Здесь мы предлагаем метод визуализационного анализа живых клеток, который можно использовать для ручного отслеживания линий кератиноцитов пассажа 0 и который позволяет собирать метрики пролиферации, включая судьбу деления клеток и продолжительность клеточного цикла.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация живых клеток с помощью покадровой съемки для изучения кинетики пролиферации эпидермальных кератиноцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Визуализация живых клеток является развивающимся и довольно сложным методом изучения поведения кератиноцитов in vitro. Исторически сложилось так, что поведение деления кератиноцитов изучалось с помощью таких методов, как клональный анализ, иммуноокрашивание и анализ клеточного цикла. Ни один из этих методов не позволяет анализировать поведение кератиноцитов на уровне отдельных клеток в режиме реального времени. В течение последнего десятилетия группы использовали визуализацию живых клеток для идентификации кератиноцитарных стволовых клеток и фиксированных предшественников без необходимости мечения. Были выявлены различия в поведении деления каждой соответствующей группы, скорости терминальной дифференцировки и продолжительности клеточного цикла. В данной статье описывается метод визуализации живых клеток кератиноцитов с помощью покадровой съемки и ее анализ. Использование непассаженных кератиноцитов рекомендуется для этого метода, чтобы наиболее точно имитировать поведение in vivo . Визуализация живых клеток предоставляет уникальную возможность изучать поведение стволовых клеток и коммитированных предшественников на уровне отдельных клеток и определять судьбу деления, продолжительность клеточного цикла, а также другие показатели пролиферации.
Введение
Возможность визуализации клеточных популяций in vitro в режиме реального времени по мере их увеличения в течение длительных периодов времени является уникальным преимуществом визуализации живых клеток. Визуализация живых клеток позволяет оценить подвижность, миграцию и пролиферацию клеток на уровне отдельных клеток. Целью этого протокола является оптимизация визуализации культур кератиноцитов с помощью покадровой фотосъемки и создания видео, которые затем можно отслеживать вручную для получения подробных данных о клеточном поведении.
Мы уделяем особое внимание кинетике распространения. На основе ан....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данное исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все человеческие ткани были получены после одобрения институционального наблюдательного совета (IRB) Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF), и было получено согласие на все используемые ткани.
1. Покадровая фотосъемка прохождения 0 кератиноцитов человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специфичен для IncuCyte S3 и SX5.
- Убедитесь в том, что получены соответствующие разрешения от исследовательского комитета учреждения на людях для использования человеческих тканей в исс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Первичные кератиноциты растут стереотипным образом, что можно отследить с помощью визуализации живых клеток. Медиаплеер VLC используется для просмотра записей. Время до первого деления варьирует и может составлять несколько дней в зависимости от характеристик донора, таких как возраст, состояние здоровья или факторы роста, присутствующие в среде in vitro . При первоначальном посеве кератиноциты имеют маленький, округлой вид (Рисунок 1). После посева.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Визуализация кератиноцитов в живых клетках — это метод отслеживания поведения деления стволовых клеток и коммитированных предшественников. Учитывая, что поддержание эпидермиса зависит от кинетики пролиферации стволовых клеток и коммитированных предшественников, детальное понимание изменений в этих популяциях кератиноцитов и того, как они влияют при различных состояниях, облегчает разработку методов лечения для улучшения обнаруженных дефектов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана премией Merit Review Award Number I01 CX001816 от Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов Служба клинических исследований и разработок (CSRD). Содержание не отражает точку зрения Министерства по делам ветеранов США или правительства США. Мы благодарим доктора Майкла Розенблюма за предоставленный нам доступ к его покадровому микроскопу для проведения наших экспериментов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-я скважинная пластина с изображением | Сарториус | BA-04856 | Рекомендую микропластины, совместимые с машиной, если использую пластину на 96 лунок. |
| 24-скважинная плита | Корнинг | 3524 | Рекомендую совместимую с микропластинами, если использую пластину на 24 лунки. |
| Амфотерицин B, 50 мл | Корнинг | 30-003-CF | Разбавьте до 5x (выпускается в 100x стандарте) для 5x PSA — 1x для замены медиа |
| Epilife, 50 мл | Gibco | MEP1500CA | Добавьте S7, рассмотрим примоцин |
| IncuCyte S3 | Сарториус | 4637 | Имиджер (приемлемые альтернативы Zoom/SX5) |
| Пенициллин/стрептомицин, 100 мл | Корнинг | 30-002-CL | Разбавьте до 5x (выпускается в стандартном варианте 100x) |
| Примоцин | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 мл на 500 мл носителя |
| Дополнение S7 | Gibco | S0175 | Добавлено в эпилайф |
Ссылки
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
