Методическая статья

Использование виртуальной реальности для иммерсивной сегментации и анализа данных криоэлектронной томографии

DOI:

10.3791/67849

⸱

24 января 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Stony Brook University, 2Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 3Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоэлектронная томография (cryo-ET) позволяет 3D-визуализировать клеточную ультраструктуру с нанометровым разрешением, но ручная сегментация остается трудоемкой и сложной. Мы представляем новый рабочий процесс, который интегрирует передовое программное обеспечение виртуальной реальности для сегментации крио-ЭТ-томограмм, демонстрируя его эффективность за счет сегментации митохондрий в клетках млекопитающих.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) является мощным методом визуализации ультраструктуры клеток в трех измерениях (3D) с нанометровым разрешением. Тем не менее, ручная сегментация клеточных компонентов в данных крио-ЭТ остается значительным узким местом из-за своей сложности и трудоемкого характера. В этой работе мы представляем новый рабочий процесс сегментации, который интегрирует передовое программное обеспечение виртуальной реальности (VR) для повышения эффективности и точности сегментации наборов данных крио-ET. В этом рабочем процессе используется иммерсивный инструмент виртуальной реальности с интуитивно понятным 3D-взаимодействием, позволяющий пользователям перемещаться и комментировать сложные клеточные структуры в более естественной и интерактивной среде. Чтобы оценить эффективность рабочего процесса, мы применили его к сегментации митохондрий в клетках пигментного эпителия сетчатки (RPE1). Митохондрии, необходимые для производства клеточной энергии и передачи сигналов, демонстрируют динамические морфологические изменения, что делает их идеальным тестовым образцом. Программное обеспечение VR способствовало точному разграничению митохондриальных мембран и внутренних структур, что позволило провести последующий анализ сегментированных мембранных структур. Мы демонстрируем, что этот рабочий процесс сегментации на основе виртуальной реальности значительно улучшает пользовательский опыт, сохраняя при этом точную сегментацию сложных клеточных структур в данных крио-ЭТ. Этот подход обещает широкое применение в структурной клеточной биологии и естественнонаучном образовании, предлагая преобразующий инструмент для исследователей, занимающихся детальным клеточным анализом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) произвела революцию в нашей способности визуализировать клеточные компоненты в их почти естественном состоянии с высоким разрешением 1,2. Этот мощный метод позволяет исследователям охарактеризовать клеточную ультраструктуру, обеспечивая беспрецедентное понимание клеточной архитектуры и функции. Тем не менее, крио-ЭТ не лишена своих ограничений, главным из которых является требование, чтобы образцы были достаточно тонкими, чтобы быть электронно прозрачными (обычно <0,5 мкм) для получения изображений в стандартных криоспособных просвечивающих электронных микроскопах. Последние достижения в области криосфокусированного ионно-лучевого фрезерования позволили утончить толстые образцы для крио-ЭТ-анализа 3,4.

Типичные рабочие процессы крио-ЭТ начинаются со сбора наклонной серии, где образец визуализируется под различными углами, от +60° до -60°. Затем эти изображения выравниваются вычислительно и проецируются назад для создания трехмерного (3D) объема или томограммы 5,6,7. Эта томограмма служит подробной 3D-картой клеточного ландшафта, предлагая как пространственную, так и временную информацию о клеточных структурах. Дальнейшее уточнение с помощью усреднения субтомограммы, когда несколько копий одной и той же структуры выравниваются и усредняются, может еще больше раздвинуть пределы разрешения, иногда достигая субнанометрового разрешения 7,8,9,10.

Важнейшим шагом в извлечении значимой биологической информации из этих томограмм является сегментация. Этот процесс включает в себя аннотирование конкретных клеточных структур, таких как мембраны, в трехмерном объеме. Сегментация позволяет проводить расширенный анализ, включая расчет межмембранных расстояний и кривизны мембраны, что позволяет получить ценную информацию о клеточных процессах11,12. Несмотря на то, что для решения этой задачи доступно несколько пакетов программного обеспечения, в том числе Dragonfly, Amira, MemBrain, EMAN2 и tomomemsegtv 13,14,15,16,17, процесс сегментации остается значительным узким местом в анализе данных крио-ЭТ. Часто это трудоемкий и трудоемкий ручной процесс, который может занять от нескольких недель до нескольких месяцев. Многие из этих пакетов предлагают функции автоматической сегментации, но часто требуют обширной ручной коррекции для удаления ложных срабатываний, что может быть трудоемким и неинтуитивно понятным при выполнении срез за срезом или в 3D.

Мы предлагаем альтернативный подход, использующий технологию виртуальной реальности (VR) для решения этих проблем. VR предлагает иммерсивный и интерактивный метод визуализации данных, позволяющий пользователям перемещаться по томографическому объему, как будто внутри самой клеточной среды. Этот подход также обеспечивает ценную платформу для научного образования, научных исследований и открытия данных крио-ЭТ in situ , обеспечивая захватывающий и уникальный увлекательный опыт. В данной работе мы представляем протокол для сегментации данных крио-ЭТ с помощью программного обеспечения виртуальной реальности syGlass18, предназначенного для научной визуализации. Это программное обеспечение предоставляет полный набор инструментов для анализа данных крио-ЭТ, включая ручную сегментацию, уточнение автоматически сгенерированных сегментаций и даже отбор частиц в томограммах. Наше исследование демонстрирует жизнеспособность виртуальной реальности в качестве мощного инструмента для очистки сегментации, отбора частиц и ручной сегментации при анализе данных крио-ЭТ.

Чтобы проиллюстрировать полезность программного обеспечения VR для сегментации крио-ЭТ, мы сосредоточимся на анализе морфологии митохондрий в клетках пигментного эпителия сетчатки (RPE1). Митохондрии служат отличным примером для сегментации благодаря своей сложной структуре и наличию легко поддающихся количественной оценке особенностей, таких как расстояние между внешними и внутренними митохондриальными мембранами. Эти особенности могут быть точно измерены с помощью инструментов морфометрического анализа поверхности12, что обеспечивает надежные метрики для оценки качества сегментации. Этот протокол содержит пошаговые инструкции по сегментации данных крио-ЭТ с помощью syGlass, демонстрируя его полезность в конвейере сегментации крио-ЭТ. Внедряя сегментацию на основе виртуальной реальности в рабочий процесс крио-ЭТ, мы стремимся повысить эффективность и точность ручного структурного анализа в клеточной биологии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка данных крио-ЭТ для сегментации

  1. Конвертируйте необработанные томограммы Cryo-ET в формат данных, совместимый с syGlass, например в стопки TIFF. Установите сигнал так, чтобы частицы были белыми на черном фоне, и выполните выравнивание гистограммы с помощью ImageJ19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения соотношения сигнал/шум рекомендуется дешумоподавление томограмм с помощью программного обеспечения, такого как Warp20, Topaz Denoise21, cryoCARE22,23 или IsoNet24, перед импортом в программное обеспечение.
  2. Запустите программное обеспечение VR на компьютере. Перейдите в меню «Файл» и выберите «Создать проект».
  3. Нажмите на Создать новый проект | Добавьте файлы. Перейдите в папку, где сохранены файлы TIFF, и импортируйте их в программу.
  4. Когда появится запрос на подтверждение того, являются ли файлы временным рядом, нажмите кнопку Нет.
  5. Присвойте проекту имя, затем нажмите «Сохранить », чтобы создать новый проект в списке проектов.
  6. Дважды щелкните по проекту, чтобы открыть томограмму и загрузить ее в программную интерактивную среду виртуальной реальности.

2. Настройка виртуальной реальности (VR)

  1. Подключите гарнитуру виртуальной реальности и ручные контроллеры к компьютеру.
  2. Следуйте инструкциям на экране, чтобы откалибровать среду виртуальной реальности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка относится к трехмерному пространству, в котором будет выполняться сегментация. Параметры (длина, ширина и высота) рабочего пространства должны быть определены до отображения проекции VR. VR-проекция будет видна только в этих параметрах.
  3. Сегментация будет производиться только в пределах заданного рабочего трехмерного пространства. Убедитесь, что поле зрения содержит область, с которой необходимо работать в среде виртуальной реальности.

3. Оптимизация 3D визуализации

  1. Нажмите на кнопку «Визуализация » в интерфейсе программного обеспечения. Отрегулируйте различные параметры визуализации, такие как контрастность, оконное оформление, яркость и ползунки порогов, чтобы усилить сигнал и свести к минимуму шум.
  2. С помощью ручных контроллеров притягивайте томограмму ближе или отодвигайте ее по мере необходимости.
  3. Активируйте инструмент «Вырезать » с помощью левого контроллера, чтобы визуально изучить различные срезы в томограмме.

4. Процесс сегментации

  1. Перейдите по томограмме к нужному срезу, где начнется сегментация.
  2. Активируйте опцию «Область интереса» (ROI) в меню аннотаций с помощью ручных контроллеров. Внутри томограммы появится зеленая рамка.
  3. Отрегулируйте размер и положение зеленого прямоугольника, переместив его в область, которую нужно сегментировать.
  4. Заблокируйте ROI с помощью левого контроллера и запустите сегментацию. После блокировки ROI инструмент автоматически переключается в режим покраски , который позволяет сегментировать объемные данные.
  5. Увеличивайте или уменьшайте масштаб томограммы для точной сегментации.
  6. Отрегулируйте размер кисти , вращая ее по часовой стрелке или против часовой стрелки для оптимального контроля.
  7. Тщательно сегментируйте ROI (например, митохондриальные мембраны) в пределах выбранной 3D-области. Если во время сегментации возникает ошибка, нажмите и удерживайте триггер вторичного контроллера, чтобы включить режим стирания , а затем сотрите ошибку тем же движением, что и сегментация.
  8. Повторяйте этот процесс регион за регионом, пока вся томограмма не будет сегментирована.

5. Экспорт сегментированных данных и анализ

  1. После завершения сегментации выберите проект, кликнув по нему, чтобы убедиться, что он выделен.
  2. Перейдите на вкладку «Проекты » в левом верхнем углу, затем выберите «Окупаемость инвестиций».
  3. Выберите экспорт всего объема или определенной рентабельности инвестиций. Укажите место экспорта сегментированных данных.
  4. Загружайте и анализируйте сегментированные данные с помощью выбранного программного обеспечения и генерируйте цифры для публикации.

6. Импорт бинарной маски в программу для очистки

  1. Выполните шаги 1.1-1.6.
  2. Щелкните правой кнопкой мыши по проекту и выберите «Добавить данные маски». Затем перейдите к месту сохранения исходной сегментации и импортируйте ее в тот же проект.
  3. Используйте аннотацию ROI, чтобы внести изменения в первоначальную сегментацию.
  4. Добавляйте/удаляйте сегментацию, чтобы очистить исходную сегментацию.
  5. Настройте ROI маски в параметре ROI на вкладке масок . Чтобы изменить ROI маски с одного на другой, включите опцию единственной перезаписи маски и перейдите в режим рисования с помощью ручного контроллера. В этом режиме будут перезаписаны только видимые данные маски.
  6. Экспортируйте скорректированные ROI маски, выполнив действия, описанные в шагах 5.1-5.3.

7. Определение координат частиц с помощью программного обеспечения VR

  1. Создайте проект с помощью томограммы (стека TIFF), выполнив действия, описанные в разделе 1.
  2. Нажмите на Аннотация | Подсчет, который открывает окно с ручными или автоматизированными параметрами.
    1. Для ручного варианта выберите цвет для подсчета и начните отмечать координаты.
    2. Для автоматической опции выберите размер ячейки и введите разрешение. Нажмите « Запустить автоматический подсчет», отредактируйте подсчет (оставьте хорошие прогнозы и отбросьте плохие) и сохраните прогресс.
  3. Экспортируйте координаты подсчета, кликнув на вкладку проекта | аннотации.
    1. В качестве начала координат аннотаций выберите Нижний левый угол, а в качестве Единиц аннотации выберите вокселы.
    2. Нажмите на ячейку подсчета точек , чтобы выделить ячейку.
    3. Нажмите « Экспортировать выбранное », чтобы сохранить координаты выделения в файле .csv.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл может быть использован для извлечения субтомограмм из томограммы для усреднения субтомограммы

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы сегментировали томограммы, содержащие митохондрии и дополнительные мембранозные органеллы (например, везикулы, эндоплазматический ретикулум) с помощью syGlass. Томограммы первоначально были реконструированы в Warp с использованием взвешенной обратной проекции на 16,00 Å/пиксель и были подвергнуты коррекции недостающего клина и шумоподавлению с помощью программного обеспечения IsoNet. Следующие томограммы были подвергнуты дополнительной обработке для импорта, как показано на рисунке 1A (также см. Дополнительное видео S1, Дополнительное видео S2, Дополнительное видео S3 и Дополнительное видео S4).

После предварительной обработки томограммы в формате MRC были преобразованы в стеки TIFF с помощью ImageJ с применением инверсии контраста, чтобы мембраны выглядели белыми на черном фоне. Затем было выполнено выравнивание гистограммы для дальнейшего усиления контраста; Это также позволяет более эффективно устанавливать пороговые значения. Стеки TIFF были импортированы и визуализированы в 3D в иммерсивной среде виртуальной реальности, что обеспечивает детальный осмотр мембранных структур с помощью режущего инструмента в программном обеспечении, показанном на рисунке 1B.

В программном обеспечении была выполнена ручная сегментация с автоматическим управлением окнами и регулировкой яркости/порога для оптимизации видимости сотовых функций. ROI вокруг митохондрий и других структур были определены с помощью VR-контроллеров. Инструмент сегментации позволил точно очертить границы мембраны, при этом ошибки были исправлены с помощью функции стирания. Послойная навигация или 3D с использованием инструмента ROI для упаковки областей по всей томограмме в сочетании с регулируемой кистью обеспечила точную сегментацию митохондриальных мембран и других органелл, как показано на рисунке 1C.

Сегментированные данные были визуализированы путем создания сетки с помощью опции поверхностей инструмента ROI, при этом количество итераций сглаживания было установлено на 12, а уровень разрешения — на 3. Окончательные 3D-рендеры ясно демонстрируют митохондриальные структуры, включая внешние и внутренние мембраны, кристы и отложения фосфата кальция, как показано на рисунке 1D (также см. Дополнительное видео S5, Дополнительное видео S6, Дополнительное видео S7 и Дополнительное видео S8).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс визуализации, сегментации и 3D-рендеринга томограмм с использованием сигласса. (A) Томографические срезы тонких клеток RPE1. Томограммы с коррекцией IsoNet реконструированы в Warp и использованы для сегментации с помощью syGlass, визуализированы с помощью IMOD25. Томограммы собирали на микроскопе Titan-Krios с энергией 300 кэВ, оснащенном детектором К3, и фокусировали на тонких краях клеток эпителия сетчатки. Каждая томограмма содержит, по крайней мере, одну митохондрию вместе с различными другими мембранно-связанными органеллами. Эти изображения представляют собой кадры из видео, показанных в Дополнительном видео S1, Дополнительном видео S2, Дополнительном видео S3 и Дополнительном видео S4. (B) Соответствующие томограммы, визуализированные в программном обеспечении. Томографический срез, созданный с помощью инструмента cut в программном обеспечении VR после оптимизации порогов, яркости и окон, выявляет отчетливые ячеистые структуры. (В) Томограммы, визуализированные в программном обеспечении, с сегментированными мембранами. Томографический срез, созданный с помощью инструмента «Резка » в программе VR, с наложением соответствующей сегментации. Отложения фосфата кальция показаны желтым цветом, митохондриальные мембраны — голубым, а другие мембраны, такие как везикулы и плазматическая мембрана, — фиолетовым. (D) 3D-рендеринг сегментированных мембран в syGlass. Митохондриальные мембраны, включая кристы, наружную и внутреннюю митохондриальные мембраны, показаны голубым цветом. Отложения фосфата кальция окрашены в желтый или зеленый цвет, везикулы и плазматическая мембрана – в фиолетовый, а эндоплазматический ретикулум – в желтовато-коричневый. Эти изображения представляют собой неподвижные изображения из видео, показанных в дополнительных видео S5, Дополнительном видео S6, Дополнительном видео S7 и Дополнительном видео S8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительное видео S1: Томограмма образца RPE-1_1, использованного для сегментации в этом исследовании. Эта томограмма реконструируется с частотой 16 Å/пиксель с помощью Warp, а затем шумоподавление и коррекция отсутствующего клина с помощью IsoNet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S2: Томограмма образца RPE-1_2, использованного для сегментации в этом исследовании. Эта томограмма реконструируется с частотой 16 Å/пиксель с помощью Warp, а затем шумоподавление и коррекция отсутствующего клина с помощью IsoNet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S3: Томограмма образца RPE-1_3, использованного для сегментации в этом исследовании. Эта томограмма реконструируется с частотой 16 Å/пиксель с помощью Warp, а затем шумоподавление и коррекция отсутствующего клина с помощью IsoNet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S4: Томограмма образца RPE-1_4, использованного для сегментации в этом исследовании. Эта томограмма реконструируется с частотой 16 Å/пиксель с помощью Warp, а затем шумоподавление и коррекция отсутствующего клина с помощью IsoNet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S5: Результирующая сегментация образца RPE-1_1 после генерации поверхностей. Митохондриальные мембраны показаны голубым цветом; фосфаты кальция в митохондриях обозначены желтым цветом; эндоплазматический ретикулум показан в коричневом цвете; а другие мембраны отображаются фиолетовым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S6: Результирующая сегментация образца RPE-1_2 после генерации поверхностей. Митохондриальные мембраны показаны голубым цветом; фосфаты кальция в митохондриях обозначены желтым цветом; эндоплазматический ретикулум показан в коричневом цвете; а другие мембраны отображаются фиолетовым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S7: Результирующая сегментация образца RPE-1_3 после генерации поверхностей. Митохондриальные мембраны показаны голубым цветом; фосфаты кальция в митохондриях обозначены желтым цветом; эндоплазматический ретикулум показан в коричневом цвете; а другие мембраны отображаются фиолетовым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S8: Результирующая сегментация образца RPE-1_4 после генерации поверхностей. Митохондриальные мембраны показаны голубым цветом; фосфаты кальция в митохондриях обозначены желтым цветом; эндоплазматический ретикулум показан в коричневом цвете; а другие мембраны отображаются фиолетовым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы продемонстрировали, как виртуальная реальность, в частности, с использованием syGlass, может быть интегрирована в крио-ЭТ-конвейер для эффективной сегментации клеточных структур. Несмотря на то, что мы сосредоточились в первую очередь на мембранах, нет никаких ограничений, препятствующих сегментации других клеточных структур, таких как филаменты или рибосомы, поскольку можно регулировать форму и размер кисти, а также устанавливать пороговые значения, чтобы гарантировать, что будут помечены только воксели, соответствующие желаемым клеточным объектам. Одним из основных преимуществ виртуальной реальности в сегментации является интуитивное, практическое взаимодействие с данными, что позволяет пользователям визуализировать объемы и манипулировать ими, как если бы они физически находились внутри них. Традиционные методы ручной сегментации или очистки первоначальных масок сегментации обычно предполагают работу непосредственно на компьютере, который может быть менее иммерсивным и более медленным для аннотирования.

Внедрив VR в рабочий процесс cryo-ET, пользователи могут не только быстро взаимодействовать с масками сегментации, созданными другим программным обеспечением, но и использовать VR для управления сегментацией частично сегментированных структур и эффективной очистки ложных срабатываний. В настоящее время для большинства сценариев использования аннотаций по-прежнему требуется ручная сегментация, и представленный рабочий процесс позволяет пользователям создавать сегментации, подходящие для последующего анализа, с большей простотой и скоростью. Для этого исследования мы использовали гарнитуру HTC Vive VR, но программное обеспечение совместимо с устройствами с поддержкой SteamVR или OculusVR.

Для оптимального применения этого протокола данные крио-ЭТ должны соответствовать определенным критериям, таким как высококачественные томограммы с высоким отношением сигнал/шум (SNR). SNR является важным параметром, так как четкость структурных особенностей напрямую влияет на эффективность ручной сегментации в VR. Этапы предварительной обработки, такие как коррекция отсутствующего клина и шумоподавление, являются ключевыми частями рабочего процесса; в этом протоколе мы использовали для этих целей IsoNet. Томограммы должны быть реконструированы с подходящим разрешением с использованием размера вокселя, который обеспечивает достаточную структурную детализацию и достаточное разделение между клеточными структурами для обеспечения эффективной сегментации между структурами при дальнейшем сохранении управляемых размеров данных для визуализации VR. Кроме того, следует применять обратный контраст с клеточными структурами, выглядящими белыми на черном фоне, и выравнивание гистограммы для улучшения видимости мембран и других структур в среде syGlass.

Необходимо учитывать несколько критических моментов, чтобы обеспечить успех этого протокола. Во-первых, при предварительной обработке данных жизненно важно точное применение инверсии контраста и выравнивания гистограммы; Неправильные настройки могут привести к неоптимальной визуализации в виртуальной реальности, что затруднит сегментацию. Во-вторых, в программном обеспечении виртуальной реальности для оптимальной визуализации конструкций необходимы соответствующие настройки окон, яркости и пороговых значений. Пользователи должны поэкспериментировать с этими настройками, чтобы достичь наилучших результатов для своих конкретных наборов данных и настроек виртуальной реальности.

Когда дело доходит до устранения неполадок, пользователи могут столкнуться с такими проблемами, как ограничения производительности системы виртуальной реальности, особенно при работе с большими наборами данных томограмм. Если среда виртуальной реальности начинает работать с задержкой или перестает реагировать, рассмотрите возможность понижения дискретизации данных или сегментации томограммы на более мелкие участки, настроив ограничивающий прямоугольник в инструментах ROI в syGlass и перемещая его вдоль томограммы во время выполнения сегментации. Ползунок производительности в меню визуализации также можно отрегулировать, чтобы уменьшить задержки в процессе сегментации. Кроме того, чтобы смягчить укачивание, пользователи могут регулировать настройки VR, чтобы уменьшить эффекты движения или делать регулярные перерывы во время сеансов сегментации.

Наш протокол сегментации на основе виртуальной реальности предлагает значительные преимущества для текущих рабочих процессов сегментации крио-ЭТ. Традиционные методы сегментации вручную часто включают в себя 2D-аннотацию на отдельных срезах, что может занять много времени и может не полностью отразить трехмерную непрерывность13. Кроме того, сегментация на основе виртуальной реальности обеспечивает гораздо более захватывающее представление о клеточных структурах, способствуя визуализации. Автоматизированная сегментация с помощью машинного обучения становится мощным методом получения сегментации по клеточным томограммам 14,16,17, хотя высокий уровень шума и сложные структуры, присутствующие в данных крио-ЭТ, приводят к разрывам и ложноположительным результатам, которые требуют ручного вмешательства. Этот протокол предлагает альтернативный подход к ручной сегментации криоэлектронных томограмм для создания начальных сегментаций, которые потенциально могут быть использованы в качестве обучающих данных для другого программного обеспечения нейронных сетей, или для очистки первоначальных сегментаций, сгенерированных с помощью других автоматизированных подходов.

В заключение следует отметить, что сегментация на основе виртуальной реальности является многообещающим инструментом для анализа данных и обучения крио-ЭТ, обеспечивающим повышенную эффективность и более захватывающий пользовательский опыт. С дальнейшим развитием технология виртуальной реальности может революционизировать то, как мы интерпретируем и распространяем научные открытия сложных клеточных структур в наборах данных крио-ET, обеспечивая ценную альтернативу традиционным методам сегментации и обучения.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была выполнена в Национальном центре доступа к криоЭМ и обучению (NCCAT) и Центре электронной микроскопии Саймонса, расположенном в Нью-Йоркском центре структурной биологии, при поддержке NIH (Общий фонд U24GM129539, U24GM139171 и NIGMS R24GM154192), Фонда Саймонса (SF349247) и Ассамблеи штата Нью-Йорк.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Формат данных: TIFF-стек, TIFF
HTC VIVE CosmosHTC99HARL000-00https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/
Intel(R) Core(TM) i7-10870H CPU @ 2.20 ГГц 2.21 ГГцIntelhttps://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html
NVIDIA Видеокарта GeForce RTX 3070 для ноутбуковNVIDIAhttps://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/
syGlass SoftwaresyGlasssyGlass Software устанавливается на совместимый ПК с Windows
VIVE Cosmos Ручные контроллерыHTC99HAFR001-00https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/
Windows 11 HomeMicrosoftMicrosoft Windows 11 Домашняя
CryoET

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. Structural biology outside the box-inside the cell. Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).
  2. Beck, M., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends Cell Biol. 26 (11), 825-837 (2016).
  3. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. Methods Mol Biol. 2215, 49-82 (2021).
  4. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  5. Watson, A. J. I., Bartesaghi, A. Advances in cryo-ET data processing: meeting the demands of visual proteomics. Curr Opin Struct Biol. 87, 102861(2024).
  6. Pyle, E., Zanetti, G. Current data processing strategies for cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Biochem J. 478 (10), 1827-1845 (2021).
  7. Wan, W., Briggs, J. A. G. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods Enzymol. 579, 329-367 (2016).
  8. Ni, T., Liu, K., Zhang, J., Atanasov, I., Mladenov, M. G., Jiang, W. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nat Protoc. 17 (2), 421-444 (2022).
  9. Obr, M., et al. Exploring high-resolution cryo-ET and subtomogram averaging capabilities of contemporary DEDs. J Struct Biol. 214 (2), 107852(2021).
  10. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  11. Salfer, M., Collado, J. F., Baumeister, W., Fernández-Busnadiego, R., Martínez-Sánchez, A. Reliable estimation of membrane curvature for cryo-electron tomography. PLoS Comput Biol. 16 (8), e1007962(2020).
  12. Barad, B. A., et al. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).
  13. Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography. J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).
  14. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  15. Garza-López, E., Robles-Flores, M. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  16. Chen, M., et al. Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms. Nat Methods. 14 (10), 983-985 (2017).
  17. Lamm, L., et al. MemBrain v2: an end-to-end tool for the analysis of membranes in cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  18. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. arXiv. , (2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  21. Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nat Commun. 11, 5208(2020).
  22. Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data. Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).
  23. Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. Content-aware image restoration for electron microscopy. Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).
  24. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13, 6482(2022).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cryo Electron TomographyVirtual Reality SegmentationImmersive Data AnalysisMitochondrial Membranes3D Cell UltrastructureManual SegmentationRetinal Pigment EpitheliumROI AnnotationHistogram EqualizationMembrane Visualization

Похожие статьи