Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прогнозирование значимости антител к эритроцитам с помощью анализа моноцитов-макрофагов

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67877

⸱

7 февраля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services, Keenan Research Centre, 3Polytech Clermont, 4Department of Medicine, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали усовершенствования и обновленные методы для существующего анализа моноцитарного монослоя (MMA), в котором макрофаги используются для лучшего прогнозирования клинической значимости аллоантител к эритроцитам в трансфузионной медицине и иммунологии. Этот анализ называется моноцитарно-макрофагальным анализом (M-MA).

Аннотация

Макрофаги, полученные из моноцитов в костном мозге, представляют собой большие клетки врожденного иммунитета, которые играют важную роль в очистке от мертвых клеток, мусора, опухолевых клеток и чужеродных патогенов. Фагоцитарная способность моноцитов по сравнению с макрофагами — концепция, которая не совсем понятна. Здесь мы стремимся изучить разницу в фагоцитозе моноцитов по сравнению с макрофагами, в частности макрофагами M1/M2, против различных опсонизированных эритроцитов с использованием модифицированной и обновленной версии установленного анализа моноцитарного монослоя (MMA). Мононуклеарные клетки периферической крови (ПМЦ) были выделены из охристых оболочек донора. С использованием очищенных моноцитов путем культивирования in vitro и поляризации были получены воспалительные М1 и противовоспалительные макрофаги М2. Клетки M1/M2 были собраны и использованы в MMA-подобном анализе, который мы называем M-MA, для расшифровки клинически значимого фагоцитоза различных антител к эритроцитам. Фагоцитарный индекс (ИП) > 5 был признан клинически значимым фагоцитозом с использованием моноцитов. Фагоцитарный индекс (ИП) > 12 был признан клинически значимым фагоцитозом с использованием макрофагов М1/М2. Макрофаги М2 демонстрируют повышенную способность к фагоцитозе опсонизированных эритроцитов по сравнению с моноцитами и М1. Одно и то же слабое антитело (анти-S) дает значительный фагоцитоз только с макрофагами M2 (PI=43), но не с M1s (PI=2) или моноцитами (PI=0), и это было неоднократно продемонстрировано с использованием различных антител. Использование М2-макрофагов вместо моноцитов может обеспечить более точные результаты, поскольку эти клетки являются более фагоцитарными, что придает дополнительную клиническую значимость анализу. Дальнейшие исследования с различными антителами к эритроцитам, включая валидацию анализа моноцитарно-макрофагов (M-MA) с антителами, имеющими известное клиническое значение, могут показать, что M-MA более полезен для прогнозирования клинически значимых аллоантител к эритроцитам и трансфузионных реакций. Этот метод позволит продвинуть вперед область трансфузионной медицины и иммунологии.

Введение

Прогнозирование трансфузионных реакций остается серьезной проблемой в области трансфузионной медицины. В течение последних 4 десятилетий моноцитарно-монослойный анализ (MMA), впервые предложенный Тонгом и Бранчем 1,2, служил ценным клеточным анализом in vitro для прогнозирования клинического исхода гемолиза у пациентов с переливанием крови1. Действительно, этот анализ сыграл важную роль в различении клинически значимых и незначимых антител к эритроцитам (эритроцитам)2. В то время как моноциты традиционно являются стандартными лейкоцитами, используемыми в этом анализе, наше исследование направлено на изучение потенциальных преимуществ использования макрофагов, полученных из моноцитов, в качестве альтернативы. Эти клетки могут повысить способность анализов оценивать клиническую значимость аллоантител к эритроцитам.

В истории ММА моноциты, которые являются предшественниками макрофагов, иммунных клеток, ответственных за клиренс и разрушение эритроцитов во время неблагоприятной реакции на переливание, вводятся in vitro вместе с эритроцитами и антителами 1,2,3,4,5,6,7 . Затем фагоцитоз оценивается визуально путем подсчета фагоцитированных эритроцитов в моноцитах. Фагоцитарный индекс (ПИ) < 5 фагоцитированных эритроцитов на 100 подсчитанных моноцитов указывает на то, что у пациента снижен риск развития неблагоприятной трансфузионной реакции, а антитело считается клинически незначимым 4,5,6,7. Предварительные эксперименты показывают, что использование моноцитов, полученных из периферической крови, может быть не идеальным для определения клинической значимости, поскольку они имеют более низкую фагоцитарную способность, чем активированные моноциты и некоторые макрофаги.

Моноциты представляют собой подмножество клеток, обнаруженных в крови, селезенке и костном мозге и составляющих 10% от общего количества лейкоцитов у человека8. Эти клетки обычно циркулируют в течение 1-2 дней, прежде чем их рекрутируют различные ткани, где они дифференцируются в макрофаги. Обычно это происходит во время кроветворения, при котором костный мозг вырабатывает моноциты, которые высвобождаются в кровоток и превращаются в тканевые макрофаги, которые находятся в селезенке и печени2. Макрофаги, известные как первая линия защиты от чужеродных патогенов, представляют собой крупные фагоцитарные мононуклеарные клетки, которые играют роль в адаптивном и врожденном иммунитете. Среди запутанных и сложных ролей иммунной системы понимание и характеристика фенотипов макрофагов представляет собой сложную задачу, которую еще предстоит полностью понять. За последние два десятилетия понятие поляризации макрофагов получило все большее признание, а в недавних исследованиях используется секвенирование РНК отдельных клеток для определения спектра, в котором эти макрофаги существуют.

Классически активированные М1 и М1-подобные макрофаги возникают в воспалительных средах, где преобладают Toll-подобные рецепторы (TLR)10. Эти клетки могут быть вовлечены в аутоиммунные заболевания и атеросклероз и присутствовать поверхностными маркерами, такими как MHC-II, CD80 и CD8611,12. Противовоспалительные М2 и М2-подобные макрофаги обнаруживаются в средах с преобладанием Th2-ответов, отсутствием экспрессии CD80 и присутствующими поверхностными маркерами, такими как CD209 и CD20611,12. Макрофаги M1/M2 могут культивироваться in vitro из мононуклеарных клеток периферической крови, при этом липополисахарид (ЛПС) и цитокины, такие как GM-CSF и IFNγ (M1) и M-CSF и IL-4 (M2), стимулируют их поляризацию10,12.

Данная рукопись и связанные с ней исследования направлены на то, чтобы продемонстрировать, что макрофаги M2 демонстрируют повышенную чувствительность к фагоцитозу по сравнению с макрофагами и моноцитами M1. Исследование фагоцитарной активности М1/М2 макрофагов по сравнению с моноцитами в контексте аллоантител к эритроцитам и трансфузионной медицины является областью, которую еще предстоит изучить. В данной статье мы описываем текущую работу по получению макрофагов M1/M2 и сравниваем классический моноцитарный монослойный анализ (MMA) с новым моноцитарно-макрофагальным анализом, используя аббревиатуру M-MA, чтобы отличить этот макрофагальный анализ от моноцитарного анализа, чтобы повысить прогностическую ценность анализов на фагоцитоз in vitro .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями по проведению этических исследований с участием человека. Этическое одобрение было предоставлено Канадским советом по этике исследований службы крови (REB), одобрение CBSREB # 2023.008. Все этапы этого протокола должны выполняться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

1. Изоляция МПМП

  1. Получить цельную человеческую кровь от донора в пробирке ACD. Храните кровь при комнатной температуре (18–22 °C) в течение 36 часов.
  2. Переложите пробирки с ACD для цельной крови в центрифужные пробирки объемом 50 мл (одна пробирка объемом 50 мл на каждые две пробирки с ACD). Добавьте полную среду RPMI-1640 при комнатной температуре до конечного объема 35 мл.
  3. Добавьте 15 мл среды с градиентом плотности комнатной температуры в новую 50 мл пробирки. Тщательно выложите разбавленную цельную кровь поверх среды с градиентом плотности, сводя к минимуму перемешивание на границе раздела для оптимального отделения крови.
  4. Центрифугируйте слоистую смесь при давлении 700 x g в течение 30 мин при выключенном тормозе. Центрифугирование с градиентом плотности разделяет смесь на следующие слои сверху вниз: плазма, оболочка Баффи (содержащая PBMC), материал градиента плотности, гранулоциты и эритроциты.
  5. Отсадите и отбросьте большую часть верхнего слоя (плазмы). С помощью переводной пипетки осторожно извлеките слой охристого покрытия (PBMCs), избегая добавления дополнительного материала. Переложите извлеченные PBMC в новую пробирку объемом 50 мл.
  6. Простирайте изолированный слой баффи 1x раствором pH 7,4 PBS в течение 10 минут при 350 x g при включенном полном тормозе.
  7. Используйте сетчатый фильтр 70 мкМ для удаления мусора или нежелательного материала из PBMC перед их переносом в коническую пробирку объемом 15 мл. Промыть 2 раза раствором pH 7,4 PBS в течение 10 минут при 350 x g при включенном полном тормозе.
  8. Необязательно: Лизируйте все эритроциты, перенесенные с помощью буфера для лизиса ACK. Добавьте 5-10 мл буфера для лизиса ACK, в зависимости от размера гранул, и инкубируйте при комнатной температуре до 3 минут. После инкубации долейте pH 7,4 PBS и центрифугируйте в течение 10 минут при 350 x g при полном включении тормозов и промойте 1 раз. Выполните этот шаг, если количество эритроцитов слишком велико.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда лучше избегать использования ACK для достижения лучших результатов. В качестве альтернативы можно использовать воду для уничтожения нефагоцитированных эритроцитов путем инкубации с водой в течение не более 15 секунд, а затем немедленно добавить 1X PBS для промывки.
  9. Восстановите гранулу PBMC в 2-3 мл (используйте 0,5 мл на исходную пробирку ACD) полной среды RPMI-1640. Подсчитайте ПМК гемоцитометром после приготовления смеси 1:1 с трипановым синим. Подсчитываются только клетки, не окрашенные трипановым синим. Восстановите PBMC до 2 x 106 клеток/мл в полной среде RPMI-1640.

2. Культивирование макрофагов М1/М2

  1. День 0 посева моноцитов
    1. Приготовьте колбу для клеточных культур объемом 25 мл для каждой популяции макрофагов. Добавьте в каждую по 5 мл поли-D-лизина (50 мг/500 мл) и оставьте в вытяжке не менее чем на 1 ч. Промойте колбу PBS, чтобы избавиться от остатков поли-D-лизина.
    2. Изолируйте PBMC из шерсти Баффи или образцов пациента, как обычно (см. шаг 1). После получения гранулы PBMCs ресуспендировать ее в 10 мл предварительно подогретой полной среды RPMI-1640.
    3. Определите количество клеток и начните выделение моноцитов с помощью набора для выделения моноцитов. Для запуска комплекта используйте не менее 50 х 106 ячеек.
    4. Ресуспендируйте клетки в соотношении 50 x 106 клеток/мл в изоляционной среде. В зависимости от полученного номера клеток используйте фиолетовый (0,25-2 мл) или серый (0,5-8,5 мл) магнит, рекомендованный в наборе для выделения моноцитов.
    5. Следуйте инструкциям к набору и добавьте образец в необходимую пропиленовую пробирку (5 мл или 14 мл). Добавьте в образец обогащенный коктейль в концентрации 50 мкл/мл образца.
    6. Перемешайте образец с помощью пипеток вверх и вниз или вихревым способом, а затем инкубируйте при температуре 2-8 °C в течение 10 минут в ведре со льдом. Между тем, вихревые магнитные частицы в течение 30 с. После инкубации добавьте в образец магнитные частицы: 100 μл/мл образца.
    7. Пипетируйте вверх и вниз или вихревыми движениями, чтобы перемешать образец, а затем инкубируйте при температуре 2-8 °C в течение 5 минут. Долейте изолирующую среду до 2,5 мл или 10 мл соответственно с помощью градуированной пипетки. Делайте пипеткой вверх и вниз 2-3 раза, чтобы перемешать.
    8. Поместите трубку (без крышки) в магнит и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2,5 минут. Возьмите в руки магнит и одним непрерывным движением переверните магнит и трубку, заливая клеточную суспензию в новую пробирку, 5 мл или 14 мл.
    9. Ресуспендируйте клетки в среде RPMI-1640 и подсчитайте их. Сделайте этот шаг как можно скорее. Засейте между 1 x 106 – 5 x 106 моноцитов в каждую колбу объемом 25 мл, предварительно покрытую поли-D-лизином. При необходимости доведите объем до 5 мл с помощью RPMI-1640.
    10. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2, не менее 2 часов. Тем временем приготовьте среды для дифференцировки М1 и М2. Подготовьтесь достаточно для пополнения в День 0 (10 мл) и День 4 (2 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для дифференцировки М1: RPMI-1640 + 2,5 нг/мл GM-CSF; Среда для дифференцировки М2: RPMI-1640 + 50 нг/мл M-CSF.
    11. По истечении времени инкубации вымойте каждую колбу 1x с PBS и 2x с полным RPMI-1640. Добавьте 10 мл среды для дифференцировки в каждую колбу в соответствии с типом клеток для дифференцировки.
    12. Дайте клеткам дифференцироваться в течение 6 дней в инкубаторе при 37 °C, 5%CO2. Из-за испарения долейте дифференцировочную среду на 4-й день.
  2. День 4 - Пополнение счета
    1. Добавьте по 2 мл каждой среды для дифференцировки в соответствующую колбу. Добавляйте среду прямо в колбу.
  3. День 6 - Поляризация макрофагов
    1. Приготовьте поляризационные среды М1 и М2. Для поляризационной среды М1 приготовьте 5 мл поляризационной среды М1 для добавления в соответствующую колбу. Конечные концентрации должны составлять 50 нг/мл ИФНγ, 10 нг/мл ЛПС и 2,5 нг/мл GM-CSF в RPMI-1640. В колбе в конце будет 15 мл общего объема (10 мл уже в + 5 мл будет добавлено), делайте расчеты соответственно.
    2. Для поляризационной среды М2 приготовьте 5 мл поляризационной среды М2 для добавления в соответствующую колбу. Конечные концентрации должны составлять 20 нг/мл IL-4 и 50 нг/мл M-CSF в RPMI-1640. Учтите, что в колбе в конце будет 15 мл от общего объема (10 мл уже в + 5 мл нужно добавить); Выполняйте расчеты соответственно.
    3. Добавьте в каждую колбу по 5 мл поляризационной среды М1 или М2. Дайте макрофагам поляризоваться не менее 2 суток и не более 4 суток в инкубаторе при 37 °С, 5%СО2.
  4. День 8 - Забор и проточная цитометрия
    1. Перед забором макрофагов М1 или М2 соберите надосадочную жидкость в пробирки объемом 1,5 мл для дальнейшего использования (при необходимости). Добавьте в колбу 1 мл раствора для отделения клеток и оставьте в инкубаторе при температуре 37 °С, 5%СО2 на 5 минут.
    2. Чтобы остановить реакцию, добавьте 3 мл полного RPMI-1640. Соберите медиа в пробирку объемом 15 мл. Добавьте в колбу 3 мл полного RPMI-1640 и с помощью скребка для клеток отсоедините ячейки от дна колбы.
    3. Соберите клетки в пробирку объемом 15 мл. Поместите колбу под микроскоп в угол 10x и наблюдайте за ячейками, чтобы убедиться, что на дне колбы больше нет клеток.
    4. Промойте клетки в PBS 2x. Суспендируйте их в полной комплектации RPMI-1640 и посчитайте с помощью гемоцитометра.
    5. Чтобы проанализировать качество и количество макрофагов M1/M2, проведите анализ проточной цитометрии. Используйте 0,5 x 106 клеток на пробирку и окрашивайте следующим образом: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Стратегия стробирования, используемая в данном анализе: #1 Прямое рассеяние (FSC-A) против бокового рассеяния (SSC-A) Точечная диаграмма, #2 Высота прямого рассеяния (FSC-H) против области прямого рассеяния (FSC-A) для дискриминации дублетов, #3 Боковое рассеяние (SSC-A) против DAPI-A Точечная диаграмма для различения живых и мертвых клеток, #4 Боковое рассеивание (SSC-A) против однопараметрической точечной диаграммы или гистограммы (т.е. SSC-A против FITC-A), #5 двухпараметрическая точечная диаграмма (т.е. FITC-A против APC-A).

3. ММА с использованием макрофагов М1/М2

  1. После получения макрофагов М1/М2 подсчитайте их с помощью гемоцитометра в соотношении окрашивания 1:1 трипановым синим. Восстановите M1/M2 до 1 x 106 клеток/мл в полной среде RPMI-1640.
  2. Засейте 400 мкл (400 000 клеток) клеточной суспензии с помощью микропипетки в каждую лунку предметного стекла с 8-луночной камерой и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение не менее 1,5 ч в полностью увлажненном инкубаторе для культуры тканей. Каждый тест должен проводиться с использованием как минимум тройных лунок.
  3. Опсонизация исследуемых образцов и эритроцитов RhD+ R2R2
    1. Промывайте эритроциты RhD+ R2R2 при pH 7,4 PBS 3 раза, центрифугируя при 350 x g в течение 5 минут каждый раз. Мы предпочитаем использовать R2R2 RhD+ эритроциты в качестве контроля из-за более высокой плотности D-антигена, но любые RhD+ эритроциты могут быть заменены. Опсонизируйте исследуемый образец эритроцитов (например, пациента или донора) с использованием антител, представляющих интерес. Используйте 5% суспензию эритроцитов, добавив 15 мкл упакованных эритроцитов к 300 мкл смеси антител. Опсонизируйте эритроциты R2R2 с помощью Anti-D, добавив 15 мкл упакованных R2R2 эритроцитов к 300 мкл смеси антител Anti-D (100 нг/мл).
    2. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2 в течение 1 ч. Проводите периодическое восстановление эритроцитов, осевших на дне (например, вихрь каждые 15 минут). Промойте отравленные эритроциты pH 7,4 PBS 3 раза центрифугированием при 350 x g в течение 5 минут каждый раз.
    3. Чтобы проверить опсонизацию эритроцитов, проведите непрямой тест на антиглобулины (IAT). Добавьте вторичное опсонизирующее антитело против человека к первичному опсонизирующему антителу. Гемагглютинация или слипание эритроцитов может наблюдаться в течение 30 с и интерпретироваться как успешная опсонизация13.
    4. Восстановите промытые опсонизированные эритроциты RhD+ R2R2 в 1,25% (v/v) с помощью полной среды RPMI-1640. Добавьте 1 200 мкл среды к 15 мкл эритроцитов для достижения 1,25% (v/v) на лунку.
  4. Фагоцитоз, опосредованный Fc-рецептором
    1. После 1,5-часовой инкубации макрофагов М1/М2, чтобы позволить этим клеткам прилипнуть к лункам предметного стекла камеры, аспирировать надосадочную среду и отбросить их, следуя щадящей технике, следя за тем, чтобы наконечник пипетки касался только угла лунок. Макрофаги должны быть приклеены к лункам. Не касайтесь середины лунок наконечником пипетки.
    2. Аккуратно промойте лунки 1x с pH 7,4 PBS. Добавьте 400 мкл соответствующей 1,25% (v/v) смеси опсонизированных эритроцитов в каждую лунку трипликата. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2 в течение 2 ч без помех.
    3. После инкубации приготовьте два стакана с pH 100 мл pH 7,4 PBS в каждом.
    4. Снимите 8-луночные камеры с помощью адаптеров производителя. Промокните излишки на бумажном полотенце, сохраняя слайды влажными.
    5. Погрузите предметное стекло в стакан с отброшенными надосадочными веществами и промойте его, медленно двигая вперед и назад (20-30 движений), чтобы удалить любые оставшиеся нефагоцитированные эритроциты.
    6. Затем погрузите горку во второй стакан и медленно промывайте еще 20-30 движений. Снимите предметное стекло с PBS и промокните излишки на бумажном полотенце. Избегайте прикосновения к передней части камер. На этом этапе опустите предметное стекло в воду на 1 минуту, чтобы удалить все прилипшие, нефагоцитированные эритроциты, но это может не понадобиться, если вы можете отличить фагоцитированные эритроциты от адгезивных. Высушите на воздухе.
    7. Погрузите предметные стекла в 100% метанол на 45 с, чтобы зафиксировать их, а затем высушите на воздухе. Установите предметное стекло с помощью подготовленного нами монтажного носителя и добавьте покровные стекла (24 x 75 мм). Дайте ему высохнуть в течение ночи перед количественным подсчетом.
  5. Количественная оценка фагоцитоза
    1. Используя фазово-контрастный микроскоп, объектив с 40-кратным увеличением и ручной счетчик клеток, количественно оцените фагоцитоз.
    2. С помощью двух ручных счетчиков клеток, по одному в каждой руке, подсчитывают фагоцитированные эритроциты одним счетчиком и общее количество моноцитов/макрофагов другим. Подсчитайте 300 моноцитов/макрофагов в лунке.
    3. Рассчитайте средний фагоцитарный индекс (PI) для каждого теста (по трипликациям), разделив количество фагоцитированных эритроцитов на общее количество подсчитанных моноцитов и умножив на 100. Выразите данные в виде среднего PI ± стандартной погрешности среднего значения (SEM).
      PI = (фагоцитированные эритроциты / 300 макрофагов) x 100

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты, представленные на рисунке 1 , согласуются с литературными данными и указывают на успешную поляризацию макрофагов из их состояния M0 в последующее состояние M1/M2. Макрофаги М1 и М2 культивировали в течение 8 дней (6 дней с факторами роста и 2 дня поляризации), а также тестировали анти-D или анти-k опсонизированные эритроциты (рис. 2). Макрофаги М2 демонстрируют высокий фагоцитарный индекс по сравнению с М1 с эритроцитами, опсонизиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для обеспечения успеха метода необходимо придерживаться следующих важнейших этапов: 1) успешная поляризация M1/M2, 2) генерация макрофагального слоя и контроль RhD+, 3) количественная оценка фагоцитарного индекса. В то время как наши методы указывают на использование изолированных моноцитов для клеточной культуры, можно использовать PBMC, но мы рекомендуем использовать очищенные моноциты. Известно, что PBMC содержат различные типы клеток, при этом эти клетки секретируют множество различн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается и финансируется Канадским центром инноваций службы крови в Торонто, Онтарио. Исследования проводятся в Исследовательском центре биомедицинских наук Кинана при больнице Святого Михаила в Торонто, Онтарио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1X PBS, pH 7,4, без Ca2+/Mg2+Wisent Bioproducts 311-425-CLХранить при температуре 4 градуса или комнатной...
AccutaseTM 7920Раствор для отслоения клеток
ACK Lysis Buffer Технологии СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 07850, 07800Хранить при 4 градусах
Античеловеческий глобулинНОВАКЛОН, Иммунокор. Н/АNovaclone Anti-IgG для тестирования IAT 
Анти-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)Saol Therapeutics 1003092Любого коммерческого источника резус-иммуноглобина будет достаточно...
Скребок для клетокUofT Medstore83.395отделение клеток 
Фильтр для ячеек 70 мкМ нейлоновыйFalcon352350фильтр ячеек 
Камерный затвор нунк. Lab-TekTM II с крышкой, RS Glass Slide Sterile;Thermo Fisher Scientific 154534камерные горки для ММА 
Coverslips VWR48393-08124 x 50 мм
Cytiva Ficoll Paque Plus, плотность 1,077 г/лThermo Fisher Scientific 17-1440-03Сепепация PBMCS из цельной крови; градиентная среда
плотности Элванол Монтажная средан/д н/дДульбекко' s PBS (D-PBS) без Ca2+/Mg2+, 15% (v/v) поливиниловой смолы и 30% (v/v) глицерина.
Свежая цельная кровь (пробирка ACD) или Канадскаяслужбаможет хранить при комнатной температуре до 36 часов 
человеческого рекомбинантного GM-CSF 78015.1Цитокин для поляризации М1 макрофагов
человеческого рекомбинантного ИФН-гаммаSTEMCELL Technologies 78020Цитокин для поляризации макрофагов M1
Человеческий рекомбинантный IL-4STEMCELL Technologies 78045.1Цитокин для поляризации М2 макрофагов
Рекомбинантные M-CSF стволовыеклетки человека Технологии 78057.1Цитокин для поляризации М2 макрофагов
ID-CellStabBio-Rad005650 05740Раствор для хранения/стабилизации эритроцитов 
Изолирующая среда Н/ДН/ДПБС Са2+ и Mg2+ свободный + FBS 2% + 1mM ЭДТА
Липополисаарацид (ЛПС)Сигма ОлдричL3024-5MGЦитокин для поляризации М1 макрофагов
Метанол (100%)Н/Д/ДФиксация слайдов 
Набор для выделения моноцитов STEM-клетки EasySep Human Monocyte Enrichment Kit без истощения CD16 Технологии СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 19058Выделение моноцитов из
поли-D-изинаUofT Medstore P6407Решение для крепления ячеек 
Rh(D) положительный R2R2 RBCsКанадская служба кровиН/ДТакже коммерчески доступны
RPMI-1640Wisent Bioproducts 350-000-CLс добавлением 10% термоинактивированного FBS, 1 мМ добавки GlutaMAX, 1 мМ HEPES и 1% пенициллина/стрептомицина. Хранить при температуре 4 градуса.
Решение Трипан Блю Thermo Fisher Scientific 15250061Решение для подсчета клеток 
Технологии стволовых клеток крови Технологии стволовых клеток Н PBMC;

Ссылки

  1. Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a monocyte monolayer assay to evaluate Fcγ receptor-mediated phagocytosis. J Vis Exp. (119), e55039(2017).
  2. Tong, T. N., Cen, S., Branch, D. R. The monocyte monolayer assay: Past, present and future. Transfus Med Rev. 33 (1), 24-28 (2019).
  3. Frias Boligan, K., Sandhu, G., Branch, D. R. Methods to evaluate the potential clinical significance of antibodies to red blood cells. Curr Protoc. 2 (8), e504(2022).
  4. Lemay, A. S., et al. The first case of severe acute hemolytic transfusion reaction caused by anti-Sc2. Transfusion. 58 (11), 2506-2512 (2018).
  5. Tong, T. N., et al. The utility of a monocyte monolayer assay in the assessment of intravenous immunoglobulin-associated hemolysis. Transfusion. 60 (12), 3010-3018 (2020).
  6. Srivastava, K., et al. SCAR: the high-prevalence antigen 013.008 in the Scianna blood group system. Transfusion. 61 (1), 246-254 (2021).
  7. Branch, D. R., et al. Potentially clinically significant anti-Dib identified by monocyte monolayer assay before transfusion. Transfusion. 61 (1), 331-332 (2021).
  8. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, 514(2014).
  9. Mills, C. M1 and M2 macrophages: Oracles of health and disease. Crit Rev Immunol. 32 (6), 463-488 (2012).
  10. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. Int J Mol Sci. 19 (6), 1801(2018).
  11. Bertani, F. R., et al. Classification of M1/M2-polarized human macrophages by label-free hyperspectral reflectance confocal microscopy and multivariate analysis. Sci Rep. 7, 8965(2017).
  12. Murray, J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  13. Cohn, C., Delaney, M., Johnson, S. T., Katz, L. M., Schwartz, J. Technical Manual. , 21st Ed, American Association for the Advancement of Blood and Biotherapeutics. Maryland, USA. (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

M1M2
Прогнозирование значимости антител к эритроцитам с помощью анализа моноцитов-макрофагов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.