Методическая статья

Высокопроизводительное измерение клеточного механотипа с помощью проточной цитометрии на основе разрыва и доставки в клетки зондов натяжения ДНК

DOI:

10.3791/67852

⸱

13 июня 2025 г.

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод измеряет склонность клетки к разрыву лиганд-презентирующих иммобилизованных ДНК-дуплексов, чтобы сообщить об относительных клеточных тяговых силах. Разорванные флуоресцентные олигопласты доставляются в клетку и анализируются с помощью проточной цитометрии, записывая механическую историю клетки. Это позволяет с высокой пропускной способностью измерять генерацию клеточной силы в контексте клеточного механофенотипирования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механические силы управляют многими важнейшими клеточными процессами, и клеточный механический фенотип, или механотип, нарушается при многих заболеваниях. Наиболее широко используемым методом количественной оценки клеточных сил является микроскопия тракционных сил, которая традиционно фиксирует силы, которые клетки оказывают на свое окружение, с помощью микроскопии высокого разрешения клеток, деформирующих эластичные подложки, содержащие флуоресцентные гранулы, отклоняющих микропосты или изменяющих конформацию иммобилизованных молекулярных датчиков натяжения. Мы представляем здесь высокопроизводительный метод измерения относительных клеточных сил тяги с использованием установленных зондов натяжения ДНК и количественно определен с помощью проточной цитометрии. Этот метод состоит из пяти основных этапов, описанных ниже. Во-первых, экспрессия и очистка высокоаффинного интегрин-лиганда эхистатина, слитого с ДНК-связывающей HUH-меткой; во-вторых, получение дуплексных зондов ДНК, содержащих репортеры и лиганд; в-третьих, подготовка поверхности и иммобилизация зондов; в-четвертых, проведение эксперимента по измерению натяжения-манометра-троса «Разрыв и Доставка» и считывание расхода. Наконец, мы опишем анализ данных и интерпретацию экспериментальных результатов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механические силы управляют многими важнейшими клеточными процессами, от миграции1 до дифференцировки стволовыхклеток2 и способности Т-клеток связываться и активироваться правильной антигенпрезентирующей клеткой3. Механические переменные нарушаются при заболевании, что приводит к измеримым различиям в клеточно-механическом фенотипе, или механотипе, клеток 4,5. Механотип — это общий термин для обозначения механических свойств клеток и тканей, который может включать в себя такие параметры, как сократительная способность, миграция, адгезия и деформируемость. Жесткость клеток или тканей является наиболее распространенным аспектом измеряемого механотипа, поскольку она может быть измерена с высокой пропускной способностью. Например, раковые клетки часто более жесткие, чем нормальные, в то время как метастатические клетки часто более податливы 6,7. Генерация силы клетками является важным аспектом механотипа, измененного при болезни8, поскольку она исследует специфические взаимодействия между клеткой и окружающей средой. Микроскопия силы тяги является наиболее распространенным методом измерения генерации клеточных сил и включает в себя нанесение клеток на деформируемые эластичные подложки, встроенные флуоресцентными шариками, или на массивы микропостов и отслеживание изменений в движении бусин или после прогиба для расчета сил, оказываемых клетками. Молекулярные датчики натяжения также используются для измерения тяговых сил и имеют преимущество в чувствительности к меньшим величинам силы и измерении сил, генерируемых определенными парами лиганд-рецептор 9,10. Однако измерение клеточных сил с помощью традиционных TFM и датчиков молекулярного натяжения основано на визуализации с высоким разрешением, что ограничивает пропускную способность измерения.

Недавно мы адаптировали ДНК-дуплексные зонды натяжения для высокопроизводительного считывания данных о генерации клеточных сил в контексте клеточного механофенотипирования11 (рис. 1). Вкратце, дуплексы ДНК, адаптированные из широко используемых зондов12 с манометром натяжения (TGT), иммобилизованы в лунках 96-луночных планшетов с помощью биотин-нейтравидиновой химии «якорной» нити13. Требуемая сила разрыва дуплексов TGT может быть отрегулирована путем изменения положения биотина на анкерной нити, что изменяет геометрию дуплекса, что приводит либо к низкой деформации разрыва при расстечивании (Рисунок 2A), либо к высокой деформации сдвига с высокой силой разрыва (Рисунок 2B). Якорная цепь содержит биотин и гаситель флуоресценции, в то время как «лигандная» цепь ДНК содержит флуоресцентный зонд и лиганд, распознающий рецептор клеточной поверхности, участвующий в механосенсоринге, такой как интегрин. Лиганд ковалентно связывается с ДНК (рис. 3) с помощью связывающей ДНК фьюжн-метки, называемой HUH-меткой, слитой с лигандом14,15. HUH-метки представляют собой малые эндонуклеазные домены HUH, участвующие в репликации вируса и других процессах, которые распознают последовательность/структуру одноцепочечной ДНК размером 9.о.о., разрывают ее и образуют ковалентный аддукт фосфотирозина на 5'-конце поврежденной ДНК.

Клетки, покрытые поверх этих зондов, связываются с лигандом и разрывают процент зондов, пропорциональный силам, которые они генерируют. Связанная с рецептором цепь флуоресцентного лиганда впоследствии доставляется в клетку. Таким образом, механическая история клеток записывается в интересующих клетках через величину их флуоресценции. Флуоресценция может быть количественно определена с помощью проточной цитометрии. Мы называем этот метод Rupture and Deliver-TGTS или RAD-TGTS. Этот метод не только измеряет флуоресценцию и, следовательно, относительную силу, генерируемую тысячами клеток одновременно, но и считывание проточной цитометрии дает возможность сортировать клетки по их механотипу, позволяя проводить нисходящие -омиксные считывания, а также CRISPR-KO или скрининг лекарств, которые могут идентифицировать гены или лекарства, изменяющие клеточный механотип.

В приведенном ниже протоколе мы демонстрируем, как подготовить и провести эксперимент RAD-TGT. Мы выделим экспрессию и очистку типа HUH, известного как WDV (от вируса пшеничного карлика), который сам по себе служит в качестве отрицательного контроля и слитого с эхистатином, лигандом, который тесно связывает семейство адгезионных рецепторов, передающих силу между клеткой и окружающей средой, известных как RGD-связывающие интегрины, чтобы служить в качестве экспериментального условия. Исходя из этого, мы продемонстрируем, как подготовить RAD-TGT к экспериментальному использованию. Мы объясним, как проводить эксперименты и как анализировать полученные данные. Мы также расскажем о применении RAD-TGT путем измерения того, как ингибитор ROCK изменяет интегрин-опосредованные силы в клетках CHO-K1 (рис. 4). Подводя итог, мы надеемся, что этот протокол послужит введением в механобиологию, независимо от предыдущего опыта; Эта область находится в зачаточном состоянии, и все предпосылки имеют важное значение для дальнейшего понимания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сцеживание и очищение HUH

  1. Трансформируйте Escherichia coli плазмидой WDV (± эхистатином), примерно 1,5 мкл ~50 нг/мкл плазмиды за трансформацию, и выращивайте на ампициллиновых агаровых пластинах.
  2. Внесите 5 мл LB в одну колонию и выращивайте в течение ночи при температуре 37 °C.
  3. Инокулируйте 1 л LB с ночной культурой и выращивайте до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет ~0,8.
  4. Снизьте температуру до 18 °C, наведите изопропилом 500 мкМ β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) и инкубируйте в течение ночи.
  5. Гранулируйте клетки центрифугированием при 3 750 × г в течение 30 минут. Ресуспендируйте гранулу 40 мл буфера для лизиса (300 мМ NaCl, 50 мМ Tris pH 7,5, 1 мМ ЭДТА).
  6. Лизировать ячейки с помощью ультразвуковой обработки 3 x 90 с на льду при 70% рабочем цикле, мощность 7. Уменьшите температуру до 24 000 × г в течение 30 минут при 4 °C и вылейте надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 50 мл.
  7. Налейте суспензию смолы Ni-NTA в коническую пробирку объемом 15 мл (1 мл суспензии в гранулах/л культуры), уменьшите до 700 × г в течение 2 минут и удалите надосадочную жидкость.
  8. Добавьте в смолу 6 мл воды и повторите процесс промывки на шаге 1.7.
  9. Дважды повторите полоскание с промывочным буфером (300 мМ NaCl, 50 мМ Tris [pH 7,5], 1 мМ ЭДТА, 20 мМ имидазол) вместо воды. Суспендируйте шарики в 5 мл буфера для стирки.
  10. Добавьте суспензию в гранулах (шаг 1.9) к лизированным клеткам (шаг 1.6) и тщательно перемешайте. Вращайте лизированные клетки и шарики в течение не менее 1 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение оставшейся части этого протокола никогда не позволяйте смоле высыхать и собирайте все образцы, которые проходят через колонку.
  11. Вылейте смесь на столб объемом 20 мл и соберите протекание. Промойте колонку 4 x 25 мл буфера для промывки.
  12. Разбавьте 1 x 10 мл элюирующего буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ Tris [pH 7,5], 1 мМ ЭДТА, 250 мМ имидазола) в свежую пробирку объемом 15 мл, собирая раннее и позднее элюирование отдельно (раннее элюирование – первый 1 мл, позднее элюирование – конечный 1 мл).
  13. Проанализируйте все собранные фракции с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE), чтобы убедиться, что HUH был собран во время элюирования (см. дополнительный рисунок S1). Для достижения наилучших результатов загрузите 4-20% гель и проведите его в течение 45 минут при 35 Вт и 200 В.
  14. Добавьте элюированный белок в диализную трубку и инкубируйте в течение ночи в диализном буфере (так же, как буфер для лизиса) при 4 °C. Чтобы удалить метку HIS, добавьте ULP1 без восстановителя непосредственно в элюированный белок перед помещением белка в диализную трубку.
  15. На следующее утро приготовьте смолу Ni-NTA, как описано в шагах 1.7-1.9, и инкубируйте с диализованным белком. Вылейте смесь белка и смолы Ni-NTA в колонну и соберите проточные. Промойте колонку 10 мл диализного буфера и соберите все протоки.
  16. Оцените собранную фракцию на SDS-PAGE в соответствии с вышеуказанными настройками, чтобы убедиться в наличии белка, и сконцентрируйте до желаемой концентрации с помощью ультрацентробежного фильтра объемом 15 мл с молекулярной массой 10 кДа (см. дополнительный рисунок S1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная конечная концентрация белка составляет от 40 мкМ до 100 мкМ.

2. Подготовка RAD-TGT

  1. Соберите дуплексы в молярном соотношении якорной цепи (с гасителем) и лигандной цепью (с флуорофором) 1,1:1 при конечной концентрации 40 мкМ лигандной цепи в растворе 10 мМ Tris (pH 7,5), 50 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА.
  2. Отжиг путем инкубации при 98 °С в течение 5 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 1 ч; беречь от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы небольшого объема легко испаряются, и их может быть трудно полностью восстановить. Приготовьте больший объем, чем нужно.
  3. Реагируют отожженные дуплексы с HUH (используя концентрацию наименее распространенной цепи при отжиге; в данном случае лигандной цепи) в молярном соотношении 1:2 при конечной концентрации 10 мкМ дуплекса и 20 мкМ HUH в растворе, содержащем 1 мМ MnCl2, 50 мМ HEPES (pH 8), 50 мМ NaCl.
  4. Инкубируйте реакцию в течение 30 минут при 37°C в термоамплификаторе или светозащищенном теплоблоке. После инкубации снимите с огня и используйте настольный минифуж для вращения собранных теперь собранных TGT. Либо сразу наденьте пластины на пластины, либо храните при температуре 4 °C в темноте.

3. Подготовка поверхности

  1. Сразу после открытия 96-луночной стеклянной нижней пластины накройте все лунки клейкой пленкой для ПЦР-пластин, чтобы сохранить неиспользуемые лунки для последующего использования. С помощью лезвия бритвы вырежьте фольгу над интересующими лунками (желательно некраевыми) и добавьте 100 μL холодного PBS в нужные лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как жидкость будет добавлена в лунки, не позволяйте лункам пересохнуть. Если происходит высыхание, неспецифическая адсорбция биомолекул на поверхности негативно повлияет на данные. Постоянно держите в лунке 100 мкл избыточного объема, чтобы предотвратить высыхание.
  2. Добавьте 200 μL холодного PBS в лунки, аккуратно перемешайте пипетки 2-5 раз и удалите 200 μL PBS. Повторите в общей сложности три мытья.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении и удалении жидкости из лунок держите наконечник пипетки на краю лунки под углом 45°, чтобы не повредить поверхность. Делайте это для всех операций с пластиной, за исключением гальванических ячеек.
  3. Для экспериментальных лунок приготовьте раствор 0,1 мг/мл Biotinylated-BSA в PBS и добавьте 80 мкл раствора в нужные лунки. Для контрольных лунок готовят тот же раствор с добавлением 18,75 мкг/мл фибронектина и добавляют 80 мкл в соответствующие лунки. Аккуратно пипеткой перемешайте все используемые лунки, накройте пластину крышкой, и накройте фольгой. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
  4. Удалите 80 мкл объема из лунок и промойте лунки, повторив шаг 3.2. Добавьте 80 мкл 0,1 мг/мл нейтравидина в раствор PBS таким же образом, как и на стадии 3.3.
  5. После инкубации извлеките из лунок 80 мкл объема и повторите шаг 3.2. Разведите собранные TGT (стадия 2 подготовки RAD-TGT) до 0,1 мкМ в PBS и 80 мкл раствора в лунках аналогично стадии 3.3. Накройте лунки клейкой пленкой и храните в темноте при температуре 4 °C или защитите от света и выдержите при комнатной температуре в течение 1 часа, прежде чем приступить к экспериментам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем рассматривать шаг 3.5 как точку остановки и подождать до следующего дня, чтобы продолжить эксперименты.

4. Экспериментальный протокол RAD-TGT

  1. После того как ТГТ пройдет достаточное время для прилипания, промойте лунки (см. шаг 3.2) 3 раза PBS, а затем дважды промойте безсывороточным фильтрующим материалом. Оставьте фильтрующий материал в лунках после окончательной промывки. Добавьте 200 μL PBS в периферийные лунки, чтобы смягчить любые краевые эффекты, и перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C для предварительного нагрева планшета.
  2. Извлеките интересующие клетки с конфлюенсацией ~80% и аспирируйте среду с последующим добавлением и аспирацией PBS для промывания клеток. Добавьте соответствующий объем трипсина и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C до тех пор, пока клетки не диссоциируют (~5-10 минут).
  3. После того, как клетки будут диссоциированы, добавьте в планшет исходный объем полной клеточной среды, используемой для поддержания клеток, и повторно суспендируйте с помощью серологической пипетки. Добавьте клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
  4. Центрифугируйте клетки при 300 × г в течение 4 минут, отсасывайте среду и повторно суспендируйте гранулу в PBS. Повторите центрифугирование и аспирацию, затем повторно суспендируйте в 5 мл среды, не содержащей сыворотки, и повторите центрифугирование и аспирацию. Ресуспендируйте клетки в ~2 мл среды, не содержащей сыворотки.
  5. Определите плотность ресуспендированных клеток и отрегулируйте концентрацию по желанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы стремимся к тарелке ~15 000 клеток на лунку, поэтому мы подготавливаем клетки к концентрации 150 000 клеток/мл, что позволяет покрыть 15 000 клеток 100 μл ресуспендированных клеток.
    1. Необязательно: Если необходимо проверить действие лекарственных препаратов или других фармакологических средств, добавьте соответствующую концентрацию препарата в клетки и верните клетки в инкубатор. Дайте достаточно времени для предварительной инкубации, прежде чем переходить к следующему этапу.
  6. Извлеките пластину из инкубатора (шаг 4.1) и удалите объем среды, оставшейся от промывки, из экспериментальных лунок в предварительно прогретую пластину. Вымойте один раз нужным материалом. Осторожно пипетируйте 100 мкл ресуспендированных клеток в нужные лунки. Перенесите погружные клетки в инкубатор на 90 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно вводите пипетки в центр лунок, стараясь держать пипетку вертикально.
  7. После инкубации удалите из лунок ~125-170 мкл объема. При необходимости аккуратно промойте ячейки 200 μл подогретого PBS. Добавьте по 50 мкл трипсина в каждую лунку и верните планшет в инкубатор до тех пор, пока клетки не начнут диссоциировать (5-10 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы колодец никогда не пересыхал и не происходило чрезмерной трипсинизации.
  8. Добавьте в лунки 160 мкл свежеприготовленного проточного буфера (1 мМ ЭДТА, 2% мас.% бычьего сывороточного альбумина, в холодном PBS). Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы диссоциировать клетки, добавьте 196 мкл этой клеточной суспензии в ПЦР-пробирки, а затем 4 мкл йодида пропидиума и аккуратно перемешайте. Подготовьте один контрольный образец без йодида пропидия, который будет служить в качестве контрольного для определения жизнеспособности.
  9. Поместите пробирки в ведро со льдом так, чтобы крышка блокировала свет, и приступайте к измерению интенсивности флуоресценции с помощью проточного цитометра.

5. Сбор и анализ данных

  1. Проанализируйте каждый образец с помощью проточного цитометра. Стремитесь собрать не менее 2000 живых одиночных клеток в каждом образце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму воздействие света на образцы, которые еще не были проанализированы, и храните их на льду.
  2. После того, как все данные собраны, перенесите файлы в выбранное программное обеспечение и зарегистрируйте ячейки.
    1. Затвор для ячеек по прямой площади рассеяния (FSC-A) и боковой области рассеяния (SSC-A).
    2. Вентиль для синглетов в популяции клеток по зависимости FSC-A от высоты прямого рассеяния (FSC-H).
    3. Вентиль для живых клеток из популяции синглетов путем установки вертикального затвора на гистограмме интенсивности области йодида пропидида на наибольшем значении для контроля без йодида пропидида, подготовленного на шаге 4.8. Любые события, которые не выходят за пределы затвора, являются живыми клетками
    4. Установите вертикальный затвор на гистограмме интенсивности области Cy5 (Cy5-A) синглетов, чтобы удалить любое нефлуоресцентное событие в канале Cy5-A, вызванное клеточным мусором. Убедитесь, что значение этого вертикального затвора меньше, чем у анализируемых немеченых клеток, но больше 0 интенсивности флуоресценции.
    5. Чтобы проанализировать клеточные популяции, установите биссектрисный вентиль на99-м процентиле каждого соответствующего отрицательного контроля.
    6. Примените вентиль с той же интенсивностью, что и соответствующие экспериментальные условия, и соберите процент клеток, превышающих отрицательный контрольный вентиль для каждого условия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процентное соотношение может быть напрямую сравнено между биологическими репликами с помощью соответствующего статистического анализа; см. репрезентативные данные.
  3. Проанализируйте данные с использованием медианы флуоресценции Cy5, разделив медианную интенсивность лиганда-WDV на медиану только WDV, и сравните эти значения между репликациями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы продемонстрировать полезность и простоту использования RAD-TGT, мы проанализировали влияние ингибиторов Рокиназы (ROCK) на механотип клеток CHO-K1. Путь ROCK участвует в организации актина и активации миозина. Предыдущие исследования с использованием TGT показали, что ингибирование ROCK уменьшает разрыв сдвиговых TGT 16,17,18. Сдвиговые или высокоинтенсивные TGT сообщают о сократительных силах, действующих через фокальные ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставили протоколы о том, как настраивать и проводить эксперименты RAD-TGT, чтобы побудить ученых в области наук о жизни включить механотипирование в свой рабочий процесс. Ключевым преимуществом RAD-TGT, особенно для тех, кто обладает способностью к производству белка, является использование эндонуклеаз HUH для лигирования лигандов в дуплексы ДНК с высокой точностью без какой-либо химической сшивки и/или очистки. Эндонуклеазы HUH включают в себя семейство нуклеаз, которые связываю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. выражает признательность за финансирование от NIH R35GM119483. Биорендер использовался для создания схем фигур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коническая трубка 15 млSarstedt62.554.205
96 луночная стеклянная нижняя пластинаCellvisP96-1.5H-N
Адгезивная ПЦР-пластина фольгаThermo Fisher ScientificAB-0626
АмпициллинApex Bioresearch Products 25-530
Bio-Rad 20 мл колонкаBio-Rad7321010
биотинилированный BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Компетентный E. coliNew England BiolabsC2527H
Сыворотка крупного рогатого скота АльбуминThermo Fisher ScientificBP9703100
инкубатор клеточных культурThermo Fisher Научная51030284
ЦентрифугаThermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Диализная трубкаThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow ЦитометрBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ИмидазолThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB агарFisher ScientificBP1425-500
Стенд для лигандаИнтегрированные технологии ДНК,разработанныепользователемGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lysogeny Broth (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Никель-NTA смола Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Чашка ПетриVWR25384-342
Раствор йодида пропидиумаCayman Chemicals10008351
SDS-PAGE гельBio-Rad4561096
сыворотки без медиаThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Использованные, альтернативные бессывороточные среды подходят для использования
Shear Anchor StrandИнтегрированные технологии ДНК,разработанные пользователем oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG
CC SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
ТермоамплификаторBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
, отсечка 10 кДаAmikon
Unzipping Anchor StrandИнтегрированные технологии ДНК,разработанные пользователями oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Восстановлен в ДМСО
Ультрацентробежный фильтр

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

Похожие статьи