Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование сборки in vivo для высокоэффективного конструирования плазмид

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67870

⸱

7 февраля 2025 г.

 , 
1College of Medicine, Department of Biochemistry, Microbiology, and Immunology, University of Saskatchewan

В этой статье

Краткое содержание

Сборка in vivo — это независимый от лигирования метод клонирования, который основан на собственных ферментах репарации ДНК у бактерий для сборки фрагментов ДНК путем гомологичной рекомбинации. Этот протокол является как быстрым, так и экономически эффективным, так как требуется небольшое количество реагентов, а эффективность клонирования может достигать 99 %.

Аннотация

Сборка in vivo (IVA) — это метод молекулярного клонирования, при котором используются собственные ферменты, присутствующие в бактериях, способствующие межмолекулярной рекомбинации фрагментов ДНК для сборки плазмид. Этот метод работает путем преобразования фрагментов ДНК с областями гомологии 15-50.н. в широко используемые лабораторные штаммы Escherichia coli , и бактерии используют независимый от RecA путь репарации для сборки фрагментов ДНК в плазмиду. Этот метод является более быстрым и экономически эффективным, чем многие методы молекулярного клонирования, которые основаны на сборке плазмид in vitro до трансформации в штаммы E. coli . Это связано с тем, что методы in vitro требуют закупки специализированных ферментов и проведения последовательных ферментативных реакций, требующих инкубации. Однако, в отличие от методов in vitro , экспериментально не было показано, что НДС собирает линейные плазмиды. В этой статье мы рассказываем о протоколе IVA, используемом нашей лабораторией для быстрой сборки плазмид и субклонирования фрагментов ДНК между плазмидами с различным происхождением репликации и маркерами устойчивости к антибиотикам.

Введение

Молекулярное клонирование включает в себя ряд лабораторных методов, необходимых для получения плазмид, содержащих специфическую рекомбинантную ДНК1. Эти вездесущие методы часто выступают в качестве узкого места в экспериментальном рабочемпроцессе2. Многие методы молекулярного клонирования основаны на сборке фрагментов ДНК in vitro с использованием серии ферментативных реакций перед превращением в штамм-хозяин (например, Escherichia coli DH5a) для амплификации 3,4,5,6,7. Поскольку методы сборки плазмид in vitro основаны на ферментах, покупка или очистка ферментов может быть как дорогостоящей, так и трудоемкой.

Сборка in vivo (IVA) представляет собой метод молекулярного клонирования, основанный на межмолекулярной рекомбинации фрагментов ДНК в подходящем хозяине 8,9,10,11,12. В основе этого метода лежало наблюдение о том, что широко используемые повторно клонирующие штаммы E. coli могут опосредуть межмолекулярную рекомбинацию одноцепочечного праймера с плазмидой, расщепленной ферментами рестрикции13. Использование ПЦР для получения гомологичных концов ДНК для сборки плазмид у E. coli было описано в 1990-х годах, и этот метод получил название рекомбинационная ПЦР 3,14. Сообщалось, что эффективность рекомбинационной ПЦР составила около 50%14. Тем не менее, этот метод не получил широкого распространения, вероятно, из-за высокой стоимости праймеров и риска введения нежелательных мутаций с использованием полимераз низкой точности для амплификации больших фрагментов ДНК. Эти недостатки были значительными в 1990-х годах, и их можно было избежать, используя методы клонирования in vitro, такие как клонирование, опосредованное рестрикцией ферментов.

В последние годы стоимость праймеров снизилась, а новые коммерческие полимеразы повысили точность амплификации ПЦР. В результате рекомбинационная ПЦР была пересмотрена в качестве быстрого и экономически эффективного метода молекулярного клонирования и переименована в IVA 2,9,15,16. В связи с повышением осуществимости НДС был дополнительно изучен и метод был оптимизирован для достижения эффективности клонирования до 99%16. В ходе оптимизаций были выявлены особенности гомологичной ДНК, такие как количество пар оснований и температура плавления, которые максимизируют эффективность рекомбинации in vivo 2,16. Дальнейший анализ показал, что до 6 фрагментов ДНК в диапазоне от 150 до 7.н. могут быть эффективно собраны с помощью IVA15. Кроме того, наша группа недавно использовала IVA для сборки серии плазмид с различными кассетами с устойчивостью к антибиотикам и истоками репликации17. В этом исследовании клонирование IVA было высокоэффективным (71-100%) с небольшим числом клонов, протестированных для каждой плазмиды (n = 2)17. Здесь мы опишем протокол IVA, используемый в нашей лаборатории.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Спроектируйте праймеры или фрагменты ДНК с гомологичными концами

  1. Используйте программное обеспечение для обработки текстов или специализированное программное обеспечение для анализа ДНК, чтобы искусственно собрать желаемую плазмиду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто бывает полезно пометить цветом фрагменты ДНК из разных источников и выделить гомологичные области, которые будут использоваться на последующих этапах сборки. Кроме того, также полезно маркировать гомологичную ДНК цветом, чтобы обеспечить направленную сборку.
  2. Дизайн-праймеры, которые связываются с каждым фрагментом ДНК и содержат 15-50.н. гомологичной последовательности ДНК (рис. 1)2,15.
    1. Для повышения эффективности ИВА убедитесь, что гомологичные фрагменты ДНК имеют температуру плавления 47-52 °С2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура плавления может быть определена с помощью онлайнового программного обеспечения18 или по формуле: Температура плавления = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), где n = количество G, C, A или T в последовательности 6,19.
    2. Избегайте праймеров с часто повторяющимися последовательностями, такими как CATCATCATCATCAT, которые кодируют для HIS-метки, так как они могут привести к нестабильности20. Если для таких применений, как вставка поли-ГИС метки, требуется окончательная повторяющаяся аминокислотная последовательность, используйте альтернативные кодоны, такие как CATCACCATCACCAC, чтобы уменьшить повторение последовательности нуклеиновых кислот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки можно заказать у любого предпочтительного поставщика. Если предполагается синтезировать фрагменты ДНК, то в синтезированный фрагмент ДНК должны быть включены гомологичные концы.

2. Амплификация продуктов ДНК, содержащих гомологичные концы

  1. Изолируйте плазмидную ДНК или матрицы геномной ДНК с помощью стандартных коммерчески доступных наборов для выделения ДНК или щелочного лизиса 6,17.
  2. Используйте матрицу ДНК (из шага 2.1) и праймеры, содержащие гомологичные участки (шаг 1.2), в реакции ПЦР с коммерчески доступной полимеразой высокой точности. Чтобы ограничить перенос матриц ДНК в последующих реакциях, используйте небольшое количество матричной ДНК (20 пг-1 нг) в каждой реакции. Обратитесь к рекомендациям производителя по компонентам ферментоспецифичной реакционной смеси ПЦР и рекомендуемым условиям циклирования ПЦР. Приступайте к ПЦР-реакции.
    1. Настройте реакции ПЦР (50 μL) для амплификации фрагментов ДНК, показанных на рисунке 2 , чтобы они содержали 100 μM dNTP, 0,2 μM каждого праймера ДНК, матричную ДНК (50 пг pSU19 и 1 нг pSU18mCherry), 1x реакционную буферную смесь для ПЦР, содержащую Mg2+ (конечная концентрация 2 мМ), и 1 U высокоточной ДНК-полимеразы.
    2. Используйте программу циклического тачдауна ПЦР для амплификации pSU19 и mCherry (Рисунок 2). Установите начальную стадию денатурации на уровне 95 °C в течение 5 минут, затем 10 циклов при 95 °C в течение 15 с, 55 °C-0,5 °C за цикл в течение 15 с и 72 °C в течение 1 мин, а затем 20 дополнительных циклов при 95 °C в течение 15 с, 50 °C в течение 15 с и 72 °C в течение 1 мин. Завершите цикл ПЦР заключительным этапом удлинения при температуре 72 °C в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмидный остов должен быть амплифицирован, отрегулируйте количество матрицы ДНК в зависимости от молекулярной массы: ~20 пг/1.н. плазмидной ДНК на 50 мкл ПЦР-реакции (50 пг ДНК для pSU19 (показано)). Кроме того, корректируйте циклы ПЦР таким образом, чтобы свести к минимуму количество мутаций, вносимых при амплификации: для амплификации плазмидных остов достаточно всего 20-25 циклов ПЦР.
  3. После завершения ПЦР-реакции удалите аликвоту (2 мкл) ПЦР-реакции, соедините с загрузочным красителем (до концентрации 1x) и разделите фрагменты ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле21. Используйте ультрафиолетовый (УФ) или светодиодный трансиллюминатор для визуализации фрагментов ДНК, которые мигрировали в агарозном геле. Определите, являются ли продукты ПЦР уникальными, и сравните продукты с лестницей ДНК, чтобы проверить, имеют ли они ожидаемую молекулярную массу (Рисунок 2). Если продукты ПЦР правильной молекулярной массы не визуализируются, обратитесь к рекомендациям производителя по оптимизации ПЦР-реакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда продукты ПЦР не являются уникальными, но имеется большое количество фрагментов ДНК, соответствующих ожидаемой молекулярной массе, можно избежать дополнительной реакции ПЦР.
  4. Если в агарозном геле присутствует несколько фрагментов ДНК, вырежьте из агарозного геля фрагмент ДНК, соответствующий ожидаемой молекулярной массе, и используйте набор для экстракции агарозного геля для восстановления фрагмента ДНК.
  5. Чтобы удалить метилированную матричную ДНК из реакций ПЦР, добавьте 1 мкл DpnI непосредственно в реакционную пробирку. Инкубируйте реакции при температуре 37°C в течение 15 минут или на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот необязательный шаг настоятельно рекомендуется для ограничения количества матричной ДНК, которая переносится вперед в последующих реакциях. Однако этот этап можно пропустить, если в реакции ПЦР используются очень низкие концентрации матричной ДНК.
  6. Используйте набор для очистки нуклеиновых кислот для удаления остаточных ферментов, солей, димеров праймеров и других нежелательных низкомолекулярных продуктов ДНК, полученных в результате ферментативных анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1-2.6 можно пропустить, если синтезируются фрагменты ДНК.
  7. Количественно оцените концентрацию ДНК в очищенных фрагментах ДНК с помощью спектрофотометрии или оценки геля.

3. НДС (Рисунок 3)

  1. Рассчитайте количество ДНК, необходимое для каждой реакции IVA (рекомендуется 25-50 нг плазмидной ДНК). Используйте большее количество плазмидной ДНК для плазмид с более высокой молекулярной массой (например, для плазмид 2,3.н. используйте 25 нг плазмиды, но если плазмиды 9.н., используйте 50 нг в каждой реакции). Рассчитать объем вставной ДНК, необходимый для проведения реакции; используйте молярное соотношение плазмиды ДНК 1:3 или 1:5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Онлайн-калькуляторы биографии или формулы, представленные ниже, могут быть использованы для расчета молярного количества двухцепочечного фрагмента ДНК и определения молярного соотношения каждого фрагмента ДНК.
    Для расчета молярного количества двухцепочечного фрагмента ДНК мы используем следующую формулу: pmol = (вес в нг) × 1000 / (пары оснований × 650 дальтон). Кроме того, молярные соотношения могут быть рассчитаны следующим образом: масса вставки (г) = желаемое отношение вставки/плазмиды моляров × масса плазмиды (г) × отношение вставки к длине плазмиды6.
  2. Объедините рассчитанный объем плазмиды и вставьте ДНК в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и держите на льду.
  3. Перенесите плазмиду и вставьте смесь ДНК из стадии 3.2 в аликвоту (25-100 мкл) размороженной рекА-химически компетентной E. coli (например, E. coli DH5a;пункт 22).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем используемых компетентных клеток зависит от объема плазмиды и вставной смеси ДНК; Эта смесь не должна превышать 10% объема компетентных клеток.
  4. Перейдите к преобразованию теплового шока23.
    1. Инкубируйте смесь химически компетентной кишечной палочки и ДНК на льду в течение 30 минут.
    2. Переложите на водяную баню при температуре 42 °C на 1 минуту, затем переложите трубку в лед на 2 минуты.
    3. Асептически перенесите LB в пробирку, чтобы довести объем до 1 мл.
    4. Перелейте объем объемом 1 мл в стеклянную пробирку для культивирования и поместите в инкубатор для встряхивания при температуре 37 °C, 220 об/мин или температуре, рекомендованной для восстановления бактериального штамма и/или плазмиды (типичный диапазон от 25 °C до 37 °C) и дайте возможность получить плазмидный маркер выбора антибиотика.
  5. После того как клетки восстановились в течение от 30 минут до 1 часа, нанесите аликвоту (100 мкл из 1000 мкл) реакции трансформации на твердую селекционную среду и используйте стерильный разбрасыватель клеток для диспергирования аликвоты по агаровой культуральной пластине. Соберите остальные трансформированные клетки центрифугированием (13 000 × г в течение 1 мин), выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл стерильной среды и положите на твердую отборную среду, как указано выше. Дайте жидкости впитаться в твердые среды в течение 30 минут, переверните тарелки для культивирования. и поместите их в инкубатор на ночь при температуре, рекомендованной для бактериального штамма и/или плазмиды.

4. Скрининг на правильность сборки плазмид

  1. После инкубации (шаг 3.5) извлеките из инкубатора культуральные планшеты и перечислите колонии путем прямого подсчета, если на каждой культуральной пластине имеется несколько изолированных колоний бактерий. Выберите несколько колоний (1-10) для скрининга, чтобы определить, содержат ли они желаемую собранную плазмиду.
    1. Перенесите стерильные питательные среды с добавлением соответствующих антибиотиков в стерильные пробирки для культивирования (стеклянные или пластиковые). Инокулируйте питательную среду, коснувшись 1 колонии стерильной переводной иглой или петлей, и перенесите клетки в питательную среду пробирки с помощью переводной иглы. Поместите пробирки с культуральными культурами в встряхивающий инкубатор и инкубируйте в течение 16-18 часов при температуре, рекомендованной для штамма бактерии и/или плазмиды (типичный диапазон от 25 °C до 37 °C).
  2. На следующий день выделите плазмидную ДНК из бактериальных культур методом щелочного лизиса6 или с помощью коммерчески доступного набора для выделения плазмид в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Определите, правильно ли собраны плазмиды.
    1. Количественное определение концентрации ДНК выделенных плазмид с помощью спектрофотометрии или оценки геля.
    2. Используйте аликвоту (50-150 нг) плазмидной ДНК для диагностической реакции рестрикционного переваривания (конечный объем 10 мкл). Выбирайте ферменты рестрикции в зависимости от того, где они, как ожидается, будут расщеплять собранную плазмидную ДНК.
      Примечание: Мы рекомендуем две отдельные реакции: (1) обработку плазмидной ДНК ферментом рестрикции, который, как ожидается, расщепляет плазмиду в одном месте, и (2) обработку плазмидной ДНК двумя ферментами рестрикции, которые, как ожидается, иссекут весь или часть вставленного фрагмента ДНК. Ферменты рестрикции имеются в продаже и должны использоваться в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Как только реакция фермента рестрикции завершена, соедините с загрузочным красителем (до концентрации 1x), загрузите всю смесь в агарозный гель и разделите фрагменты ДНК с помощью электрофореза21 агарозного геля. Используйте УФ- или светодиодный трансиллюминатор для визуализации фрагментов ДНК, которые мигрировали в агарозном геле. Сравните ограниченные фрагменты ДНК с лестницей молекулярной массы, чтобы определить, являются ли они ожидаемой молекулярной массой (рис. 4). Обратите внимание на плазмиды с ожидаемыми паттернами рестрикции ферментов (называемые положительными клонами); Выбросьте пробирки, содержащие плазмиды, которые не имеют ожидаемого характера рестрикции (называемые отрицательными клонами).
  4. Чтобы убедиться, что положительные клоны имеют ожидаемую последовательность нуклеотидов, отправьте аликвоту положительных плазмидных клонов на секвенирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется секвенирование всей плазмиды (например, секвенирование нанопор).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой рукописи, в качестве примера использования IVA, мы следовали предусмотренному нами рабочему процессу IVA для повторного клонирования открытой рамки считывания mCherry в сайт множественного клонирования плазмиды pSU19 для создания плазмиды, идентичной pSU19mCherry (рис. 3)17. Праймеры, подходящие для ВВА, были разработаны на основе этапов протокола 1.1 и 1.2. Затем с помощью набора для выделения pSU19 и pSU18mCherry использовали набор для выделения плазмид, кото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важным этапом для успешного клонирования IVA является разработка фрагмента ДНК и праймера. Эффективность IVA значительно повышается, когда гомологичные фрагменты имеют длину не менее 15.о. при температуре плавления примерно 47-52 °C. Опубликовано подробное исследование, посвященное оптимизации дизайна фрагментов IVA16. Еще одним важным шагом для достижения высокой эффективности клонирования является использование как можно меньшего количества матричной Д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

HGB финансируется за счет стипендий для выпускников Канады - магистерской программы от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и докторской премии декана (Университет Саскачевана). Эта работа была поддержана грантом NSERC Discovery Grant (RGPIN-2021-03066), стартовыми фондами (для JLT) от Университета Саскачевана и Канадским фондом инноваций John R. Evans Leaders Fund (грант No 42269 для JLT). Авторы благодарят г-на Эрика Тумбса за предоставленную фотографию количественного определения ДНК методом УФ-спектроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015-R500Маркер молекулярной массы
ДНК AccuReady M Single Channel 0.5-10 µ LBulldog BioBPP020Пипетки для переноса жидкости
AccuReady M Одноканальный набор пипетокBulldog BioBPK100Пипетки для переноса жидкости
AgarBioShop CanadaAGR003.1Затвердевающий агент для питательной среды
AgaroseBiobasicD0012Make agarose гели для электрофореза ДНК
Biometra TOne Analytikjena846-2-070-301Термоамплификатор
Колпачки для стеклянных пробирокдля культуры Fisher Scientific14-957-91Многоразовые колпачки для стеклянных пробирок для культуры
ДНК праймерыIntegrated DNA TechnologiesN/AСвязывание и амплификация матричной ДНК в реакции ПЦР
DpnI New England BiolabsR0176SРасщепление метилированной матрицы ДНК после ПЦР-амплификации
EcoRINew England BiolabsR3101LРестрикционный фермент, поставляется с подходящим буфером
Eppendorf микропробирки 1,5 млSarstedt72.690.300микропробирки, 1,5 мл, коническое основание, полипропилен, прикрепленная плоская крышка, формованные градуировки и матовое пространство для письма
Бромид этидия FisherScientificAAL0748203Агент визуализации/интеркалирования ДНК, токсичный
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep KitBiobasicBS614Изолировать плазмидную ДНК из ночных бактериальных культур
GelDoc Go-Gel системаBio-Rad12009077Imaging DNA гели
Стеклянные пробирки для культурыFisher Scientific14-925EСтеклянные пробирки
для культуры myGel  Мини система электрофорезаSigma-AldrichZ742288Система для гель-электрофореза
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-WОпределение концентрации ДНК
ПЦР Очистка для секвенирования ДНКБиобазаBT5100Purify ПЦР продукты 
Чашка ПетриSarstedt82.1473.011Чашка Петри 92 x 16 мм, PS, прозрачная, с вентиляционными кулачками
Наконечник для пипетки, 1000 &; LSarstedt70.305Наконечники для пипеток на 100-1000 & микро L
Наконечник для пипетки, 2,5 & микро; LSarstedt70.3010.265Наконечники для дозаторов до 2,5 &; L
Наконечник для пипетки, 20 & микро; LSarstedt70.3020.200Наконечники для дозаторов до 20 & микро L
Наконечник для пипетки, 200 &; LSarstedt70.3030.020Наконечники для пипеток для 1-200 &; L
Соль (NaCl)Fisher ScientificS271-10Компонент бактериальной питательной среды (10 г/л)
Одиночные 0,2 мл ПЦР-пробирки с плоской крышкойFroggaBioTF-1000ПЦР-пробирки
Триптон (бактериологический)BioShop CanadaTRP402.5Компонент бактериальной питательной среды (10 г/л)
VeriFi ДНК-полимеразаПЦР BiosystemsPB10.42-01Полимераза высокой точности, ПЦР-буфер, содержащий Mg2+ и dNTPs поставляется с ферментом
/em>I New England BiolabsR0145SRestriction enzyme, поставляется с соответствующим буферным
экстрактом дрожжейBioShop CanadaYEX401.205Компонент бактериальной среды для роста (5 г/л)
рестрикции purchase

Ссылки

  1. Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).
  2. Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly. Sci Rep. 6, 27459(2016).
  3. Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).
  4. Avilan, L. Assembling multiple fragments: the Gibson assembly. Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).
  5. Stukenberg, D., et al. The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).
  6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  7. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate cloning. Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).
  8. Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).
  9. Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus. Plasmid. 76, 40-46 (2014).
  10. Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).
  11. Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).
  12. Sung, W. L., Zahab, D. M. Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids. DNA. 6 (4), 373-379 (1987).
  13. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  14. Jones, D. H., Howard, B. H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction. Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).
  15. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).
  16. Chen, F., et al. Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly. BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).
  17. Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae. J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).
  18. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).
  19. Wallace, R. B., et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).
  20. Bzymek, M., Lovett, S. T. Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Fürste, J. P., et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene. 48 (1), 119-131 (1986).
  25. Bäumler, A. J., et al. Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).
  26. Godiska, R., et al. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).
  27. Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning. J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Молекулярное клонированиесборка фрагментов ДНКEscherichia coliПЦР-амплификацияэлектрофорез в агарозном гелетрансформация методом теплового шокаантибиотикоселекциярестрикционное расщепление
Использование сборки in vivo для высокоэффективного конструирования плазмид
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.