
  9. Добавьте необходимое количество тромбина (1,8 мкл) недоминирующей рукой и быстро перемешайте гидрогель доминирующей рукой (пипетируя не менее 2-3 раз).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно смешивать пипетированием меньше общего объема, чтобы избежать образования пузырьков (30 μл). Если образовался пузырь воздуха, быстро проколите его иглой.
  10. Повторите предыдущий шаг для каждой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется практиковать эту технику без ячеек до тех пор, пока не будет обеспечено хорошее обращение.
  11. Инкубируйте ткани при 37 °C в течение 1 ч для завершения полимеризации фибрина.
  12. Аккуратно возьмите каждую салфетку за край стерильным пинцетом и поместите их в 12-луночные планшеты по 2 мл на лунку среды для генерации тканей с добавлением 33 мкг/мл апротинина. Положите по одной салфетке в лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не берите их за центр гидрогеля, чтобы клетки не могли быть повреждены механической силой. При необходимости используйте шпатель.
  13. Инкубируйте ткани в течение 24 ч при 37 °C.
    Примечание: Крайне важно поддерживать апротинин в среде для культивирования тканей со дня генерации, так как было замечено, что пропуск апротинина в течение первых 24 часов, даже при добавлении позже, приводит к частичному отделению клеток от сетки и гидрогеля. Это ставит под угрозу полное покрытие клеток, необходимое для целостности конечной ткани.
  14. На следующий день обновите среду 2 мл среды для поддержания тканей, удаляя остатки KSR и Y27. С этого момента меняйте среду через день.

7. Систематический анализ сердечного дифференцировочного потенциала ИПСК и функции мини-тканей

  1. Анализ проточной цитометрии
    Примечание: Клетки анализируют с использованием цитометрического метода «Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток» (FACS) для определения эффективности дифференцировки hiPSC. Все действия выполняются при комнатной температуре.
    1. Диссоциировать клеточные культуры на одноклеточную суспензию (сбор TrypLE), как hiPSC-CM, так и CF по отдельности.
    2. Повторно суспендируйте гранулу при концентрации 250 000 клеток/мл в буфере FACS и дозируйте не менее 1 мл на пробирку. Инкубировать в течение 30 минут, чтобы избежать связывания неспецифических антител.
    3. Центрифугируйте ячейки при 300 x g при RT в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования выполняются в этих условиях.
    4. Для обнаружения внутриклеточных антигенов фиксация и пермеабилизация клеточных мембран с помощью набора для проникновения клеток. Сначала инкубируйте клетки с Reactive A (Fix) в течение 30 мин и центрифугируйте (как на шаге 7.1.3).
    5. Затем инкубируйте клетки с реактивным B (Perm) плюс первичное антитело в течение 30 минут. Используйте 100 мкл реактивной реакции на каждую пробирку.
      1. Для лечения hiPSC-CM используйте мышиные антитела cTNT (сердечный T-тропонин, маркер CM) в разведении 1/200. Для лечения hiPSC-CF используйте мышиное антитело DDR2 (коллагеновый рецептор, маркер CF) в разведении 1/500.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы остановить все реакции, добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку перед центрифугированием.
    6. Инкубировать в течение 15 мин с вторичным антителом против мышей Alexa-Fluor 488, разведенным в 1/100 в буфере FACS.
    7. Промойте PBS 3 раза, центрифугируя между промывками (в тех же условиях, что и в шаге 7.1.3), и, наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл PBS. Проанализируйте в цитометре или аналогичном приборе.
  2. Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания (ИФ)
    1. Для 2D-культур сердечных клеток затравливайте оба типа клеток отдельно в лунке для культуральных камер с предварительным покрытием из желатина 1:80 или 0,1% желатина. Нанесите примерно 80 000 клеток/см2 , чтобы достичь достаточного слияния клеток для анализа. Для 3D мини-салфеток аккуратно перенесите их пинцетом в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
    2. Выбросьте клеточную среду и промойте клетки или ткани PBS дважды. Зафиксировать образцы 10% формалином (v/v) в RT; 15 минут для камеры слайдов и 1 час для мини-салфеток.
      ВНИМАНИЕ: Формалин опасен при вдыхании и должен работать в вытяжном шкафу.
    3. Выбросьте фиксирующий буфер и трижды промойте 5 мин PBS. Храните образцы при температуре 4 °C в PBS до их использования.
    4. Чтобы проникнуть в клеточную мембрану, инкубируйте клетки с 0,1% Triton X-100 (v/v) в течение 10 минут или 3D ткани с 1% Tween-20 в течение 15 минут в режиме RT. Затем трижды промыть 5 мин PBS.
    5. Для уменьшения связывания неспецифических антител обрабатывайте образцы 3% (v/v) раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин в режиме ЛТ.
    6. Приготовьте первичные растворы антител в PBS плюс 1% BSA для блокирования неспецифических связываний и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C.
      1. Для 2D hiPSC-CM используйте 1/400 разведение антикардиального антитела α-ACTN (саркомерного актинина) мыши. Для 2D hiPSC-CF используйте 1/500 разведение антител мыши Anti-DDR2. Для 3D-тканей комбинируйте два CM- и CF-специфических антитела.
    7. На следующий день аспирируйте раствор антитела и выполните 3 промывки PBS в режиме RT по 5 мин каждое.
    8. Разбавляют вторичные антитела (Alexa-Fluor 488 и Alexa-Fluor 594) при 1/200 и инкубируют в течение 1 ч при ЛТ в темноте для идентификации первичных антител у мышей и кроликов, соответственно. Повторите промывку PBS три раза.
    9. Для противостояния ядрам инкубируйте образцы с разведением 1/500 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 20 мин при РТ в темноте. Повторите промывку PBS три раза и храните образцы при температуре 4 °C в PBS.
    10. Исследуйте образцы с помощью конфокального микроскопа, получайте изображения и обрабатывайте их с помощью подходящего программного обеспечения, такого как Fiji.
    11. Для 3D-мини-салфеток аккуратно перенесите их с помощью PBS между двумя стеклянными покровными стеклами, чтобы обеспечить хорошее изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений Z-стека с высоким разрешением рекомендуется использовать объектив с 40-кратным погружением в масло или выше.
  3. Анализ жизнеспособности клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ Alamar Blue (AB) используется для измерения метаболической активности клеток, которая напрямую связана с жизнеспособностью клеток в 3D-мини-тканях сердца. Выполняйте весь процесс, защищая образцы от света и в стерильных условиях.
    1. Приготовьте 10% (v/v) раствор AB в среде RPMI 1640 без фенольного красного (так как он может помешать колориметрическому измерению).
    2. Осторожно перенесите мини-ткани сердца в 48-луночный планшет со стерильным пинцетом. Инкубировать конструкции с 300 мкл раствора AB на ткань в течение 1 ч 30 мин (время экспериментальной коррекции) при 37 °C.
      Примечание: По мере того, как клетки восстанавливают резазурин под действием метаболических ферментов, происходит изменение цвета питательной среды, которое измеряется с помощью спектрофотометрии при 570 нм и 600 нм.
    3. Для измерения соберите 100 мкл метаболизированного раствора AB на ткань в 96-луночный планшет и считайте абсорбцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого анализа образцы можно культивировать, еще раз сменив среду на среду для поддержания тканей.
  4. Анализ сжатия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мини-ткани сердца начинают спонтанно биться, обычно через 1-2 дня после образования тканей.
    1. Вручную измерьте частоту биения, наблюдая за тканями под оптическим микроскопом (уд/мин). Если одновременно измеряется много тканей, держите пластины в тепле перед каждым снятием показаний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По мере снижения температуры скорость взбивания также начинает уменьшаться.
    2. Для оценки расширенной сократимости сердца получите видео с помощью оптической микроскопии бьющихся тканей. В 4 раза для захвата более крупной плоскости или в 10 раз из разных участков тканей. Записывайте около 30 секунд на видео (не менее 3 ударов).
    3. Используйте частоту кадров не менее 30 кадров/с и сохраните видео в .AVI формате.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь видео были проанализированы с помощью специально разработанного для MATLAB10 алгоритма отслеживания точек. С помощью этого метода можно получить скорость сжатия, максимальное смещение (амплитуду) сжатия и направление сжатия для каждого видео.
    4. Непосредственно запустите алгоритм в MATLAB для видео, содержащихся в папке анализа. Он автоматически предоставит документ Results Excel со значениями скорости сжатия на кадр, амплитуды сжатия на кадр, угла (направления) сжатия и соответствующих стандартных отклонений10.
    5. Умножьте «Скорость сжатия за кадр» на разрешение камеры (мкм/пиксель) и на частоту кадров камеры (кадры/с). Это даст конечное значение скорости сжатия (мкм/с).
    6. Умножьте «Амплитуду сжатия на кадр» на разрешение камеры (мкм/пиксель), и это даст итоговое значение амплитуды сокращения (мкм).
      Примечание: Можно было бы более глубоко проанализировать кинетику сокращения с помощью программного обеспечения, такого как MUSCLEMOTION, как обсуждалось в других разделах19,20. Система обработки изображений должна захватывать не менее 60 кадров в секунду для анализа с помощью программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика 2D клеток сердца, полученных из hiPSC
Для создания мультифенотипических тканей hiPSC-CM и hiPSC-CFs независимо дифференцируются и характеризуются in vitro. При соответствующей оптимизации и строгом обслуживании следующий протокол приведет к выходу hiPSC-CMs более 80% примерно на 9-й день дифференцировки, что приведет к спонтанному биению клеток (Рисунок 1A). Кроме того, обогащение чистоты путем метаболического отбора в значительной степени устраняе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы создать 3D-композитную модель сердечной мини-ткани, которая воспроизводит естественные характеристики миокарда человека, необходимо учесть несколько важных факторов. Их можно сгруппировать по трем основным пунктам: (1) оптимизация выхода и чистоты клеток для изготовления тканей, (2) печать фибриллярного каркаса для имитации 3D-механической среды и (3) интеграция фибринового гидрогеля в процесс изготовления.

Некоторые из ключевых шагов для обеспечения усп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование финансировалось в рамках программы исследований и инноваций H2020 в рамках грантовых соглашений No 874827 (BRAVfigure-acknowledgements-1); Ministerio de Ciencia y Universidades (Испания) в рамках проектов PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT), PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) и PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA), финансируемых MICIU/AEI /10.13039/501100011033 и Европейским союзом NextGenerationEU/PRTR; Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) и BIOHEART (0011-1411-2022-000071); Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) и Gobierno de Navarra Salud GN32/2023. Рисунки 1A, 2A и 4A создаются с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
µ-Slide 8 Луночный покровный стакан камеры (IbiTreat)IBIDI80826
0,1% раствор желатина (Embryomax)Merck MilliporeES-006-B
10% формалинSigma AldrichHT501128
12-луночные планшетыCostar/Corning3513
6-луночные планшетыCostar/Corning3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)Gibco12491015
Апротинин из бычьего легкогоSigma AldrichA1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x) Life TechnologiesA317504044
ДОБАВКА B27, МИНУС ИНСУЛИН (50x)Life TechnologiesA1895601
Biopsy Punch (диаметр 6 мм)МедицинскийBP-60F
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma AldrichA9647
CHIR-99021 AXON MEDCHEMAXON1386
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM 800
Колба для культур 175 смGreiner Bio-One660175
Колба для культур 75 смFalcon353136
ЦитометрBeckman CoulterCytoFlex 
DAPI Sigma AldrichD9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21202 
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 594InvitrogenA-21207 
DPBS (без Mg2+, Ca2+)GibcoA314190094
EDTA 0,5M pH 8.0Life TechnologiesAM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KITLife TechnologiesA1517001
FGF2 (рекомбинантный человеческий FGF-basic 154 a.a.)Peprotech100-18B
Фибриноген из плазмы крупного рогатого скотаSigma AldrichF8630
Среда для роста фибробластов 3 КИТ (FGM3)PromoCellC-23130
Нокаут-сыворотка для замены (KSR)Life Technologies10828028
лактата (L-лактата натрия)Sigma Aldrich71718
Матрица базальной мембраны с уменьшенным фактором роста Matrigel (MGFR),Corning354230
Игла MEW 23-GNordson
Принтер MEWQUT, Технологический университет Квинсленда Шприц
MEWNordson7012072
мыши Моноклональное антитело к сердечному тропонину ТInvitrogenMA5-12960 
Мышиное анти-DDR2 моноклональное антителоSigma AldrichSAB5300116
мыши Anti-α-актинин (саркомерный) Моноклональное антителоSigma AldrichA7811 
ПЕНИЦИЛЛИН - СТРЕПТОМИЦИНLife Technologies15140122
Поли ε-капролактон (PCL), медицинский сортCorbionPURASORB PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Рекомбинантное моноклональное антитело [EPR3776] - маркер цитоскелетаabcamab29547 
Ретиноевая кислота Sigma AldrichR2625
ROCK ингибитор Y-27632 (10 мг)Fisher ScientificHB2297
RPMI 1640 (L-глутамин)Gibco21875034
RPMI 1640 (без фенола красного)Gibco32404014
RPMI без глюкозыGibco11879020
SB431542SELLECK CHEMICALSS1067
Спектрофотометр BMG Labtech SPECTROstar Nano
Thrombin (человеческий альфа-тромбин, фактор IIa)Enzyme Research LabHT 1002a
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypLE ExpressLife Technologies12604021
Tween 20Sigma AldrichP2287
Wnt-C59AXON MEDCHEMAXON2287
7018302

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, S., et al. Challenges and opportunities for the next generation of cardiovascular tissue engineering. Nat Methods. 19 (9), 1064-1071 (2022).
  2. Garbern, J. C., Lee, R. T. Heart regeneration: 20 years of progress and renewed optimism. Dev Cell. 57 (4), 424-439 (2022).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  4. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Curr Protoc Hum Genet. 87 (21), 21.3.1-21.3.15 (2015).
  5. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Adv Drug Deliv Rev. 96, 110-134 (2016).
  6. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. J Thorac Dis. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  7. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circ Res. 118 (3), 400-409 (2016).
  8. Brown, T. D., Dalton, P. D., Hutmacher, D. W. Direct writing by way of melt electrospinning. Adv Mater. 23 (47), 5651-5657 (2011).
  9. Vernon, M. J., et al. Engineering heart valve interfaces using melt electrowriting: Biomimetic design strategies from multi-modal imaging. Adv Healthc Mater. 11 (24), 2201028(2022).
  10. Montero-Calle, P., et al. Fabrication of human myocardium using multidimensional modeling of engineered tissues. Biofabrication. 14 (4), 045017(2022).
  11. Castilho, M., et al. Melt electrospinning writing of poly-hydroxymethylglycolide-co-ε-caprolactone-based scaffolds for cardiac tissue engineering. Adv Healthc Mater. 6 (18), 1700311(2017).
  12. Castilho, M., et al. Melt electrowriting allows tailored microstructural and mechanical design of scaffolds to advance functional human myocardial tissue formation. Adv Funct Mater. 28 (40), 1803151(2018).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  14. Palaskas, N. L., Ali, H. J., Koutroumpakis, E., Ganatra, S., Deswal, A. Cardiovascular toxicity of immune therapies for cancer. BMJ. 385, e075859(2024).
  15. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2012).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circ Res. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human-engineered heart tissue. Nat Protoc. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239(2018).
  19. Rivera-Arbeláez, J. M., et al. Automated assessment of human-engineered heart tissues using deep learning and template matching for segmentation and tracking. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10513(2023).
  20. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circ Res. 122 (3), e5-e16 (2018).
  21. Reyat, J. S., et al. Modeling the pathology and treatment of cardiac fibrosis in vascularised atrial and ventricular cardiac microtissues. Front Cardiovasc Med. 10, 1156759(2023).
  22. Park, J. H., et al. Materials and extracellular matrix rigidity highlighted in tissue damages and diseases: Implication for biomaterials design and therapeutic targets. Bioact Mater. 20, 381-403 (2023).
  23. Wunner, F. M., et al. Melt electrospinning writing of three-dimensional poly(ε-caprolactone) scaffolds with controllable morphologies for tissue engineering applications. J Vis Exp. 130, e55617(2017).
  24. Robinson, T. M., et al. The next frontier in melt electrospinning: Taming the jet. Adv Funct Mater. 29 (44), 1904664(2019).
  25. Kade, J. C., Dalton, P. D. Polymers for MELT electrowriting. Adv Healthc Mater. 10 (1), 2001232(2021).
  26. Inchingolo, M., et al. Polycaprolactone in bone tissue engineering: A comprehensive review of innovations in scaffold fabrication and surface modifications. J Funct Biomater. 15 (9), 243(2024).
  27. Mondadori, C., et al. Assessing the response of human primary macrophages to defined fibrous architectures fabricated by melt electrowriting. Bioact Mater. 21, 209-222 (2022).
  28. Xu, C., et al. Melt-electrowriting-enabled anisotropic scaffolds loaded with valve interstitial cells for heart valve tissue Engineering. J Nanobiotechnology. 22 (1), 378(2024).
  29. Ristovski, N., et al. Improved fabrication of melt electrospun tissue engineering scaffolds using direct writing and advanced electric field control. Biointerphases. 10 (1), 011006(2015).
  30. Puluca, N., et al. Bioprinting approaches to engineering vascularized 3D cardiac tissues. Curr Cardiol Rep. 21 (9), 1-11 (2019).
  31. Lu, T. Y., Xiang, Y., Tang, M., Chen, S. 3D printing approaches to engineer cardiac tissue. Curr Cardiol Rep. 25 (6), 505-514 (2023).
  32. Voges, H. K., et al. Vascular cells improve functionality of human cardiac organoids. Cell Rep. 42 (5), 112322(2023).
  33. Zhu, L., Liu, K., Feng, Q., Liao, Y. Cardiac organoids: A 3D technology for modeling heart development and disease. Stem Cell Rev Rep. 18 (8), 2593-2605 (2022).
  34. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 17 (6), 341-359 (2020).
  35. Carlos-Oliveira, M., Lozano-Juan, F., Occhetta, P., Visone, R., Rasponi, M. Current strategies of mechanical stimulation for maturation of cardiac microtissues. Biophys Rev. 13 (5), 717(2021).
  36. Maihemuti, W., Murata, K., Abulaiti, M., Minatoya, K., Masumoto, H. Simultaneous electro-dynamic stimulation accelerates maturation of engineered cardiac tissues generated by human iPS cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150605(2024).
  37. Wang, L., Serpooshan, V., Zhang, J. Engineering human cardiac muscle patch constructs for prevention of post-infarction LV remodeling. Front Cardiovasc Med. 8, 621781(2021).
  38. Matveeva, V. G., Khanova, M. U., Antonova, L. V., Barbarash, L. S. Fibrin – A promising material for vascular tissue engineering. Russ J Transplantol Artif Organs. 22 (1), 196-208 (2020).
  39. Sproul, E. P., Hannan, R. T., Brown, A. C. Controlling fibrin network morphology, polymerization, and degradation dynamics in fibrin gels for promoting tissue repair. Methods Mol Biol. 1758, 85-99 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи