Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ субпопуляций тромбоцитов с помощью многоцветной проточной цитометрии

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 июня 2025 г.

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

Многоцветная проточная цитометрия для тромбоцитов может идентифицировать новые подтипы тромбоцитов в классических субпопуляциях тромбоцитов, такие как покои, агрегаторные, прокоагулянтные и апоптотические тромбоциты. Это позволяет сравнивать различные модели субпопуляций, индуцированные различными агонистами тромбоцитов. Здесь подробно описана процедура создания панели многоцветной проточной цитометрии.

Аннотация

Тромбоциты, или тромбоциты, представляют собой небольшие ядерные клетки крови, которые играют решающую роль в гемостазе и тромбозе. Дефекты функции тромбоцитов могут вызывать кровотечения или тромботические явления у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Поэтому важно фенотипически характеризовать тромбоциты, чтобы иметь возможность отнести субпопуляции тромбоцитов к функции тромбоцитов. Стимуляция тромбоцитов человека агонистами и активаторами тромбоцитов вызывает морфологические и физиологические изменения тромбоцитов, сопровождающиеся изменениями популяции поверхностных рецепторов. Это приводит к функционально разнообразным субпопуляциям тромбоцитов. Классически определенные субпопуляции тромбоцитов — это покои, агрегаторные, прокоагулянтные и апоптотические тромбоциты. Для характеристики влияния агонистов на подтипы тромбоцитов нами был проведен анализ с помощью многоцветной проточной цитометрии, состоящей из 10 различных антител и красителей (анти-CD62P, анти-CD63, анти-CD61, анти-CD41, анти-CD42b, анти-интегринαIIbβ3 (клон: PAC-1), анти-CXCR4, анти-ACKR3, аннексин V, зомби NIR). Изолированные человеческие тромбоциты инкубировали с агонистами тромбоцитов и окрашивали специфическими флуорофор-конъюгированными антителами и красителями. После этого их измеряли с помощью проточной цитометрии. Это позволяет нам определить подтипы, специфичные для агонистов в рамках классических четырех субпопуляций. В заключение следует отметить, что комбинация маркеров активации (анти-CD62P, анти-CD63, анти-интегринαIIbβ3 (клон: PAC-1)), маркеров воспаления (анти-CXCR4, анти-ACKR3) и маркеров апоптоза (аннексин V, Зомби NIR), составляющих описанную в данной рукописи 10-цветную панель проточной цитометрии, открывает возможность определения других подтипов тромбоцитов, которые могут быть связаны с определенной функцией тромбоцитов. Этот метод может быть применен в фундаментальных исследованиях функции и физиологии тромбоцитов, а также при определении новых подтипов тромбоцитов в моделях заболеваний и исследованиях пациентов.

Введение

Тромбоциты, также называемые тромбоцитами, представляют собой небольшие безъядерные клетки крови, необходимые для гемостаза и развития тромбоза 1,2. Они могут активироваться различными агонистами тромбоцитов. Классическими, физиологическими агонистами тромбоцитов являются аденозиндифосфат (АДФ), который связывается с рецепторами P2Y12 и P2Y1, тромбин, который активирует тромбоциты через рецепторы PAR1 и PAR4, и коллаген, который взаимодействует с гликопротеином VI. В экспериментах in vitro коллаген может быть заменен коллагеновым пептидом (CRP-XL)3,4. Недавно было показано, что гемин индуцирует активацию тромбоцитов путем взаимодействия лектиноподобного рецептора С-типа (CLEC-2) и гликопротеина VI (GPVI), что делает гемин новым эндогенным активатором/агонистом тромбоцитов 5,6. Несколько патологических ситуаций могут привести к гемолизу, в результате чего происходит высвобождение свободного железосодержащего гемина. Все эти агонисты тромбоцитов изменяют экспрессию поверхностных рецепторов на тромбоцитах. Изменение поверхностных рецепторов и плазматической мембраны зависит от силы и концентрации агониста тромбоцитов 7,8,9. Таким образом, важно фенотипически охарактеризовать тромбоциты, чтобы иметь возможность соотнести субпопуляции тромбоцитов с функцией тромбоцитов.

Многомерные методы, такие как проточная цитометрия, показали, что тромбоциты образуют субпопуляции с различными функциями. Субпопуляции можно классифицировать по различным поверхностным маркерам. В литературе хорошо известно, что присутствуют две различные субпопуляции тромбоцитов: прокоагулянт, который характеризуется экстернализацией фосфатидилсерина, и агрегационный фенотип, который активирует интегринα IIIbβ3. В дополнение к классическим маркерам активации, флуоресцентные красители, такие как глутатион-S-арилоксид (GSAO), который обнаруживает функцию митохондрий и окислительный стресс, могут быть использованы для дальнейшей категоризации, например, прокоагулянтные тромбоциты по их метаболическому состоянию10. Это позволяет провести различие между фенотипом11 прокоагулянтных тромбоцитов с баллонированием и формированием переходных пор через митохондриальную проницаемость (MPTP).

Heemskerk et al. показали, анализируя воздействие фосфатидилсерина (ФС) и активность интегринаα IIbβ3, что различные популяции тромбоцитов могут контролировать различные этапы свертывания и чтодля воздействия фосфатидилсерина требуются сильные активаторы, такие как тромбин и коллаген. Кроме того, активация тромбоцитов методом GPVI с коллагеном или специфическим агонистом GPVI конвульксином в первую очередь отвечает за образование адгезивных прокоагулянтных тромбоцитов. Аналогичным образом, арахидоновая кислота, которая приводит к активации тромбоцитов путем производства тромбоксана А2 циклооксигеназой, индуцирует воздействие PS13. Однако арахидоновая кислота, по сравнению с тромбином или коллагеном, является слабым активаторомтромбоцитов14. Van Velzen et al. также оценили поверхностные антигены тромбоцитов (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) и маркеры активации (PAC-1, CD63, CD62P) в двух отдельных измерениях15. Кроме того, ван Вельзен и др. смогли проанализировать кровь пациентов с тромбастенией и сравнили субпопуляции между здоровыми и больными пациентами. Hindle et al. измерили влияние простациклина на субпопуляции тромбоцитов после лечения тромбином и CRP-XL с помощью двух отдельных панелей, состоящих из четырех маркеров каждая (PAC-1, Аннексин V, CD62P, CD42b или CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. В последнее время с помощью многоцветной проточной цитометрии определяют покоящиеся (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Аннексин V-), агрегаторные (CD42b+, PAC1+, CD62P+, Аннексин V-) прокоагулянтные (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Аннексин V+) и апоптотические (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Аннексин V+) субпопуляции тромбоцитов 7,17. Laspa et al. расширили/усовершенствовали подход многоцветной проточной цитометрии путем добавления антител против хемокиновых рецепторов CXCR4 и ACKR318. Исходя из имеющейся литературы, это первая панель 10-цветного проточного цитометра для изолированных тромбоцитов человека, которая позволяет обнаруживать 10 различных антигенов на отдельном тромбоците (уровне одной клетки) в популяции выделенных тромбоцитов человека в одной пробирке. Таким образом, можно одновременно измерять активацию, адгезию и агрегационный потенциал, хемокиновые рецепторы и апоптотический потенциал одной клетки, чтобы еще больше различать существующую субпопуляцию. Таким образом, он дополняет работу Johnson et al., которые определили четыре основные субпопуляции с помощью четырех маркеров (покоящийся, прокоагулянтный, агрегационный, апоптотический)17. Таким образом, проведение анализа многоцветной проточной цитометрии позволяет сравнивать различные агонисты тромбоцитов с точки зрения их активации и формирования подтипов тромбоцитов в классических субпопуляциях тромбоцитов.

Метод может быть использован для фундаментальных исследований по анализу функции и физиологии тромбоцитов. Кроме того, установленный анализ многоцветной проточной цитометрии для тромбоцитов человека может быть выполнен с тромбоцитами, полученными в ходе исследований пациентов, например, при изучении сердечно-сосудистых заболеваний и тромботических событий, для расшифровки субпопуляций тромбоцитов, индуцированных этими заболеваниями, и влияния лечения на эти индуцированные фенотипы. Например, Mueller et al. показали, что субпопуляции тромбоцитов могут различаться у пациентов с аортальным стенозом19. Полученные знания могут открыть новые возможности для фармацевтических вмешательств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Отбор крови и обращение с ней в исследовательских целях были одобрены Этическим комитетом медицинского факультета Университета имени Эберхарда и Карла и Университетской клиники Тюбингена (голосование по этике 238/2018B02), а методология исследования соответствовала стандартам, установленным Хельсинкской декларацией. Здоровые доноры давали письменное информированное согласие на забор крови. Исходные характеристики здоровых доноров приведены в таблице 1. На рисунке 1 представлен обзор протокола проточной цитометрии.

1. Выделение тромбоцитов человека из цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации ISTH были соблюдены в отношении сбора образцов, наложения жгутов и выбора антикоагулянта для обеспечения стандартизированного способа выделения тромбоцитов20.

  1. Подготовка буфера
    1. Кислотно-цитратно-декстрозный антикоагулянтный буфер: растворить 12,50 г Na 3-цитрата (85 мМ C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6,82 г цитратной кислоты (71 мМ) и 10,00 г глюкозы (111 мМ) в 475 мл аква дестиллаты. Отрегулируйте pH с 1 М NaOH до 4,69. Наполните до 500 мл аква дестиллатой. Затем фильтр простерилизовать буфер и хранить при температуре 4 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы стерилизуются фильтром с помощью вакуумной фильтрующей системы, в которой используется мембрана из полиэфирсульфона с быстрым потоком размером 0,22 мкм.
    2. Тиродский буфер (10x): Взвесьте 80,00 г NaCl, 10,15 г NaHCO3 и 1,95 г KCl и добавьте аквадестиллату в 1 л. Фильтруйте, простерилизуйте буфер и храните при температуре 4 °C до использования.
    3. Буфер Tyrode's-HEPES (1x; 137 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 5 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES): Смешайте 10 мл 10-кратного буфера Tyrode's и 90 мл aqua destillata. Растворите 0,1 г глюкозы и 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (БСА). Отрегулируйте pH с помощью 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновой кислоты (HEPES) до 7,4. Установите 10 мл буфера Tyrode's на pH 7,4 и отрегулируйте pH остаточных 90 мл Tyrode's до 7,4 с 1 N HCl до pH 6,5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA может поглощать некоторые химические вещества, такие как гемин. В этом случае важно подготовить буфер 1x Tyrode's без BSA. Перед использованием все буферы должны нагреться до комнатной температуры или 37 °C.
  2. Забор образцов крови
    1. Подготовьте для каждого донора по одному шприцу объемом 10 мл с 2 мл антикоагулянта от ACD и дайте ему отрегулировать до комнатной температуры или 37 °C с помощью инкубатора. Сохраняйте коэффициент разведения 1:5 (ACD: кровь).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприцы меньшего или большего размера для забора образцов крови. Холодный буфер ACD может предварительно активировать тромбоциты и ухудшить результаты.
    2. С помощью иглы-бабочки (21G) медленно соберите донорскую кровь в предварительно нагретые шприцы ACD. Откройте шланг жгута перед заполнением шприца, чтобы избежать предварительной активации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шприцы с иглой большего калибра могут свести к минимуму активацию тромбоцитов, вызванную сдвигом.
    3. Медленно перенесите кровь из ACD в реакционную пробирку объемом 15 мл. Используйте кровь немедленно, чтобы избежать предварительной активации тромбоцитов.
  3. Изоляция тромбоцитов
    1. Центрифугируйте кровь ACD в течение 20 мин при 209 x g (комнатная температура, RT) без тормозов. Приготовьте 25 мл буфера Tyrode's-HEPES pH 6,5 в реакционной пробирке объемом 50 мл.
    2. Полученную обогащенную тромбоцитами плазму (PRP, верхний слой) аккуратно перенесите в реакционную пробирку объемом 50 мл, содержащую буфер Tyrode's-HEPES, pH 6,5.
    3. Оставьте примерно 1 мл PRP над охристой шерстью и эритроцитами, чтобы избежать контаминации другими клетками крови.
    4. Центрифугируйте суспензию при 430 x g в течение 10 мин при RT для гранулирования тромбоцитов. Полученную гранулу осторожно ресуспендировать в 200-300 мкл буфера Tyrode, pH 7,4.
    5. Используйте счетчик клеток для определения количества тромбоцитов. Отрегулируйте количество тромбоцитов с помощью буфера Tyrode's HEPES, pH от 7,4 до 200 x 103 тромбоцитов/мкл. Для дальнейшей обработки окрашивания тромбоцитов смотрите шаг 3.

2. Подбор и титрование антител для проточной цитометрии

  1. Подбор антител и красителей
    1. Выберите антитела и красители с подходящими флуорофорами для проточного цитометра21. Обратите внимание на конфигурацию фильтра, рекомендованную производителем проточного цитометра. Пример маркеров тромбоцитов и конфигурации флуорофоров приведен в таблице 2 и на рисунке 2 для следующего цитометра: BD LSR Fortessa с конфигурацией Laser: фиолетовый (402 нм), синий (488 нм), желтый/зеленый (561 нм), красный (640 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более яркие флуорохромы для антигенов с более низкой экспрессией. Например, яркие флуорохромы BV412 и BV650 использовались для слабо экспрессируемых хемокиновых рецепторов (ACKR3 и CXCR4)22,23,24.
  2. Титрование антител и красителей
    1. Титруйте антитела, чтобы найти правильную рабочую концентрацию. Для титрования используют изолированные человеческие тромбоциты из этапа 1 и ряд концентраций антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие концентрации, указанные производителем, как правило, являются хорошей отправной точкой для серии концентраций.
      1. Если вы работаете с антигенами, которые экспрессируются только при лечении, активируйте тромбоциты перед окрашиванием, чтобы убедиться, что отрицательные и положительные клетки также могут быть обнаружены. Например, PAC-1 связывается только с активированным интегрином αIIbβ3. Таким образом, сильно активируйте тромбоциты, чтобы получить яркий, положительный сигнал, например, с 10 мкг/мл пептида, связанного с коллагеном (СРБ; см. рисунок 3).
  3. Титрование образцов
    1. Изолируйте человеческие тромбоциты, как показано на шаге 1, и отрегулируйте количество тромбоцитов до 1 x 106 тромбоцитов на образец.
      1. Для рецепторов, которые не нуждаются в активации перед окрашиванием: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 используйте один неокрашенный и окрашенный образец на каждое антитело. Для рецепторов/маркеров, которые необходимо активировать, например, с помощью 10 мкг/мл CRP-XL перед окрашиванием: PAC1, CD63, CD62P, Аннексин V, Zombie NIR, используют один активированный и один неактивированный образец 15,25,26.
    2. При необходимости активируйте тромбоциты (1 x 10,6 тромбоцитов на образец) в течение 30 мин с помощью 10 мкг/мл CRP-XL. Затем инкубируют выделенные тромбоциты (1 x 10по 6 тромбоцитов на образец) в течение 30 мин с различными концентрациями фторсопряженного антитела или красителя и добавляют 300 мкл 1x буфера, связывающего аннексин, для разбавления образца (примеры концентраций приведены в таблице 3).
    3. Измеряйте 10 000 событий для каждого образца.
    4. Рассчитайте индекс окрашивания, который показывает оптимальное разделение положительных и отрицательных популяций для каждого антитела, как показано на дополнительном рисунке 1.
    5. Постройте график индекса окрашивания для каждой концентрации антитела, чтобы найти оптимальную концентрацию.

3. Окрашивание для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 4 приведен пример окрашивания четырьмя различными активаторами тромбоцитов (CRP-XL, АДФ, тромбин, гемин).

  1. Хемин нужно готовить в свежем виде. Растворите порошок в 1,4 М растворе NaOH до 3 М раствора и нагрейте до 96 °C в течение 5 мин при 450 об/мин. Затем разбавьте его дистиллированным H2O до 3 мМ стокового раствора.
  2. После корректировки количества тромбоцитов (на образец: 1 x 106 тромбоцитов) активируйте тромбоциты в пробирке с активаторами тромбоцитов в течение 30 минут в режиме ЛТ, как указано в таблице 4.
  3. Добавьте к образцам 43,3 мкл коктейля антител и инкубируйте тромбоциты в течение 30 мин при ЛТ в темноте.
  4. После инкубации разбавьте образцы 300 мкл 1x Аннексин-связывающего буфера (10 мМ HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2) таким образом, чтобы белок аннексина V мог связываться с фосфатидилсерином на внешней стороне клеточной мембраны. Немедленно измерьте образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте образцы сразу после подготовки. Поскольку образцы не фиксируются, задержка в подготовке и измерении образцов может увеличить вариабельность результатов. Фиксация ухудшает связывание Annexin V.

4. Настройка компенсации и измерение флуоресценции минус один контрольный (FMO)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед записью данных запустите настройку компенсации. Проточный цитометр автоматически рассчитывает настройки компенсации; Обратитесь к обычным инструкциям по проточному цитометру для конкретной процедуры компенсации. Тем не менее, используйте элементы управления компенсацией либо с ячейками, либо с бусинами.

  1. Настройка компенсации
    1. Для компенсации с помощью гранул приготовьте 150 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) для каждого флуорофора с одной каплей гранул и 1 мкл флуоресцентно-конъюгированного антитела.
    2. Следите за видовой реакционной способностью бусин. Используйте антимышиный IgGκ и отрицательный контроль микрочастиц полистирола. Чтобы компенсировать аннексин V, пометьте гранулы PE/Cy7 антителом PE/Cy7 против человеческого CD62L, которое конъюгирует тот же флуорофор, что и аннексин V.
    3. Используйте амино-реактивные компенсационные шарики для амино-реактивного красителя. Используйте две капли положительных и одну каплю отрицательных шариков в 150 мкл PBS с 1 мкл красителя. Убедитесь, что аминоактивные компенсационные шарики реагируют с красителем и подают положительный сигнал. Убедитесь, что отрицательные шарики не вступают в реакцию с аминоактивным красителем и подают отрицательный сигнал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для Zombie NIR APC-Cy7 используйте реактивные шарики с отрицательным и положительным амином.
    4. Инкубировать компенсационные образцы в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
    5. Прогоните каждую компенсационную трубку отдельно и затворите популяцию синглетных бусин на основе FSC и SSC. Популяция бусин выглядит как одна небольшая концентрированная популяция. Нарисуйте ворота вокруг этой популяции.
    6. Отобразите гистограммы для каждой компенсационной пробирки и отрегулируйте значения компенсации до тех пор, пока положительные пики различных антител и красителей не перестанут перекрываться. Затем измерьте каждую отдельную компенсационную трубку и рассчитайте распространение флуорофоров в соответствии с СОП производителя.
    7. Продолжайте проводить фактический эксперимент по окрашиванию выделенных тромбоцитов человека (см. шаг 3 и таблицу 4). Отрегулируйте напряжение SSC/FSC перед измерением, чтобы найти популяцию тромбоцитов. Поскольку CD61 повсеместно экспрессируется на тромбоцитах, проверьте с помощью этого порога флуоресценции, можно ли обнаружить каждый размер тромбоцитов.
    8. Затем измерьте 20 000 событий на выборку.
  2. Измерение FMO
    1. Подготовьте для каждого маркера регулятор FMO в соответствии с таблицей 5. Для того чтобы иметь возможность определить перекрытия всех маркеров, подготавливайте как нестимулированные, так и вынужденные образцы.

5. Анализ данных

  1. Анализ с помощью программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии (Рисунок 4)
    1. Перетащите файлы FSC в программу. Определите с помощью элемента управления FMO положительное население для каждого маркера.
      1. Определите FMO, построив график каждого элемента управления FMO относительно каждого маркера на точечной диаграмме. Это делает видимым перетекание в другие каналы. Используйте вентиль FMO с наибольшим перетоком флуоресценции в качестве границы положительной популяции для обработанных 10-цветных образцов.
  2. Анализ с помощью облачного анализа проточной цитометрии (Рисунок 5)
    1. Откройте программное обеспечение и создайте новый набор данных. Перетащите файлы FCS, полученные с помощью проточного цитометра.
    2. Начните анализ с создания рабочего процесса. Компенсационная матрица создается автоматически на основе файлов исходных данных.
    3. Запустите анализ UMAP со следующими настройками: Соседи: 15, Минимальное расстояние: 0.4; Компонентов: 2; Метрика: евклидова; Коэффициент обучения: 1; Эпохи: 200; Инициализация встраивания: спектральная. Выберите все файлы и все 10 маркеров (функций).
    4. Добавьте анализ Фенопрафа в качестве новой задачи и запустите анализ со следующими настройками: K Ближайшие соседи: 20; Метрика расстояния: евклидова; Лувенские пробежки: 1; Количество результатов: 1.
    5. Добавьте задачу стробирования для указания созданных кластеров. После выполнения анализа можно представить данные в различных блотах, которые можно экспортировать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Существует два варианта анализа исходных данных, собранных с помощью многоцветной панели проточной цитометрии. Один из вариантов — проанализировать его вручную с помощью аналитического программного обеспечения (Рисунок 3 и Рисунок 4). Следовательно, необработанные данные необходимо перетащить в окно программного обеспечения. Во-первых, ячейки должны быть найдены путем настройки шкалы SSC/FSC в режиме отображения диаграммы рассеяния, чтобы показать популяцию тром...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Многоцветная проточная цитометрия позволяет определить различные кластеры/субпопуляции тромбоцитов, связанные с дискретными функциями 12,17,18. Решающее значение для результатов субпопуляций и экспрессии рецепторной поверхности имеет качество выделенных тромбоцитов человека. Поэтому одним из ключевых этапов представленного протокола является подготовка тромбоцитов. Их необходимо аккуратно изолир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Проект был поддержан Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) - Проект No 335549539 - GRK 2381.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Буфер привязки   Invitrogen,
Карлсбад, Калифорния, США		88-8103-74Buffer 
Аденозиндифосфат (АДФ)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Германия   		70212Агонист тромбоцитов 
Аннексин V PE-Cyanine7Invitrogen,
Carlsbad, Калифорния, США		88-8103-74краситель 
anti-CD41 AF 700BioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США		303728антитела 
anti-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США		303727антитела 
анти-CD42b PerCP/Cyanine5.5 BioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США		303918антитела 
anti-CD61 BV605BD Bioscience
Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 		744382антитела 
анти-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, Калифорния, США		IM1759Uантитела 
анти-CD63 PE/Cy5 Abcam,
Cambrigde, Великобритания		ab 234251антитела 
anti-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, США		740599антитела 
анти-CXCR7 BV421 BD Bioscience
Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 		566234антитела 
anti-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, США		340507антитела 
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Applichem,
Darmstadt, Германия		A1391-Citrit
acid Карл Рот,
Karlsruhe, Германия		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, Великобритания		Агонист тромбоцитовCRP-XL
D-(+)-глюкозаSigma Aldrich Co.,
Сент-Луис, Миссури, США		G7528-Dubecco
' s Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma Aldrich Co,
Сент-Луис, Миссури, США		D8537-Hemin
 Sigma Aldrich Co.,
Сент-Луис, Миссури, США		агонист тромбоцитов H9039-10G 
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Германия		9105.3-Хлорид
калия Карл Рот,
Карлсруэ, Германия		6781.3-Хлорид
натрия Карл Рот,
Карлсруэ, Германия		3957.1-Гидрокарбонат
натрия   Sigma Aldrich Co,
Сент-Луис, Миссури, США
401676-Thrombin Roche 10602400001агонист тромбоцитов 
три-цитрат натрия-дигидрат Applichem,
Darmstadt, Германия		1416551211-Zombie
NIRBioLegend,
Сан-Диего, Калифорния, США 423105		аминоспособный краситель 
 

Ссылки

  1. Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
  2. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
  3. van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  4. Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
  5. Oishi, S., et al. Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma. Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).
  6. Bourne, J. H., et al. Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2. Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).
  7. Rohlfing, A. K., et al. cGMP modulates hemin-mediated platelet death. Thromb Res. 234, 63-74 (2024).
  8. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  9. Sodergren, A. L., Ramstrom, S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).
  10. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  11. Agbani, E. O., et al. Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets. Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).
  12. Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  13. Rukoyatkina, N., et al. Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets. Thromb Res. 171, 22-30 (2018).
  14. Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen. Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).
  15. van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  16. Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin. J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).
  17. Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  18. Laspa, Z., et al. Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques. FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).
  19. Mueller, K. A. L., et al. Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).
  20. Jourdi, G., et al. Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).
  21. Flores-Montero, J., et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Meth. 475, 112618(2019).
  22. Clemetson, K. J., et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).
  23. Rohlfing, A. K., et al. ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury. Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).
  24. Rath, D., et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery. Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).
  25. Hashemzadeh, M., et al. A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease. Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).
  26. Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation. Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).
  27. Busuttil-Crellin, X., et al. Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers. Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).
  28. Fink, A., et al. The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI. Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Активация тромбоцитовагонисты тромбоцитовфункция тромбоцитовповерхностные маркеры тромбоцитоввыделение тромбоцитовапоптотические тромбоцитыагрегация тромбоцитованализ UMAP
Анализ субпопуляций тромбоцитов с помощью многоцветной проточной цитометрии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.