Методическая статья

Анализ субпопуляций тромбоцитов с помощью многоцветной проточной цитометрии

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 июня 2025 г.

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многоцветная проточная цитометрия для тромбоцитов может идентифицировать новые подтипы тромбоцитов в классических субпопуляциях тромбоцитов, такие как покои, агрегаторные, прокоагулянтные и апоптотические тромбоциты. Это позволяет сравнивать различные модели субпопуляций, индуцированные различными агонистами тромбоцитов. Здесь подробно описана процедура создания панели многоцветной проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоциты, или тромбоциты, представляют собой небольшие ядерные клетки крови, которые играют решающую роль в гемостазе и тромбозе. Дефекты функции тромбоцитов могут вызывать кровотечения или тромботические явления у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Поэтому важно фенотипически характеризовать тромбоциты, чтобы иметь возможность отнести субпопуляции тромбоцитов к функции тромбоцитов. Стимуляция тромбоцитов человека агонистами и активаторами тромбоцитов вызывает морфологические и физиологические изменения тромбоцитов, сопровождающиеся изменениями популяции поверхностных рецепторов. Это приводит к функционально разнообразным субпопуляциям тромбоцитов. Классически определенные субпопуляции тромбоцитов — это покои, агрегаторные, прокоагулянтные и апоптотические тромбоциты. Для характеристики влияния агонистов на подтипы тромбоцитов нами был проведен анализ с помощью многоцветной проточной цитометрии, состоящей из 10 различных антител и красителей (анти-CD62P, анти-CD63, анти-CD61, анти-CD41, анти-CD42b, анти-интегринαIIbβ3 (клон: PAC-1), анти-CXCR4, анти-ACKR3, аннексин V, зомби NIR). Изолированные человеческие тромбоциты инкубировали с агонистами тромбоцитов и окрашивали специфическими флуорофор-конъюгированными антителами и красителями. После этого их измеряли с помощью проточной цитометрии. Это позволяет нам определить подтипы, специфичные для агонистов в рамках классических четырех субпопуляций. В заключение следует отметить, что комбинация маркеров активации (анти-CD62P, анти-CD63, анти-интегринαIIbβ3 (клон: PAC-1)), маркеров воспаления (анти-CXCR4, анти-ACKR3) и маркеров апоптоза (аннексин V, Зомби NIR), составляющих описанную в данной рукописи 10-цветную панель проточной цитометрии, открывает возможность определения других подтипов тромбоцитов, которые могут быть связаны с определенной функцией тромбоцитов. Этот метод может быть применен в фундаментальных исследованиях функции и физиологии тромбоцитов, а также при определении новых подтипов тромбоцитов в моделях заболеваний и исследованиях пациентов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоциты, также называемые тромбоцитами, представляют собой небольшие безъядерные клетки крови, необходимые для гемостаза и развития тромбоза 1,2. Они могут активироваться различными агонистами тромбоцитов. Классическими, физиологическими агонистами тромбоцитов являются аденозиндифосфат (АДФ), который связывается с рецепторами P2Y12 и P2Y1, тромбин, который активирует тромбоциты через рецепторы PAR1 и PAR4, и коллаген, который взаимодействует с гликопротеином VI. В экспериментах in vitro коллаген может быть заменен коллагеновым пептидом (CRP-XL)3,4. Недавно было показано, что гемин индуцирует активацию тромбоцитов путем взаимодействия лектиноподобного рецептора С-типа (CLEC-2) и гликопротеина VI (GPVI), что делает гемин новым эндогенным активатором/агонистом тромбоцитов 5,6. Несколько патологических ситуаций могут привести к гемолизу, в результате чего происходит высвобождение свободного железосодержащего гемина. Все эти агонисты тромбоцитов изменяют экспрессию поверхностных рецепторов на тромбоцитах. Изменение поверхностных рецепторов и плазматической мембраны зависит от силы и концентрации агониста тромбоцитов 7,8,9. Таким образом, важно фенотипически охарактеризовать тромбоциты, чтобы иметь возможность соотнести субпопуляции тромбоцитов с функцией тромбоцитов.

Многомерные методы, такие как проточная цитометрия, показали, что тромбоциты образуют субпопуляции с различными функциями. Субпопуляции можно классифицировать по различным поверхностным маркерам. В литературе хорошо известно, что присутствуют две различные субпопуляции тромбоцитов: прокоагулянт, который характеризуется экстернализацией фосфатидилсерина, и агрегационный фенотип, который активирует интегринα IIIbβ3. В дополнение к классическим маркерам активации, флуоресцентные красители, такие как глутатион-S-арилоксид (GSAO), который обнаруживает функцию митохондрий и окислительный стресс, могут быть использованы для дальнейшей категоризации, например, прокоагулянтные тромбоциты по их метаболическому состоянию10. Это позволяет провести различие между фенотипом11 прокоагулянтных тромбоцитов с баллонированием и формированием переходных пор через митохондриальную проницаемость (MPTP).

Heemskerk et al. показали, анализируя воздействие фосфатидилсерина (ФС) и активность интегринаα IIbβ3, что различные популяции тромбоцитов могут контролировать различные этапы свертывания и чтодля воздействия фосфатидилсерина требуются сильные активаторы, такие как тромбин и коллаген. Кроме того, активация тромбоцитов методом GPVI с коллагеном или специфическим агонистом GPVI конвульксином в первую очередь отвечает за образование адгезивных прокоагулянтных тромбоцитов. Аналогичным образом, арахидоновая кислота, которая приводит к активации тромбоцитов путем производства тромбоксана А2 циклооксигеназой, индуцирует воздействие PS13. Однако арахидоновая кислота, по сравнению с тромбином или коллагеном, является слабым активаторомтромбоцитов14. Van Velzen et al. также оценили поверхностные антигены тромбоцитов (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) и маркеры активации (PAC-1, CD63, CD62P) в двух отдельных измерениях15. Кроме того, ван Вельзен и др. смогли проанализировать кровь пациентов с тромбастенией и сравнили субпопуляции между здоровыми и больными пациентами. Hindle et al. измерили влияние простациклина на субпопуляции тромбоцитов после лечения тромбином и CRP-XL с помощью двух отдельных панелей, состоящих из четырех маркеров каждая (PAC-1, Аннексин V, CD62P, CD42b или CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. В последнее время с помощью многоцветной проточной цитометрии определяют покоящиеся (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Аннексин V-), агрегаторные (CD42b+, PAC1+, CD62P+, Аннексин V-) прокоагулянтные (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Аннексин V+) и апоптотические (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Аннексин V+) субпопуляции тромбоцитов 7,17. Laspa et al. расширили/усовершенствовали подход многоцветной проточной цитометрии путем добавления антител против хемокиновых рецепторов CXCR4 и ACKR318. Исходя из имеющейся литературы, это первая панель 10-цветного проточного цитометра для изолированных тромбоцитов человека, которая позволяет обнаруживать 10 различных антигенов на отдельном тромбоците (уровне одной клетки) в популяции выделенных тромбоцитов человека в одной пробирке. Таким образом, можно одновременно измерять активацию, адгезию и агрегационный потенциал, хемокиновые рецепторы и апоптотический потенциал одной клетки, чтобы еще больше различать существующую субпопуляцию. Таким образом, он дополняет работу Johnson et al., которые определили четыре основные субпопуляции с помощью четырех маркеров (покоящийся, прокоагулянтный, агрегационный, апоптотический)17. Таким образом, проведение анализа многоцветной проточной цитометрии позволяет сравнивать различные агонисты тромбоцитов с точки зрения их активации и формирования подтипов тромбоцитов в классических субпопуляциях тромбоцитов.

Метод может быть использован для фундаментальных исследований по анализу функции и физиологии тромбоцитов. Кроме того, установленный анализ многоцветной проточной цитометрии для тромбоцитов человека может быть выполнен с тромбоцитами, полученными в ходе исследований пациентов, например, при изучении сердечно-сосудистых заболеваний и тромботических событий, для расшифровки субпопуляций тромбоцитов, индуцированных этими заболеваниями, и влияния лечения на эти индуцированные фенотипы. Например, Mueller et al. показали, что субпопуляции тромбоцитов могут различаться у пациентов с аортальным стенозом19. Полученные знания могут открыть новые возможности для фармацевтических вмешательств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отбор крови и обращение с ней в исследовательских целях были одобрены Этическим комитетом медицинского факультета Университета имени Эберхарда и Карла и Университетской клиники Тюбингена (голосование по этике 238/2018B02), а методология исследования соответствовала стандартам, установленным Хельсинкской декларацией. Здоровые доноры давали письменное информированное согласие на забор крови. Исходные характеристики здоровых доноров приведены в таблице 1. На рисунке 1 представлен обзор протокола проточной цитометрии.

1. Выделение тромбоцитов человека из цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации ISTH были соблюдены в отношении сбора образцов, наложения жгутов и выбора антикоагулянта для обеспечения стандартизированного способа выделения тромбоцитов20.

  1. Подготовка буфера
    1. Кислотно-цитратно-декстрозный антикоагулянтный буфер: растворить 12,50 г Na 3-цитрата (85 мМ C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6,82 г цитратной кислоты (71 мМ) и 10,00 г глюкозы (111 мМ) в 475 мл аква дестиллаты. Отрегулируйте pH с 1 М NaOH до 4,69. Наполните до 500 мл аква дестиллатой. Затем фильтр простерилизовать буфер и хранить при температуре 4 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы стерилизуются фильтром с помощью вакуумной фильтрующей системы, в которой используется мембрана из полиэфирсульфона с быстрым потоком размером 0,22 мкм.
    2. Тиродский буфер (10x): Взвесьте 80,00 г NaCl, 10,15 г NaHCO3 и 1,95 г KCl и добавьте аквадестиллату в 1 л. Фильтруйте, простерилизуйте буфер и храните при температуре 4 °C до использования.
    3. Буфер Tyrode's-HEPES (1x; 137 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 5 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES): Смешайте 10 мл 10-кратного буфера Tyrode's и 90 мл aqua destillata. Растворите 0,1 г глюкозы и 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (БСА). Отрегулируйте pH с помощью 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновой кислоты (HEPES) до 7,4. Установите 10 мл буфера Tyrode's на pH 7,4 и отрегулируйте pH остаточных 90 мл Tyrode's до 7,4 с 1 N HCl до pH 6,5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA может поглощать некоторые химические вещества, такие как гемин. В этом случае важно подготовить буфер 1x Tyrode's без BSA. Перед использованием все буферы должны нагреться до комнатной температуры или 37 °C.
  2. Забор образцов крови
    1. Подготовьте для каждого донора по одному шприцу объемом 10 мл с 2 мл антикоагулянта от ACD и дайте ему отрегулировать до комнатной температуры или 37 °C с помощью инкубатора. Сохраняйте коэффициент разведения 1:5 (ACD: кровь).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприцы меньшего или большего размера для забора образцов крови. Холодный буфер ACD может предварительно активировать тромбоциты и ухудшить результаты.
    2. С помощью иглы-бабочки (21G) медленно соберите донорскую кровь в предварительно нагретые шприцы ACD. Откройте шланг жгута перед заполнением шприца, чтобы избежать предварительной активации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шприцы с иглой большего калибра могут свести к минимуму активацию тромбоцитов, вызванную сдвигом.
    3. Медленно перенесите кровь из ACD в реакционную пробирку объемом 15 мл. Используйте кровь немедленно, чтобы избежать предварительной активации тромбоцитов.
  3. Изоляция тромбоцитов
    1. Центрифугируйте кровь ACD в течение 20 мин при 209 x g (комнатная температура, RT) без тормозов. Приготовьте 25 мл буфера Tyrode's-HEPES pH 6,5 в реакционной пробирке объемом 50 мл.
    2. Полученную обогащенную тромбоцитами плазму (PRP, верхний слой) аккуратно перенесите в реакционную пробирку объемом 50 мл, содержащую буфер Tyrode's-HEPES, pH 6,5.
    3. Оставьте примерно 1 мл PRP над охристой шерстью и эритроцитами, чтобы избежать контаминации другими клетками крови.
    4. Центрифугируйте суспензию при 430 x g в течение 10 мин при RT для гранулирования тромбоцитов. Полученную гранулу осторожно ресуспендировать в 200-300 мкл буфера Tyrode, pH 7,4.
    5. Используйте счетчик клеток для определения количества тромбоцитов. Отрегулируйте количество тромбоцитов с помощью буфера Tyrode's HEPES, pH от 7,4 до 200 x 103 тромбоцитов/мкл. Для дальнейшей обработки окрашивания тромбоцитов смотрите шаг 3.

2. Подбор и титрование антител для проточной цитометрии

  1. Подбор антител и красителей
    1. Выберите антитела и красители с подходящими флуорофорами для проточного цитометра21. Обратите внимание на конфигурацию фильтра, рекомендованную производителем проточного цитометра. Пример маркеров тромбоцитов и конфигурации флуорофоров приведен в таблице 2 и на рисунке 2 для следующего цитометра: BD LSR Fortessa с конфигурацией Laser: фиолетовый (402 нм), синий (488 нм), желтый/зеленый (561 нм), красный (640 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более яркие флуорохромы для антигенов с более низкой экспрессией. Например, яркие флуорохромы BV412 и BV650 использовались для слабо экспрессируемых хемокиновых рецепторов (ACKR3 и CXCR4)22,23,24.
  2. Титрование антител и красителей
    1. Титруйте антитела, чтобы найти правильную рабочую концентрацию. Для титрования используют изолированные человеческие тромбоциты из этапа 1 и ряд концентраций антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие концентрации, указанные производителем, как правило, являются хорошей отправной точкой для серии концентраций.
      1. Если вы работаете с антигенами, которые экспрессируются только при лечении, активируйте тромбоциты перед окрашиванием, чтобы убедиться, что отрицательные и положительные клетки также могут быть обнаружены. Например, PAC-1 связывается только с активированным интегрином αIIbβ3. Таким образом, сильно активируйте тромбоциты, чтобы получить яркий, положительный сигнал, например, с 10 мкг/мл пептида, связанного с коллагеном (СРБ; см. рисунок 3).
  3. Титрование образцов
    1. Изолируйте человеческие тромбоциты, как показано на шаге 1, и отрегулируйте количество тромбоцитов до 1 x 106 тромбоцитов на образец.
      1. Для рецепторов, которые не нуждаются в активации перед окрашиванием: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 используйте один неокрашенный и окрашенный образец на каждое антитело. Для рецепторов/маркеров, которые необходимо активировать, например, с помощью 10 мкг/мл CRP-XL перед окрашиванием: PAC1, CD63, CD62P, Аннексин V, Zombie NIR, используют один активированный и один неактивированный образец 15,25,26.
    2. При необходимости активируйте тромбоциты (1 x 10,6 тромбоцитов на образец) в течение 30 мин с помощью 10 мкг/мл CRP-XL. Затем инкубируют выделенные тромбоциты (1 x 10по 6 тромбоцитов на образец) в течение 30 мин с различными концентрациями фторсопряженного антитела или красителя и добавляют 300 мкл 1x буфера, связывающего аннексин, для разбавления образца (примеры концентраций приведены в таблице 3).
    3. Измеряйте 10 000 событий для каждого образца.
    4. Рассчитайте индекс окрашивания, который показывает оптимальное разделение положительных и отрицательных популяций для каждого антитела, как показано на дополнительном рисунке 1.
    5. Постройте график индекса окрашивания для каждой концентрации антитела, чтобы найти оптимальную концентрацию.

3. Окрашивание для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 4 приведен пример окрашивания четырьмя различными активаторами тромбоцитов (CRP-XL, АДФ, тромбин, гемин).

  1. Хемин нужно готовить в свежем виде. Растворите порошок в 1,4 М растворе NaOH до 3 М раствора и нагрейте до 96 °C в течение 5 мин при 450 об/мин. Затем разбавьте его дистиллированным H2O до 3 мМ стокового раствора.
  2. После корректировки количества тромбоцитов (на образец: 1 x 106 тромбоцитов) активируйте тромбоциты в пробирке с активаторами тромбоцитов в течение 30 минут в режиме ЛТ, как указано в таблице 4.
  3. Добавьте к образцам 43,3 мкл коктейля антител и инкубируйте тромбоциты в течение 30 мин при ЛТ в темноте.
  4. После инкубации разбавьте образцы 300 мкл 1x Аннексин-связывающего буфера (10 мМ HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2) таким образом, чтобы белок аннексина V мог связываться с фосфатидилсерином на внешней стороне клеточной мембраны. Немедленно измерьте образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте образцы сразу после подготовки. Поскольку образцы не фиксируются, задержка в подготовке и измерении образцов может увеличить вариабельность результатов. Фиксация ухудшает связывание Annexin V.

4. Настройка компенсации и измерение флуоресценции минус один контрольный (FMO)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед записью данных запустите настройку компенсации. Проточный цитометр автоматически рассчитывает настройки компенсации; Обратитесь к обычным инструкциям по проточному цитометру для конкретной процедуры компенсации. Тем не менее, используйте элементы управления компенсацией либо с ячейками, либо с бусинами.

  1. Настройка компенсации
    1. Для компенсации с помощью гранул приготовьте 150 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) для каждого флуорофора с одной каплей гранул и 1 мкл флуоресцентно-конъюгированного антитела.
    2. Следите за видовой реакционной способностью бусин. Используйте антимышиный IgGκ и отрицательный контроль микрочастиц полистирола. Чтобы компенсировать аннексин V, пометьте гранулы PE/Cy7 антителом PE/Cy7 против человеческого CD62L, которое конъюгирует тот же флуорофор, что и аннексин V.
    3. Используйте амино-реактивные компенсационные шарики для амино-реактивного красителя. Используйте две капли положительных и одну каплю отрицательных шариков в 150 мкл PBS с 1 мкл красителя. Убедитесь, что аминоактивные компенсационные шарики реагируют с красителем и подают положительный сигнал. Убедитесь, что отрицательные шарики не вступают в реакцию с аминоактивным красителем и подают отрицательный сигнал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для Zombie NIR APC-Cy7 используйте реактивные шарики с отрицательным и положительным амином.
    4. Инкубировать компенсационные образцы в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
    5. Прогоните каждую компенсационную трубку отдельно и затворите популяцию синглетных бусин на основе FSC и SSC. Популяция бусин выглядит как одна небольшая концентрированная популяция. Нарисуйте ворота вокруг этой популяции.
    6. Отобразите гистограммы для каждой компенсационной пробирки и отрегулируйте значения компенсации до тех пор, пока положительные пики различных антител и красителей не перестанут перекрываться. Затем измерьте каждую отдельную компенсационную трубку и рассчитайте распространение флуорофоров в соответствии с СОП производителя.
    7. Продолжайте проводить фактический эксперимент по окрашиванию выделенных тромбоцитов человека (см. шаг 3 и таблицу 4). Отрегулируйте напряжение SSC/FSC перед измерением, чтобы найти популяцию тромбоцитов. Поскольку CD61 повсеместно экспрессируется на тромбоцитах, проверьте с помощью этого порога флуоресценции, можно ли обнаружить каждый размер тромбоцитов.
    8. Затем измерьте 20 000 событий на выборку.
  2. Измерение FMO
    1. Подготовьте для каждого маркера регулятор FMO в соответствии с таблицей 5. Для того чтобы иметь возможность определить перекрытия всех маркеров, подготавливайте как нестимулированные, так и вынужденные образцы.

5. Анализ данных

  1. Анализ с помощью программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии (Рисунок 4)
    1. Перетащите файлы FSC в программу. Определите с помощью элемента управления FMO положительное население для каждого маркера.
      1. Определите FMO, построив график каждого элемента управления FMO относительно каждого маркера на точечной диаграмме. Это делает видимым перетекание в другие каналы. Используйте вентиль FMO с наибольшим перетоком флуоресценции в качестве границы положительной популяции для обработанных 10-цветных образцов.
  2. Анализ с помощью облачного анализа проточной цитометрии (Рисунок 5)
    1. Откройте программное обеспечение и создайте новый набор данных. Перетащите файлы FCS, полученные с помощью проточного цитометра.
    2. Начните анализ с создания рабочего процесса. Компенсационная матрица создается автоматически на основе файлов исходных данных.
    3. Запустите анализ UMAP со следующими настройками: Соседи: 15, Минимальное расстояние: 0.4; Компонентов: 2; Метрика: евклидова; Коэффициент обучения: 1; Эпохи: 200; Инициализация встраивания: спектральная. Выберите все файлы и все 10 маркеров (функций).
    4. Добавьте анализ Фенопрафа в качестве новой задачи и запустите анализ со следующими настройками: K Ближайшие соседи: 20; Метрика расстояния: евклидова; Лувенские пробежки: 1; Количество результатов: 1.
    5. Добавьте задачу стробирования для указания созданных кластеров. После выполнения анализа можно представить данные в различных блотах, которые можно экспортировать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует два варианта анализа исходных данных, собранных с помощью многоцветной панели проточной цитометрии. Один из вариантов — проанализировать его вручную с помощью аналитического программного обеспечения (Рисунок 3 и Рисунок 4). Следовательно, необработанные данные необходимо перетащить в окно программного обеспечения. Во-первых, ячейки должны быть найдены путем настройки шкалы SSC/FSC в режиме отображения диаграммы рассеяния, чтобы показать популяцию тром...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многоцветная проточная цитометрия позволяет определить различные кластеры/субпопуляции тромбоцитов, связанные с дискретными функциями 12,17,18. Решающее значение для результатов субпопуляций и экспрессии рецепторной поверхности имеет качество выделенных тромбоцитов человека. Поэтому одним из ключевых этапов представленного протокола является подготовка тромбоцитов. Их необходимо аккуратно изолир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проект был поддержан Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) - Проект No 335549539 - GRK 2381.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Буфер привязки   Invitrogen,
Карлсбад, Калифорния, США		88-8103-74Buffer 
Аденозиндифосфат (АДФ)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Германия   		70212Агонист тромбоцитов 
Аннексин V PE-Cyanine7Invitrogen,
Carlsbad, Калифорния, США		88-8103-74краситель 
anti-CD41 AF 700BioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США		303728антитела 
anti-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США		303727антитела 
анти-CD42b PerCP/Cyanine5.5 BioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США		303918антитела 
anti-CD61 BV605BD Bioscience
Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 		744382антитела 
анти-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, Калифорния, США		IM1759Uантитела 
анти-CD63 PE/Cy5 Abcam,
Cambrigde, Великобритания		ab 234251антитела 
anti-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, США		740599антитела 
анти-CXCR7 BV421 BD Bioscience
Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 		566234антитела 
anti-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, США		340507антитела 
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Applichem,
Darmstadt, Германия		A1391-Citrit
acid Карл Рот,
Karlsruhe, Германия		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, Великобритания		Агонист тромбоцитовCRP-XL
D-(+)-глюкозаSigma Aldrich Co.,
Сент-Луис, Миссури, США		G7528-Dubecco
' s Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma Aldrich Co,
Сент-Луис, Миссури, США		D8537-Hemin
 Sigma Aldrich Co.,
Сент-Луис, Миссури, США		агонист тромбоцитов H9039-10G 
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Германия		9105.3-Хлорид
калия Карл Рот,
Карлсруэ, Германия		6781.3-Хлорид
натрия Карл Рот,
Карлсруэ, Германия		3957.1-Гидрокарбонат
натрия   Sigma Aldrich Co,
Сент-Луис, Миссури, США
401676-Thrombin Roche 10602400001агонист тромбоцитов 
три-цитрат натрия-дигидрат Applichem,
Darmstadt, Германия		1416551211-Zombie
NIRBioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США 423105		аминоспособный краситель 
 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
  2. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
  3. van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  4. Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
  5. Oishi, S., et al. Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma. Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).
  6. Bourne, J. H., et al. Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2. Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).
  7. Rohlfing, A. K., et al. cGMP modulates hemin-mediated platelet death. Thromb Res. 234, 63-74 (2024).
  8. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  9. Sodergren, A. L., Ramstrom, S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).
  10. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  11. Agbani, E. O., et al. Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets. Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).
  12. Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  13. Rukoyatkina, N., et al. Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets. Thromb Res. 171, 22-30 (2018).
  14. Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen. Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).
  15. van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  16. Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin. J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).
  17. Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  18. Laspa, Z., et al. Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques. FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).
  19. Mueller, K. A. L., et al. Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).
  20. Jourdi, G., et al. Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).
  21. Flores-Montero, J., et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Meth. 475, 112618(2019).
  22. Clemetson, K. J., et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).
  23. Rohlfing, A. K., et al. ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury. Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).
  24. Rath, D., et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery. Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).
  25. Hashemzadeh, M., et al. A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease. Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).
  26. Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation. Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).
  27. Busuttil-Crellin, X., et al. Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers. Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).
  28. Fink, A., et al. The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI. Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

UMAP

Похожие статьи