Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение первичных культур для визуализации живых клеток кератиноцитов

877 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67854

⸱

2 мая 2025 г.

 ,  ,  , 
1The University of California, San Francisco, 2San Francisco Veterans Affairs Health Care System

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает культуру свежеполученных (пассаж 0) кератиноцитов для использования в визуализации живых клеток.

Аннотация

Отслеживание стволовых клеток и фиксированного поведения предшественников на уровне отдельных клеток в коже человека было сложной задачей как in vivo , так и in vitro. Визуализация живых клеток позволила добиться значительного прогресса в выявлении различий между стволовыми клетками кератиноцитов и поведением предшественников. Визуализация живых клеток является развивающимся и довольно сложным методом изучения поведения кератиноцитов in vitro. Этот протокол был разработан для культивирования кератиноцитов при низкой плотности посева, что позволяет проводить относительно долгосрочную покадровую фотосъемку и мониторинг поведения отдельных клеток. Кератиноциты Passage 0 выращиваются с клональной плотностью, а покадровая съемка позволяет документировать отдельные клеточные деления и время их возникновения. Для максимальной биологической значимости свежевыделенные кератиноциты человека помещаются in vitro. Этот подход ориентирован на распространение. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для использования в других приложениях визуализации живых клеток, измеряющих поведение отдельных клеток, таких как измерение миграции клеток, заживления ран и подвижности.

Введение

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить возможность отслеживания отдельных кератиноцитов в культуре в течение относительно длительного периода времени (несколько недель), что стало возможным благодаря низкой плотности посева и покадровой съемке. Визуализация живых клеток с низкой плотностью дает исследователям возможность визуализировать поведение клеток in vitro на уровне одной клетки. Хотя визуализация живых клеток невозможна в традиционной клеточной культуре, она позволяет создавать деревья линий в режиме реального времени, без использования мечения, из которых можно получить информацию о кинетике деления, такую как продолжительность клеточного цикла и доля делений пролиферации и дифференцировки в колонии. Это также позволяет изучать миграцию и подвижность клеток. Она может быть технически сложной, с аспектами, которые требуют оптимизации в зависимости от типа ячейки и данных, которые должны быть собраны. В других лабораториях использовались неонатальные кератиноциты и/или пассажные кератиноциты, которые легче выращивать1.

Тем не менее, клеточные линии, которые подвергаются повторному пассионгу, значительно отличаются по поведению и морфологии от своего состояния in vivo 2. Для достижения наибольшей биологической значимости с целью получения поведения, наиболее близкого к in vivo , используются клетки пассажа 0. В популяциях кератиноцитов можно провести различие между стволовой клеткой и коммитированным предшественником без сортировки или меток, поскольку существуют явные различия в поведении деления, которые можно наблюдать спомощью визуализации живых клеток.

Мы используем визуализацию живых клеток для изучения кинетики пролиферации кератиноцитов. Аналогичный подход был использован для изучения подвижности клеток меланомы кожи, совместно культивируемых с кератиноцитами4, миграции адгезивных клеток в анализах царапин5 и того, как ингибиторы ROCK влияют на пролиферацию кератиноцитов6. Этот протокол специально разработан для культивирования клеток, чтобы облегчить отслеживание линии с помощью визуализации живых клеток, хотя он может быть адаптирован и для других целей.

В этом протоколе описывается выделение кератиноцитов пассажа 0 с целью визуализации живых клеток, обсуждаются осложнения, которые могут возникнуть, и приводятся соображения, которые могут потребовать внесения изменений в протокол (Рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Для использования человеческих тканей требуется одобрение Комитета по исследованиям на человеке учреждения. Человеческие образцы для исследований часто получают из коммерческих источников (например, ATCC, клеточная технология Lifeline, Zen-Bio). В наших исследованиях используются отбракованные ткани во время операций или образцы биопсии кожи, взятые специально для исследовательских целей. Эти ситуации требуют различных согласований и процедур согласия. Все ткани получают после одобрения Комитета UCSF по исследованиям на людях с использованием письменного информированного согласия и в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

1. Отделение эпидермиса от дермы

  1. Убедитесь в получении соответствующих разрешений на использование тканей человека для исследования.
  2. Возьмите образец кожи и транспортируйте его в изолированном контейнере с пакетом со льдом. Поместите образец в среду для сбора, содержащую в 5-кратной концентрации пенициллина, стрептомицина и амфотерицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество будет зависеть от области применения. По нашему опыту, примерно 1 000 000 кератиноцитов насм2 получают из взрослой и возрастной кожи. Однако это может значительно варьироваться для каждого образца.
    1. Поместите неонатальную крайнюю плоть в среду для клеточных культур и начните процедуру выделения кератиноцитов не позднее чем через 48 ч после обрезания, чтобы свести к минимуму гибель клеток. Храните салфетку при температуре 4 °C до обработки. Обработка взрослых и старых образцов обычно начинается в течение нескольких часов после сбора.
  3. Получите доступ к шкафу биобезопасности с оборудованием уровня BS2, предназначенным для работы с агентами, вызывающими заболевание при проглатывании, слизистой оболочке или чрескожном воздействии7. Перед использованием убедитесь, что шкаф для биобезопасности стерилизован ультрафиолетовым излучением в течение не менее 15 минут и что все поверхности опрысканы 70% спиртом.
  4. Наденьте перчатки, опрыскайте емкость для сбора 70% спиртом и поместите емкость в вытяжной шкаф. Подложите охлаждающую салфетку под салфетку, чтобы предотвратить ее нагрев до комнатной температуры и сохранить ее целостность. Если ткань очень большая, отрежьте часть для обработки, а остальную часть держите влажной в контейнере для сбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку многие из старых образцов имеют большую кожу живота или молочной железы после операций, требуется время для разреза и обработки ткани. Салфетку никогда не следует класть непосредственно на прокладку, так как сильный холод может привести к ее замерзанию. Вместо этого его следует разместить на промежуточной поверхности, например, на мраморной плите.
  5. Поместите в капюшон две чашки Петри размером 100 мм x 15 мм и стерильный хирургический скальпель #23.
  6. Откройте чашки Петри и поставьте их на поверхность шкафа так, чтобы внутренние поверхности каждой чашки были обращены вверх. Добавьте 10 мл 10% глюконата хлоргексидина в одну из чашек Петри. Добавьте 10 мл 5x пенициллина/стрептомицина/амфотерицина/гентамицина в сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS; 5x) в 2 другие половинки чашки Петри (см. Таблицу материалов).
  7. Подготовьте 6-луночную пластину для этапа Dispase. Для тканей новорожденных используйте 3 мл Dispase на лунку. Для старых образцов тканей используйте 4 мл. Использование недостаточного количества Dispase для объема ткани может привести к трудностям с отделением эпидермиса от дермы.
  8. С помощью скальпеля разрежьте ткань на более мелкие кусочки так, чтобы она лучше проникала Dispase. Диспасе проникает только на расстоянии до 5 мм от краев ткани, поэтому нарезают длинными полосками ткани шириной 0,5-1 см. Если не обрезать достаточно мелко, то отделения эпидермиса от дермы не произойдет.
    1. Более плотную ткань нарежьте на более мелкие кусочки. Разрежьте неонатальную крайнюю плоть на 3 или 4 части (~5 мм x 7 мм). Используйте не более двух полных крайних плотей на лунку Dispase. Поверхностные лоскуты брюшной полости, как правило, намного тоньше, с минимальным количеством подкожной клетчатки или без нее, разрежьте их на более длинные полоски (~5 мм x 15 мм).
    2. Положите максимум четыре полоски на лунку Dispase. Если к полученной ткани прикреплено много подкожного жира, обрежьте подкожную клетчатку, чтобы помочь Dispase полностью проникнуть в ткань. Если ткань разрезана слишком мелко, может потребоваться препарирующий микроскоп, чтобы определить, какая сторона является эпидермальной, а какая — дермальной, при отслаивании эпидермиса. Вытягивание неправильной стороны кожи может привести к дополнительной травме тканей.
  9. Поместите тканевую эпидермальную сторону вниз в первую чашку Петри, приготовленную на шаге 1.6, содержащую 10% глюконата хлоргексидина, на 10-20 с. Затем перенесите тканевую эпидермальную сторону вниз во вторую чашку Петри, содержащую 5x пенициллин/стрептомицин/амфотерицин (ПСА) с HBSS, и перемешивайте в течение 10-20 с. Перенесите тканевую эпидермальную сторону вниз в третью чашку Петри, снова содержащую 5x ПСА с HBSS, и перемешивайте еще 10 секунд. Допустима обработка нескольких образцов одним и тем же раствором.
  10. Перенесите эпидермальную сторону ткани вниз на 6-луночный планшет Dispase, приготовленный на шаге 1.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать эпидермальную сторону вниз в соответствии с нашей конвенцией. Другие протоколы рекомендуют дерму вниз8. Не все рассуждения одинаково эффективны. Отшелушивание эпидермиса с возрастной кожи оказалось сложной задачей при использовании некоторых продуктов, даже в концентрациях, в 4 раза превышающих рекомендованный производителем. Это привело к потере времени и образцов. Компании используют нестандартизированные единицы измерения для Dispase, что затрудняет определение различий концентраций между брендами. В связи с этими проблемами настоятельно рекомендуется использовать один из брендов Dispase, перечисленных в Таблице материалов .
  11. Пометьте 6-луночный планшет, содержащий раствор и образцы, и переведите при температуре 4 °C. Инкубируйте неонатальные образцы в течение 16-18 ч в Dispase и взрослые/старые образцы в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует альтернативный протокол 2 часов, который можно использовать для образцов, когда образец помещается в диспазу при 37 °C на 2 часа, а затем эпидермис отшелушивается. К сожалению, это не всегда работает, и целостность ткани может быть нарушена после инкубации, что приведет к потере образца. По возможности предпочтительна ночная инкубация.

2. Выделение кератиноцитов

  1. Поместите 0,05% Trypsin-EDTA (или TrypLE), нейтрализующий раствор Trypsin и кератиноцитарные среды в водяную баню при температуре 37 °C за 20 минут до начала следующего набора шагов
  2. Снимите 6-луночный планшет с температурой 4 °C, распылите на него 70% этанола и поместите в подготовленный шкаф биобезопасности (см. шаг 1.3).
  3. Поместите стерильные зубчатые щипцы и незубчатые щипцы в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 20 мл 70% этанола. Если капюшон изначально находится вне колпака, распылите щипцы с 70% этанолом, прежде чем положить его в капот.
  4. С помощью химически стерилизованных щипцов захватите кусочек ткани и положите его на стерильную поверхность эпидермальной стороной вверх (используйте чашку Петри или внутреннюю часть верхней половины 6-луночной пластины). Удерживайте дермальную часть ткани зубчатыми щипцами с помощью недоминантной руки и одновременно крепко захватывайте эпидермис незубчатыми щипцами и оттягивайте его от края к краю. Он должен гладко сойти как единое целое.
  5. Поместите эпидермис на внутреннюю сторону губы конической трубки объемом 15 мл. Каждая коническая трубка объемом 15 мл должна иметь эпидермис максимум из двух крайних плоттей.
    1. Работать эффективно; Если ткань высохнет, урожайность будет поставлена под угрозу. Если диспаза не проникла должным образом в ткани, могут возникнуть трудности с отшелушиванием эпидермиса. В таком случае оттяните/соскребите эпидермис с подлежащей дермы. Это также приводит к гораздо более низкой урожайности и не рекомендуется.
  6. Добавьте 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в коническую пробирку объемом 15 мл, затем закройте и переверните пробирку, следя за тем, чтобы весь эпидермис был взвешенным в трипсине и не застрял на боковой стороне пробирки/крышки. Поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 10 минут. Перемешивайте клетки каждые 2 минуты вручную.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсинизация в течение более 10 минут может привести к снижению выхода клеток. Кроме того, если целостность белков клеточной поверхности вызывает беспокойство, используйте TrypLE, поскольку он более специфичен для места его расщепления, что приводит к меньшему повреждению клеток и, как было показано, не приводит к значительному снижению экспрессии поверхностного антигена по сравнению с Trypsin-EDTA9. Кроме того, водяная баня является распространенным источником загрязнения, поэтому регулярно очищайте ее. Регулярно меняйте воду с деионизированной водой, содержащей раствор аквагард-2.
  7. Поместите коническую пробирку объемом 50 мл в шкаф для биобезопасности. Открутите крышку и поместите сетчатый фильтр 100 μм на отверстие конической трубки.
  8. Извлеките коническую пробирку объемом 15 мл с переваренным образцом из водяной бани, тщательно высушите и распылите на нее 70% спирт, прежде чем поместить ее обратно в шкаф для биобезопасности. Постучите конической трубкой 3 раза по поверхности вытяжного шкафа, затем переверните 6 раз. Повторите цикл постукивания и инверсии 3 раза.
  9. Добавьте в коническую пробирку 6 мл нейтрализующего трипсин раствора. Налейте фильтр через ячейки в коническую пробирку объемом 50 мл с шага 2.7.
  10. Промойте коническую пробирку объемом 15 мл с образцом 5 мл растворов, нейтрализующих трипсин (TNS). Налейте через клеточное ситечко в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
  11. Немедленно снимите с центрифуги и пипеткой надосадочную жидкость, чтобы предотвратить потерю клеток в среду. Должна остаться только гранула с небольшим скоплением жидкости. Может быть трудно увидеть гранулу из небольших образцов ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В надосадочной жидкости присутствует трипсин, поэтому лучше удалить его как можно больше, не теряя гранулы.
  12. Ресуспендируйте кератиноцитарную гранулу в 2 мл кератиноцитарной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь есть два соображения. Во-первых, какие носители использовать. Для этого рекомендуется использовать бессывороточные среды без коллагена. Исторически сложилось так, что стандартом для культивирования кератиноцитарных клеток была модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) +10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) + F-12 Ham's на слое фидера фибробластов (3t3-J2s)10. Тем не менее, с появлением бессывороточных сред и доступностью коллагена, многие другие возможности остаются жизнеспособными (см. обсуждение)11. Второе соображение заключается в том, является ли использование антибиотиков в культуральной среде подходящим для визуализации живых клеток. Это будет зависеть от времени визуализации, продолжительности и опыта работы с системой визуализации. Колонии визуализируются в течение нескольких недель с использованием общей системы визуализации, что делает использование антибиотиков предпочтительным подходом, несмотря на потенциальное воздействие на культуры (см. обсуждение). Пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В и гентамицинсодержащая кератиноцитарная среда используют во время ресуспензии с последующим переходом на пенициллин/стрептомицинсодержащую среду после первоначальной смены среды. Этот метод эффективно предотвращает загрязнение во время расширенной визуализации живых клеток.
  13. Подсчитайте ячейки и засейте планшет (см. обсуждение для комментариев по выбору плотности посева). Чтобы обеспечить равномерное распределение посева, перед нанесением покрытия проводят ресуспендию клеток кератиноцитов в общем количестве плоской среды. После легкого перемешивания путем инверсии, слегка перемешать в течение 1-2 с, и надавить на тарелку. Затем переместите микропланшет крестообразно (вверх-вниз, влево-вправо) 3 раза в инкубаторе.
  14. Через 24 ч поместите планшет в инкубатор системы визуализации живых клеток. Выполняйте визуализацию живых клеток с 10-кратной скоростью каждые 20 минут. Поместите образцы при температуре 37 °C и 5%CO2 в инкубатор, прикрепленный к микроскопу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Учитывая множество переменных, которыми можно манипулировать в этом методе, что в конечном итоге приводит к различным результатам, здесь мы описываем распространенные ошибки и их результирующие результаты, а также приводим примеры результатов и обстоятельства, стоящие за ними.

Как и при любом методе культивирования клеток, контаминация возможна (Дополнительное видео 1). Наряду с тщательными методами стерилизации, рассмотрите возможность исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы подробно описали метод первичного культивирования кератиноцитов человека с целью визуализации живых клеток. Этот метод адаптирует существующие методы культивирования клеток с использованием низкоплотного осаждения и долговременного культивирования, чтобы обеспечить успешные исследования визуализации живых клеток. Предпочтительным методом диссоциации этого типа клеток является двухступенчатое ферментативное расщепление, которое, как было показано, приводит к образованию кератиноц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Особая благодарность Т. Ричарду Паренто, доктору медицинских наук, и Александре Шарруйер, доктору фармацевтических наук, за то, что научили меня культивировать кератиноциты. Спасибо доктору медицины Мерисе Пайпер за предоставленные образцы для выделения кератиноцитов. В заключение благодарим доктора медицины Майкла Розенблюма за предоставленный нам доступ к его системе визуализации живых клеток для завершения экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТА (1X), 100 млGibco25300-054
Фильтр на 100 мкм ячейкиКорнинг352360
15 куб.см FalconКорнинг352096
Конический Falcon объёмом 50 куб. смКорнинг352070
Микропластина с 6 лункамиКорнинг3516
70% реактивного спирта, 4 литраVWR ChemicalsBDH1164-4LPМожешь или разбавить свои собственные
Амфотерицин B, 50 млКорнинг30-003-CFРазбавить до 5 раз (50 мкг/мл)
Дипаза, 100 млКорнинг354235Разведите 1:1 с помощью HBSS, добавьте 1x гентамицина, простерилизуйте фильтром
Epilife, 50 млGibcoMEP1500CAДобавьте HKGS, рассмотрите антибиотики
Ценность сыворотки плода крупного рогатого скота Инактивированное тепло FBS, 500 млGibcoA52568-01FBS
Щипцы
Гентамицин, 10 млGibco15750-060Разбавьте до 50 мкг/мл для 5 раз
Сбалансированный сольный раствор Хэнка (1X), 500 млGibco14170-112(HBSS)
HBSS 5X PSAGЭто концентрация HBSS + 5X Pen/Strep/Ampho/Gent
Хибикленс, галлонMolnlycke57591Разведите до 10% с помощью деионизированного H20
Сыворотка для роста кератиноцитов человека, 5 млGibcoS-001-5Добавлено в эпилайф
Пенициллин/стрептомицин, 100 млКорнинг30-002-CLРазбавьте до 5X (выпускается в 100x стандарте) для 5X PSA — 1X для смены медиа
Чашка Петри 100 мм x 15 ммFisher ScientificFB0875713
Скальпельное лезвие NO 23VWR76457-480
TrypLEGibco12604021Менее едкая альтернатива обычному трипсину
Нейтрализующий раствор трипсина(TNS), это HBSS с 10% FBS (некоторые используют меньше сыворотки, 5%)

Ссылки

  1. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
  2. Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds. Phy Res Aca Sci Boh. 69 (4), 731-738 (2020).
  3. Xiao, T., et al. Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells. Stem Cell Res The. 15 (1), 76(2024).
  4. Noujarède, J., et al. Sphingolipid paracrine signaling impairs keratinocyte adhesion to promote melanoma invasion. Cell Rep. 42 (12), 113586(2023).
  5. Sun, M., et al. An image-based dynamic high-throughput analysis of adherent cell migration. Bio-prol. 11 (6), e3957(2021).
  6. Chapman, S., McDermott, D. H., Shen, K., Jang, M. K., McBride, A. A. The effect of Rho kinase inhibition on long-term keratinocyte proliferation is rapid and conditional. Stem Cell Res The. 5 (2), 60(2014).
  7. U.S. Department of Health and Human Services. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 6th edition, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. USA. (2020).
  8. Poumay, Y., Roland, I. H., Leclercq-Smekens, M., Leloup, R. Basal detachment of the epidermis using dispase: tissue spatial organization and fate of integrin alpha 6 beta 4 and hemidesmosomes. J Inv Der. 102 (1), 111-117 (1994).
  9. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. CellTra. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  10. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6 (3), 331-343 (1975).
  11. Boisseau, A. M., et al. Production of epidermal sheets in a serum free culture system: a further appraisal of the role of extracellular calcium. J Der Sci. 3 (2), 111-120 (1992).
  12. Roshan, A., et al. Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation. Nat Cell Bio. 18 (2), 145-156 (2016).
  13. Nanba, D., et al. EGFR-mediated epidermal stem cell motility drives skin regeneration through COL17A1 proteolysis. J Cell Bio. 220 (11), e202012073(2021).
  14. Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Der. 28 (2), 107-112 (2019).
  15. Guo, A., Jahoda, C. A. B. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Exp Derm. 18 (8), 720-726 (2009).
  16. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Bio Rep. 3 (3), 304-308 (2015).
  17. Usta, S. N., Scharer, C. D., Xu, J., Frey, T. K., Nash, R. J. Chemically defined serum-free and xeno-free media for multiple cell lineages. Ann of tra med. 2 (10), 97(2014).
  18. Lenihan, C., Rogers, C., Metcalfe, A. D., Martin, Y. H. The effect of isolation and culture methods on epithelial stem cell populations and their progeny-toward an improved cell expansion protocol for clinical application. Cyt. 16 (12), 1750-1759 (2014).
  19. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (12), 695-705 (1986).
  20. Ponce, L., et al. Isolation and cultivation of primary keratinocytes from piglet skin for compartmentalized co-culture with dorsal root ganglion neurons. J Cell Bio. 2 (2), 93-115 (2017).
  21. Nygaard, U. H., et al. Antibiotics in cell culture: friend or foe? Suppression of keratinocyte growth and differentiation in monolayer cultures and 3D skin models. Exp Der. 24 (12), 964-965 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Получение первичных культур для визуализации живых клеток кератиноцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.