Здесь мы предлагаем метод визуализационного анализа живых клеток, который можно использовать для ручного отслеживания линий кератиноцитов пассажа 0 и который позволяет собирать метрики пролиферации, включая судьбу деления клеток и продолжительность клеточного цикла.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация живых клеток с помощью покадровой съемки для изучения кинетики пролиферации эпидермальных кератиноцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Визуализация живых клеток является развивающимся и довольно сложным методом изучения поведения кератиноцитов in vitro. Исторически сложилось так, что поведение деления кератиноцитов изучалось с помощью таких методов, как клональный анализ, иммуноокрашивание и анализ клеточного цикла. Ни один из этих методов не позволяет анализировать поведение кератиноцитов на уровне отдельных клеток в режиме реального времени. В течение последнего десятилетия группы использовали визуализацию живых клеток для идентификации кератиноцитарных стволовых клеток и фиксированных предшественников без необходимости мечения. Были выявлены различия в поведении деления каждой соответствующей группы, скорости терминальной дифференцировки и продолжительности клеточного цикла. В данной статье описывается метод визуализации живых клеток кератиноцитов с помощью покадровой съемки и ее анализ. Использование непассаженных кератиноцитов рекомендуется для этого метода, чтобы наиболее точно имитировать поведение in vivo . Визуализация живых клеток предоставляет уникальную возможность изучать поведение стволовых клеток и коммитированных предшественников на уровне отдельных клеток и определять судьбу деления, продолжительность клеточного цикла, а также другие показатели пролиферации.
Введение
Возможность визуализации клеточных популяций in vitro в режиме реального времени по мере их увеличения в течение длительных периодов времени является уникальным преимуществом визуализации живых клеток. Визуализация живых клеток позволяет оценить подвижность, миграцию и пролиферацию клеток на уровне отдельных клеток. Целью этого протокола является оптимизация визуализации культур кератиноцитов с помощью покадровой фотосъемки и создания видео, которые затем можно отслеживать вручную для получения подробных данных о клеточном поведении.
Мы уделяем особое внимание кинетике распространения. На основе анализа видеозаписей визуализации живых клеток можно выяснить деревья линий и оценить время между делениями (показатель продолжительности клеточного цикла), а также пропорции делений, которые приводят к дальнейшему делению в сравнении с дифференцировкой дочерних клеток.
Существует значительная вариабельность от донора к донору при работе с первичными кератиноцитами и частые неудачные попытки размножения клеток. Из-за этого многие исследователи предпочитают использовать высокопролиферативные кератиноциты, такие как клетки HaCaT или неонатальные кератиноциты, часто после того, как они претерпели множественные пассажи invitro 1. Культивирование первичных кератиноцитов из кожи взрослого или пожилого человека с целью отслеживания родословной может быть сложной задачей. Тем не менее, существуют проблемы с использованием пассажных клеток из клеточных линий или из мужской крайней плоти. Повторное пассирование приводит к образованию клеток, которые значительно отличаются от их состояния in vivo 2. Кроме того, было показано, что клетки HaCaT реагируют иначе, чем первичные кератиноциты в множественных анализах 3,4,5. Для использования клеток, которые наиболее близки к своим аналогам in vivo, используются кератиноциты пассажа 0 от взрослых доноров человека. Кератиноцитарные стволовые клетки и коммитированные предшественники демонстрируют явные различия в поведении, что позволяет различать колонии из любой популяции с помощью визуализации живых клеток6. Эта относительно новая способность визуализировать поведение одиночных кератиноцитов в долгосрочной перспективе была использована только в нескольких предыдущих исследованиях с использованием аналогичных методов 6,7,8. Этот протокол описывает визуализацию первичных кератиноцитов в живых клетках с помощью системы анализа живых клеток IncuCyte S3. На основе построенных деревьев линий можно определить тип колонии (стволовые клетки против фиксированного предшественника), а также продолжительность клеточного цикла и долю делений дифференцировки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данное исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все человеческие ткани были получены после одобрения институционального наблюдательного совета (IRB) Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF), и было получено согласие на все используемые ткани.
1. Покадровая фотосъемка прохождения 0 кератиноцитов человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специфичен для IncuCyte S3 и SX5.
- Убедитесь в том, что получены соответствующие разрешения от исследовательского комитета учреждения на людях для использования человеческих тканей в исследовании.
- Выделите кератиноциты из свежей кожи, как описано ранее9.
- Определите плотность заделки семян для проведения пробы. Проведите пилотные исследования с образцами при многократном разведении от разных доноров, чтобы понять плотность клеток, необходимую для обеспечения достаточного количества колоний для исследования, но предотвращения чрезмерного количества колоний, которые приводят к перекрытию колоний в течение периода наблюдения. Запускайте эти пилотные проекты в идентичных экспериментальных условиях (с теми же планшетами, реагентами и т. д.), так как эти факторы могут изменить результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком низкая плотность посева приводит к недостаточному росту, в то время как слишком высокая плотность посева приводит к невозможности точного отслеживания клеток из-за скученности клеток в поле.- Для кератиноцитов Passage 0 из крайней плоти новорожденных в течение 48 ч из коллекции, хранящейся при 4 °C в среде сбора, обеспечьте плотность посева 1000-5000/см2. Для кератиноцитов Р1 используйте 500-2000 клеток/см2 . Чем дальше проход, тем ниже плотность заделки семян.
- Ячейки пластины на выбранном размере пластины.
Примечание: 96-луночные планшеты и микропланшеты обладают менисковым эффектом, что приводит к неравномерному распределению клеток, при этом большая часть роста находится за пределами поля тепловизора. Планшеты с большими лунками (например, 24-луночные планшеты) позволяют собирать больше данных. Планшеты с 24 скважинами позволяют визуализировать до 36 месторождений, в то время как планшеты с 96 скважинами позволяют визуализировать до 5 месторождений. Тем не менее, количество полей, захватываемых прибором, конечно, и большее количество полей будет использовать большую часть емкости тепловизора. Как правило, используется 24-луночная пластина.- Чтобы добиться равномерного распределения ячеек на пластине, можно использовать различные методики. Во-первых, вместо того, чтобы засевать каждую лунку по отдельности, выделите общую среду, необходимую для всех лунок, при определенном разведении в микротрубку. Затем пипеткой нанесите общее количество клеток, необходимое для того, чтобы аликвота достигла желаемой плотности, и аккуратно переверните трубку, чтобы равномерно распределить клетки.
- После нанесения покрытия переместите пластину крестообразно три раза (вверх-вниз, влево-вправо) и затем аккуратно перенесите в инкубатор.
ВНИМАНИЕ: При использовании микропланшета избегайте внешних рядов и столбцов лунок, так как интервальная съемка микроскопа выделяет тепло при визуализации и может вызвать испарение среды в этих лунках. Экспериментальные лунки должны быть сгруппированы в центре планшета и окружены лунками, содержащими PBS или другую стерильную жидкость с максимальной производительностью для уменьшения эффектов испарения/краев.
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5%CO2 для обеспечения прилипания.
- Смените носитель через 24 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожьте растущий монослой при отсасывании. Всегда используйте подогретую среду (37 °C) и аккуратно направляйте среду в лунки с помощью боковой стенки. Здесь используется среда Epilife/Supplement S7/Primocin. Для этого применения рекомендуется использование антибиотиков в средах для долгосрочной визуализации живых клеток. Расширенное культивирование в машине, используемой для нескольких одновременных экспериментов, подвержено высокому риску заражения. Обычно используются пенициллин и стрептомицин. - Откройте инкубатор, нажав большую треугольную кнопку в левом нижнем углу, чтобы открыть лоток, когда загорится зеленый свет. Поставьте судно в открытую бухту. Затем закройте лоток с помощью той же кнопки в левом нижнем углу. Никогда не открывайте лоток, когда кнопка для открытия горит красным, так как это означает, что сканирование активно сканирует, и сканирование будет прервано.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что сканирование не происходит, начиная с просмотра экрана на модуле контроллера. Он показывает время до следующего сканирования и продолжительность сканирования. Если сканирование началось, оно даст время до завершения сканирования. - Откройте приложение на компьютере и авторизуйтесь, используя соответствующий идентификатор пользователя и пароль. Выберите Расписание.
- Нажмите кнопку + в верхнем левом углу под графиком, чтобы добавить табличку в расписание.
- Выберите «Сканировать по расписанию», затем нажмите «Далее».
- Выберите «Создать», затем нажмите «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эта пластина идентична предыдущему или выполняемому эксперименту, можно использовать команды «Копировать предыдущий » или «Копировать текущий » для ускорения форматирования эксперимента. - Выберите «Стандартный » в качестве типа сканирования, затем нажмите «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ: Image Lock - это запатентованная 96-луночная пластина, которая помогает свести к минимуму потерю фокуса/скачки изображения, что может быть полезно при возникновении этих проблем. Другие типы сканирования не особенно полезны для отслеживания родословной. - Для настроек сканирования выберите «Адгезивная ячейка за ячейкой », используя фазовый канал при 10-кратном заце, затем нажмите «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбран фазовый канал, на этом этапе нет необходимости выбирать опцию анализа, так как анализ может быть начат после сбора данных. - Выберите судно, затем нажмите «Далее». Большинство распространенных сосудов совместимы с аппаратом, хотя для немикропланшетов могут потребоваться специальные насадки, чтобы поместиться в отсеки интервального микроскопа.
- Выберите пустой отсек для размещения судна, затем нажмите «Далее».
- Выберите лунки для сканирования, а также изображения для каждой лунки, затем нажмите «Далее». Предполагаемая продолжительность сканирования будет указана в левом нижнем углу экрана.
- Присвойте эксперименту имя, используя нужное соглашение об именовании. Создайте карту эксперимента на планшете для дальнейшего использования, затем нажмите «ОК». Наконец, нажмите «Далее».
- Отложите анализ до окончания сбора данных, так как поэлементный анализ должен быть начат после завершения сканирования. Нажмите Далее.
- Наконец, установите частоту визуализации. Чтобы надежно отслеживать митозы, которые происходят в течение 30 минут, сканируйте кератиноциты с интервалом в 20 минут. Нажмите Next и подтвердите настройки, чтобы начать эксперимент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования не может перекрываться, и производители рекомендуют, чтобы устройство находилось в состоянии покоя в течение всего сканирования. С интервалом в 20 минут это означает, что на сканирование должно быть потрачено максимум 10 минут. Если 12 лунок из 24 луночных планшетов визуализируются с 36 видами на лунку, сканирование занимает 7 минут, поэтому при планировании всегда учитывайте ресурсы, доступные для эксперимента.- Есть уведомление, если у машины недостаточно времени для отдыха, и если время сканирования перекрывается, то судно не может быть добавлено в расписание. Если судно не вписывается в расписание с регулярным интервалом, нажмите «Зарезервировать местоположение лотка » и нажмите «Далее».
- Дважды кликните по расписанию в верхней части экрана и выберите судно в резерве, затем вручную нажмите, чтобы добавить изображения на открытые временные интервалы. Либо щелкните правой кнопкой мыши после открытия расписания, чтобы удалить все запланированное время сканирования, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы установить новое время сканирования для группы сканирования через равные промежутки времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это прервало бы все эксперименты на машине до тех пор, пока не будет установлено новое время. Не забудьте нажать на иконку дискеты для сохранения или на красный крестик, чтобы отменить изменения в расписании. Выбор нужных скважин или видов является простым процессом, так как машина сразу же предоставляет расчетное время сканирования после выбора параметра. Продолжительность сканирования зависит от типа и марки выбранной пластины, а также от количества лунок или видов для сканирования. Это позволяет пользователям настраивать параметры сканирования в соответствии с производительностью машины.
- Для кератиноцитов меняйте среду каждые 48 ч. Чтобы обеспечить правильную ориентацию пластины, дождитесь завершения первого сканирования каждый раз, когда сосуд помещается в машину (если позволяет время). Это простая ошибка. Поместите табличку в машину так, чтобы буквы, обозначающие ряды, находились с левой стороны пролета.
- Чтобы просмотреть сканы, нажмите кнопку «Просмотр» со значком глаза , а затем дважды щелкните эксперимент. Рассмотрите возможность ранней смены среды, если происходит резкое изменение цвета среды (фенолсодержащая красная среда становится желтой из-за закисления), если присутствует избыток мертвых клеток (может препятствовать размножению живых колоний) или если наблюдается аномальная морфология.
- Как только все скважины станут спокойными или достигнут слияния, экспортируйте эксперимент. Наблюдайте за взрослыми колониями в течение ~2 недель и за новорожденными в течение ~10 дней, после чего скученность приводит к снижению отдачи от анализов.
- Чтобы экспортировать, перейдите на вкладку « Вид » и дважды щелкните эксперимент под списком последних сканирований (по умолчанию они упорядочиваются от самого последнего в обратном направлении). Нажмите на значок «Альбом » со стрелкой и дождитесь запуска инструмента экспорта.
- Нажмите «Как отображается», затем нажмите «Далее».
- Вручную щелкните каждое поле представления для экспорта, затем нажмите «Далее».
- Выберите, требуется ли фильм или серия изображений, а затем выберите время сканирования для экспорта. Для отслеживания линии кератиноцитов используйте опцию «Фильм» и выберите все сканирования (для ускорения этого есть значок быстрого выбора всех с пунктирной линией). Нажмите Далее.
- Экспортируйте со скоростью 1 кадр в секунду при максимальном качестве (установите это с помощью полоски рядом с качеством). Нажмите Далее.
- Выберите целевую папку и тип файла. Присвойте файлу имя и нажмите кнопку «Экспорт».
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспорт видео может занять много времени, в зависимости от скорости подключения к Интернету и задействованного компьютера. Будьте готовы ждать несколько дней, чтобы экспортировать все видеофайлы для более крупных экспериментов. Возможность удаленного входа в систему покадровой съемки чрезвычайно удобна.
2. Использование покадровой визуализации для построения деревьев родословной и создания таблиц данных
- Откройте видеофайл с помощью медиаплеера. Рекомендуется использовать медиаплеер VLC.
- Прокрутите видео и определите растущие колонии. В VLC используйте клавишу со стрелкой для пропуска кадров вперед и назад. Сделайте скриншот колонии, которую нужно отслеживать, и пометьте колонию.
- Определите интересующую вас колонию в конце или после нескольких дней видеозаписи, затем перемотайте видео назад и определите клетку, образующую колонию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Именно здесь важно иметь соответствующую плотность посева. Если слишком много колоний развиваются рядом друг с другом, они расширяются и сливаются друг с другом, что делает невозможным точное отслеживание делений клеток. - Когда клетка собирается делиться, кажется, что она конденсируется (рис. 1). Поставьте видео на паузу, когда произойдет разделение. Запишите время деления (временная метка находится в левом нижнем углу). Сделайте скриншот этого начального деления и присвойте ему ту же метку, что и колонии. Запишите подразделения на нарисованной от руки схеме родословной (см. Репрезентативные результаты). Продолжайте отслеживать и документировать как можно больше поколений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированное отслеживание клеток было разработано для ускорения этого процесса и более точного отслеживания клеток7. Даже в условиях культивирования с низким содержанием кальция и минимальной дифференцировкой моделям машинного обучения в настоящее время не хватает чувствительности для точного отслеживания деления кератиноцитов. - Транскрибируйте вручную дерево родословной в таблицы данных - так называемые "зеленые листы" из-за цвета в таблице (Дополнительный файл 1).
- Используйте зеленые листы для расчета пропорций пролиферативного и дифференцировочного деления, идентификации колоний стволовых клеток и коммитированных прогениторов, а также продолжительности клеточного цикла (см. репрезентативные результаты).
ПРИМЕЧАНИЕ: Машина способна анализировать данные с помощью собственных базовых и поклеточных анализаторов для выполнения нескольких других анализов (confluence, scratch). Однако это выходит за рамки данного протокола.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Первичные кератиноциты растут стереотипным образом, что можно отследить с помощью визуализации живых клеток. Медиаплеер VLC используется для просмотра записей. Время до первого деления варьирует и может составлять несколько дней в зависимости от характеристик донора, таких как возраст, состояние здоровья или факторы роста, присутствующие в среде in vitro . При первоначальном посеве кератиноциты имеют маленький, округлой вид (Рисунок 1). После посева...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Визуализация кератиноцитов в живых клетках — это метод отслеживания поведения деления стволовых клеток и коммитированных предшественников. Учитывая, что поддержание эпидермиса зависит от кинетики пролиферации стволовых клеток и коммитированных предшественников, детальное понимание изменений в этих популяциях кератиноцитов и того, как они влияют при различных состояниях, облегчает разработку методов лечения для улучшения обнаруженных дефектов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана премией Merit Review Award Number I01 CX001816 от Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов Служба клинических исследований и разработок (CSRD). Содержание не отражает точку зрения Министерства по делам ветеранов США или правительства США. Мы благодарим доктора Майкла Розенблюма за предоставленный нам доступ к его покадровому микроскопу для проведения наших экспериментов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-я скважинная пластина с изображением | Сарториус | BA-04856 | Рекомендую микропластины, совместимые с машиной, если использую пластину на 96 лунок. |
| 24-скважинная плита | Корнинг | 3524 | Рекомендую совместимую с микропластинами, если использую пластину на 24 лунки. |
| Амфотерицин B, 50 мл | Корнинг | 30-003-CF | Разбавьте до 5x (выпускается в 100x стандарте) для 5x PSA — 1x для замены медиа |
| Epilife, 50 мл | Gibco | MEP1500CA | Добавьте S7, рассмотрим примоцин |
| IncuCyte S3 | Сарториус | 4637 | Имиджер (приемлемые альтернативы Zoom/SX5) |
| Пенициллин/стрептомицин, 100 мл | Корнинг | 30-002-CL | Разбавьте до 5x (выпускается в стандартном варианте 100x) |
| Примоцин | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 мл на 500 мл носителя |
| Дополнение S7 | Gibco | S0175 | Добавлено в эпилайф |
Ссылки
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds. Physiol Res. 69 (4), 731-738 (2020).
- Moran, M. C., et al. Characterization of human keratinocyte cell lines for barrier studies. JID Innov. 1 (2), 100018(2021).
- Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomol Ther. 20 (2), 171-176 (2012).
- Jahn, M., et al. Different immortalized keratinocyte cell lines display distinct capabilities to differentiate and reconstitute an epidermis in vitro. Exp Dermatol. 33 (1), e14985(2024).
- Xiao, T., et al. Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 76(2024).
- Hirose, T., Kotoku, J., Toki, F., Nishimura, E. K., Nanba, D. Label-free quality control and identification of human keratinocyte stem cells by deep learning-based automated cell tracking. Stem Cells. 39 (8), 1091-1100 (2021).
- Roshan, A., Murai, K., Fowler, J., Simons, B. D., Nikolaidou-Neokosmidou, V., Jones, P. H. Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation. Nat Cell Biol. 18 (2), 145-156 (2016).
- Abegaze, B., Ijeh, N., Vittimberga, B., Ghadially, R. Generating primary cultures for the purpose of keratinocyte live cell imaging. J Vis Exp. , In Press (2024).
- Piedrafita, G., et al. A single-progenitor model as the unifying paradigm of epidermal and esophageal epithelial maintenance in mice. Nat Commun. 11 (1), 1429(2020).
- Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
- Malin-Mayor, C., et al. Automated reconstruction of whole-embryo cell lineages by learning from sparse annotations. Nat Biotechnol. 41 (1), 44-49 (2023).
- Waliman, M., et al. Automated cell lineage reconstruction using label-free 4D microscopy. Genetics. 228 (2), iyae135(2024).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
