Однонуклеотидный полиморфизм-чувствительный FISH детектирование локус-специфичной транскрипции рибосомальной РНК у Drosophila melanogaster

Summary

В протоколе описан метод флуоресцентной гибридизации in situ (SNP-FISH), чувствительный к однонуклеотидным полиморфизмам, для различения транскриптов рибосомной РНК, полученных из локуса рибосомальной ДНК X или Y хромосомы у Drosophila melanogaster.

Abstract

Чтобы обеспечить достаточную транскрибацию рибосомной РНК (рРНК) для функции рибосом, геномы содержат сотни тандемных дупликаторов последовательностей, кодирующих рРНК, составляющих области, называемые локусами рибосомной ДНК (рДНК). Геномы многих организмов содержат более одного локуса рДНК, распределенного по разным хромосомам, и рРНК может быть транскрибирована из нескольких локусов рДНК или только из одного локуса. Изменения в источниках транскрипции рРНК часто указывают на рибосомный дистресс. Однако гомогенность рРНК затрудняет различение, транскрибируется ли рРНК из множественного или одного локуса рДНК. В данной статье мы описываем метод, в котором используется однонуклеотидная полиморфизм-чувствительная флуоресценция in situ гибридизация (SNP-FISH) для различения транскрипции рРНК между локусами рДНК Drosophila melanogaster на X и Y хромосомах. Этот метод использует локус-специфичные варианты рРНК, чтобы обеспечить легкое обнаружение источника транскрипции рРНК с разрешением одной клетки. Этот анализ может быть применен к любому типу клеток дрозофилы и может быть адаптирован для использования в других системах.

Introduction

18S, 5.8S и 28S рибосомные РНК (рРНК), необходимые для функции рибосом, совместно транскрибируются в одном цистроне, называемом 45S пре-рРНК. Три рРНК разделены внутри 45S пре-рРНК двумя внутренними транскрибируемыми спейсерными последовательностями (ITS) и фланкированы внешними транскрибируемыми спейсерными последовательностями (ETS) на 5' и 3'-концах. Все эти последовательности спейсеров удаляются из 45S пре-рРНК для того, чтобы зрелые рРНК были включены в рибосомы (см.¹). Чтобы удовлетворить высокий спрос на продукцию рРНК, необходимую для поддержания активности рибосом, все геномы эукариот содержат сотни копий последовательности 45S. Эти копии группируются вместе в тандемных повторах, образуя участки генома, называемые локусами рибосомной ДНК (рДНК). Большинство эукариотических геномов содержат несколько локусов рДНК, распределенных по отдельным хромосомам (см.²). Высокая избыточность 45S-копий означает, что 45S-копий, как правило, намного больше, чем необходимо для транскрипции, и большинство 45S-копий являются транскрипционно молчащими и погружены в гетерохроматин-3. Транскрипционная активность не является однородной для всех локусов рДНК, и вариации транскрипции локуса рДНК широко наблюдаются у организмов ^4,5,6, что указывает на то, что транскрипция 45S дифференциально регулируется в отдельных локусах рДНК. У растений, беспозвоночных и позвоночных 7,8,9,10 наблюдалось полнолокусное сайленсинг рДНК, что позволяет предположить, что локусное сайленсинг рДНК является основным механизмом регуляции дозы рРНК ¹¹. Транскрипция рРНК является ключевым регуляторным этапом в производстве рибосом, а изменения в транскрипции рРНК, которые модулируют трансляционную активность, являются важной особенностью как нормальной дифференцировки, так и состояния заболевания¹². Изменения в транскрипции локуса рДНК также связаны с уменьшением общего числа копий рДНК номер¹³. Таким образом, измененная локус-специфичная транскрипция рДНК может быть важным индикатором нарушенной клеточной физиологии.

В то время как локус-специфический сайленсинг, по-видимому, является основным источником регуляции транскрипции рРНК, механизмы, которые устанавливают этот сайленсинг и определяют, какие локусы рДНК являются транскрипционно активными, в значительной степени неизвестны. Гомогенность последовательностей рДНК затрудняет оценку транскрипции отдельных локусов рДНК, препятствуя широкому анализу локус-специфичной транскрипционной активности рДНК. Эту проблему можно решить, используя преимущества структурной и однонуклеотидной изменчивости последовательностей между копиями рДНК в пределах одного и того же генома 4,5,6,13. Некоторые из этих вариантов могут быть общими для большинства или всех копий в отдельном локусе, создавая уникальные гаплотипы локуса рДНК из нескольких вариантов, которые отличают локус рДНК. Действительно, недавнее картирование вариантов рДНК по конкретным локусам консорциумом теломер-теломер выявило локус-специфичные общие варианты рДНК в геноме человека^. Такие карты локусов рДНК могут позволить идентифицировать локус-специфичную транскрипцию из наборов данных секвенирования; Тем не менее, доступность этих карт в настоящее время остается ограниченной, и их нелегко создать. Поскольку локусы рДНК находятся только на половых хромосомах у Drosophila melanogaster (по одному локусу на каждой X и Y хромосоме)¹⁵, локус рДНК Y-хромосомы отсутствует у самок XX. Эта естественная изоляция от локуса Y-хромосомы означает, что варианты однонуклеотидного полиморфизма (SNP) между локусами X- и Y-рДНК могут быть легко идентифицированы с помощью краткого секвенирования как любые варианты, присутствующие у мужчин (XY), но отсутствующие у женщин (XX). Ранее идентифицированные SNP могут быть быстро протестированы на негенотипированных штаммах дрозофилы с помощью простой ПЦР и секвенирования ДНК самцов и самок по Сэнгеру. Кроме того, наличие штаммов дрозофилы с Х-хромосомой, которая не имеет локуса^{рДНК 16}, означает, что отдельные локусы рДНК X и Y могут быть выделены по отдельности для еще более точной характеристики SNP рДНК. Такая легкая идентификация вариантов SNP между локусами рДНК дрозофилы позволяет определить уникальные гаплотипы SNP¹³ локусов X- и Y рДНК. Локусы рДНК Х-хромосомы также, как правило, полностью бесшумны у самцов дрозофилы, но оба локуса Х-хромосомы транскрибируются у самок^10,17, что делает дрозофилу полезной системой для изучения сайленсинга рДНК по всему локусу.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является мощным инструментом для визуализации присутствия специфических последовательностей РНК или ДНК в отдельных клетках ткани. FISH-метки нацелены на последовательности РНК или ДНК с помощью антисмысловых олигонуклеотидных зондов, конъюгированных с флуорофорами. Для того, чтобы обеспечить достаточно стабильное связывание с мишенью для визуализации, обычно требуется длина зондов FISH ~20 нуклеотидов, но зонды такой длины также могут легко связываться с нецелевыми последовательностями, которые отличаются только одним нуклеотидом (рис. 1A). И наоборот, зонды, достаточно короткие, чтобы придать однонуклеотидную специфичность, не связываются достаточно стабильно для визуализации. Чтобы сбалансировать специфичность и стабильность, SNP-чувствительный FISH (SNP-FISH) сочетает в себе длинный антисмысловой флуоресцентный зонд ~26 нуклеотидов с нефлуоресцентной сенсорной маской олигонуклеотида, который связывается со всеми зондами, кроме 5'-конца зонда¹⁸. Эта маска оставляет только 10 наиболее 5'-нуклеотидов зонда одноцепочечными и доступными для связывания с мишенью (рис. 1B). Эта короткая одноцепочечная часть зонда придает мишени специфичность, но предотвращает перекрестную реактивность с РНК, которые имеют хотя бы одно несоответствие с этими 10 нуклеотидами (рис. 1B). Как только 5'-конец зонда связывается со своей мишенью, пассивное смещение нити снимает маску с зонда, позволяя 3'-области связывать мишень и создавая стабильную маркировку мишени (рис. 1B)¹⁸. Таким образом, SNP-FISH может дифференцированно визуализировать РНК, которые отличаются одним SNP, используя пару зондов, которые имеют разные флуорофоры, каждый из которых дополняет свой SNP, но имеет общую маску (рис. 1C). Несмотря на то, что этот метод рекрутирует только один флуорофор-конъюгированный зонд в целевой SNP, объединение нескольких наборов зонд-масок в несколько SNP в пределах общего гаплотипа рДНК может быть использовано для амплификации SNP-чувствительного обнаружения одной рРНК (рис. 1D). Кроме того, поскольку рРНК так обильно транскрибируется, транскрипты рРНК могут быть легко визуализированы в экспериментах FISH с использованием небольшого количества флуоресцентных меток на РНК. Такое низкое требование к флуорофору на РНК означает, что SNP-FISH может визуализировать рРНК из конкретного локуса с помощью всего нескольких уникальных SNP. Этот метод позволяет легко обнаруживать локус-специфичную транскрипцию рРНК в различных тканях дрозофилы и на разных стадиях развития¹⁷. Он особенно эффективен в отношении мужских стволовых клеток зародышевой линии дрозофилы, которые изменяются между эксклюзивной транскрипцией Y-рДНК и совместной экспрессией локусов рДНК X- и Y-хромосомы в возрасте¹³ лет. Здесь мы предоставляем протокол SNP-FISH для визуализации различных транскриптов X- и Y-рРНК в яичках дрозофилы для достижения общей цели оценки локус-специфичного сайленсинга рРНК. В этом методе используются четыре SNP, ранее охарактеризованные между локусами рДНК на X и Y хромосомах общего лабораторного штамма дрозофилы y¹w¹ (рисунок 1D).

Protocol

1. Приготовление буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах 1, 3 и 4 следует использовать метод без РНКазы, а также следует использовать сертифицированные реагенты, не содержащие РНКазы.

1. В химическом колпаке приготовьте 40 мл 4% формальдегида в 1x PBS фиксирующем растворе, добавив 10 мл 16% формальдегида и 4 мл 10x PBS без РНКазы к 26 мл воды, не содержащей РНКазы. Распределите по 1 мл аликвот и храните при температуре -20 °C в течение 30 минут после приготовления. Фиксирующий раствор можно хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев.
   ВНИМАНИЕ: Раствор содержит формальдегид. Обращайтесь с ними в перчатках и с соответствующими СИЗ и безопасно утилизируйте их.
2. Приготовьте 10 мл гибридизационного буфера, смешав 1 мл 20-кратного безРНКазного физиологического раствора-цитрата натрия (ССК), 1 г сульфата декстрана, 100 мкл 100 мг/мл тРНК Saccharomyces cerevisiae , 100 мкл 200 мМ комплекса ванадилрибонуклеозидов, 1 мл 5% РНКазы БСА, 1 мл деионизированного формамида в сочетании с 6 мл воды, не содержащей РНКазы. Распределите по 1 мл аликвот в микропробирках объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C до 1 месяца.
3. Приготовьте 50 мл промывочного буфера, добавив 5 мл 20-кратного SSC, не содержащего РНКазы, 5 мл деионизированного формамида, 50 мкл Triton-X к 40 мл воды, не содержащей РНКазы. Хранить при комнатной температуре в темноте до 1 месяца.
4. Приготовьте 10 мл изоляционного буфера ДНК, добавив 100 мкл 1М Tris-HCl pH 7,5-8,0, 20 мкл 0,5М ЭДТА и 50 мкл 5М NaCl к 9,8 мл воды.

2. Генотипирование образцов для X- и Y-специфичных рРНК SNP

1. Соберите отдельных неспаренных гомозиготных Х-самку и самца, несущих одну и ту же Х-хромосому, в пробирки объемом 0,2 мл и охладите на льду.
2. Смешайте 50 мкл буфера для выделения ДНК с 0,5 мкл 20 мг/мл протеиназы К на образец.
3. Добавьте 50 мкл буфера для выделения ДНК / протеиназы К в образец дрозофилы и гомогенизируйте образец с помощью наконечника для пипетки.
4. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 минут, а затем при 95 °C в течение 2 минут. Перелейте 40 мл образца (избегайте остатков животного происхождения) в чистую пробирку объемом 1,5 мл.
5. Отдельно амплифицировать каждый целевой участок SNP из каждого образца ДНК методом ПЦР с использованием концентрации 10 мкМ следующих пар праймеров: 18S SNP Forward + Reverse; ITS1 SNP Вперед + Назад; 28S SNP Вперед + Назад. Последовательность праймера и ожидаемый размер ампликона ПЦР приведены в таблице 1.
6. Используйте гель-электрофорез для отделения всего образца ПЦР на 1% агарозном геле 1x TAE для подтверждения ожидаемого продукта ПЦР. Ожидаемые размеры изделий приведены в таблице 1.
7. Изолируйте продукт ПЦР от геля с помощью любого имеющегося в продаже набора для экстракции геля.
8. Секвенирование продуктов ПЦР с помощью секвенирования по Сэнгеру. Секвенируйте образцы в обоих направлениях, используя отдельные индивидуальные реакции для F и R праймера для каждой мишени.
9. Определите вариант SNP Х-хромосомы в положениях, указанных в таблице 2 , в образце ДНК неспаренной самки. Ожидаемый гаплотип X описан в таблице 2.
10. Наблюдайте за позициями SNP на хроматограмме для секвенирования образцов ДНК мужчин. Вывод о варианте SNP Y-хромосомы основан на уже определенном варианте X SNP в каждой позиции SNP. Ожидаемый гаплотип Y описан в таблице 2.

Название грунтовки	Последовательность	Ожидаемый размер ампликона
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652.н.
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTTTC	955.н.
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598.н.
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

Таблица 1: Последовательности праймеров для секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов рДНК. Пары праймеров для амплификации участков рДНК, которые содержат ранее охарактеризованные SNP в областях рДНК 18S, ITS1 и 28S. Перечислены последовательность олигонуклеотидов праймера и ожидаемый размер ампликона ПЦР.

Гаплотипа	Позиция SNP	Последовательность
Х рДНК	18С	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ИТС1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ИТС1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28С	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y рДНК	18С	1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
	ИТС1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ИТС1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28С	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Таблица 2: Ожидаемые гаплотипы рДНК. Ожидаемые SNP в локусах рДНК X и Y-хромосомы в штамме дрозофилы y¹w¹ . SNP выделен жирным шрифтом и подчеркнут. Позиция указана на основе консенсусной последовательности 45S рРНК (Дополнительный файл 1).

3. Диссекция, фиксация и пермеабилизация яичка

1. Очистите стереомикроскоп, рабочую станцию, препарирующую чашку и щипцы для препарирования 70% этанолом (или другим методом лечения РНКазой).
2. Под стереомикроскопом препарируйте дрозофилу , чтобы выделить яички в PBS без 1x РНКазы. Возьмитесь за середину живота животного одной парой щипцов и возьмитесь за конец живота другой парой щипцов, чтобы аккуратно раздвинуть животное. Семенники будут диссоциироваться от животного и могут быть дополнительно отделены с помощью щипцов. Соберите 30 - 40 семенников на образец.
3. С помощью щипцов возьмите яички и перенесите их из препарирующей чашки в микрофугальную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 0,5 мл 1x РНКазы PBS.
4. Аспиратируйте PBS и добавьте 1 мл фиксирующего раствора. Инкубировать при комнатной температуре на ореховом шейкере в течение 30 мин. Фиксатор аспирата.
5. Умойтесь 2x с 1 мл 1x PBS без РНКазы в течение 5 минут каждый на шейкере. Отсадите 1x PBS и добавьте 1 мл 70% этанола (EtOH), не содержащего РНКазы. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи в шейкере.

4. SNP-чувствительная рибосомальная РНК FISH

1. Отсадите этанол и добавьте 1 мл буфера для стирки. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 минут на нутативном шейкере, затем 2 минуты прокладывайте трубку в вертикальном положении.
2. Смешайте зонды и маски с буфером для гибридизации, сделав 100 мкл общего объема на образец. Зонды, последовательности масок и флуорофорные метки перечислены в таблице 3. При использовании всех 4 SNP приготовьте 80 мкл гибридизационного буфера, по 1 мкл 10 мкМ зонда Y-SNP (всего 4 мкл), по 1 мкл 10 мкМ x-SNP зонда (всего 4 мкл) и по 3 мкл 10 мкМ общей маски (всего 12 мкл)
3. Аспирация промывочного буфера, затем добавьте 100 мкл гибридизационного раствора. Наклейте прозрачную пленку по краям трубки, оберните алюминиевой фольгой для защиты от света и выдерживайте на водяной бане при температуре 37 °C не менее 24 часов.
4. Добавьте в образец 1 мл промывочного буфера, не отсасывая гибридизационный раствор. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут в темноте.
5. Аспирируйте буфер для промывки, затем добавьте 1 мл буфера для промывки в образец. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут в темноте.
6. Отсадите буфер для промывки и добавьте 50 мкл монтажного материала. Образцы можно сразу же установить на предметные стекла или хранить до 1 недели при температуре 4 °C перед монтажом.

Позиция SNP	Олигонуклеотид	Последовательность		3'-конъюгированный флуорофор
18С	Зонд X SNP	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Алекса 488
	Y Зонд SNP	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Алекса 647
	Маска	ТАТТГАТТАААТАКТ
ИТС1-1	Зонд X SNP	AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT		Алекса 488
	Y Зонд SNP	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Алекса 647
	Маска	AATATCCTTACCGTTA
ИТС1-2	Зонд X SNP	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Алекса 488
	Y Зонд SNP	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Алекса 647
	Маска	GTTTCGAACATGAAAA
28С	Зонд X SNP	TTAGGCATTTTTGTTTTTTACTTGAAAA		Алекса 488
	Y Зонд SNP	TTAGCCATTTTTTTTTTTTACTTGAAAA		Алекса 647
	Маска	TTTTCAAGTAAAACAA

Таблица 3: Зондирование и маскировка последовательностей для rDNA SNP-FISH. Позиции ШНП выделены жирным шрифтом. Часть зонда, которая связывается с олигонуклеотидом маски, выделена. Примеры подходящих 3'-сопряженных флуорофоров перечислены, но можно использовать любые совместимые флуорофоры.

5. Подготовка образцов к визуализации

1. Работая под стереомикроскопом, используйте пипетку с широким отверстием, чтобы перенести образец на предметное стекло микроскопа.
2. С помощью щипцов расположите яички в линию, чтобы облегчить поиск образцов при визуализации (специальная ориентация не требуется). Накройте образец покровным листком. Промокните края покровного стекла салфеткой, чтобы удалить излишки монтажного материала.
3. Заклейте края покровного стекла лаком для ногтей. Оставьте слайд в темноте при комнатной температуре на 10 минут, чтобы лак для ногтей высох. Предметные стекла можно использовать сразу для конфокальной визуализации или хранить до одного месяца при температуре 4 °C перед визуализацией^.

Results

Ожидается, что результаты секвенирования генотипирования SNP выявят различия SNP между локусами X- и Y-рДНК. Эти SNP обнаруживаются путем непосредственной оценки позиций SNP в секвенционных хроматограммах (Рисунок 2). Ожидается, что секвенирование женских образцов будет иметь один сигнал секвенирования в положении SNP, указывающий на гомозиготность SNP между двумя X-хромосомами (рис. 2A). Ожидается, что результаты секвенирования образцов у мужчин будут иметь двойной пик в положении SNP (рис. 2B). На основании генотипа X-хромосомы, определенного с помощью секвенирования женского образца, предполагается, что вариант, отличный от X, является SNP рДНК Y-хромосомы (т.е. X = T, Y = C для секвенирования 18S SNP на рисунке 2). В качестве альтернативы, один пик секвенирования в положении SNP в мужском образце указывал бы на гомозиготность между мужскими и женскими локусами рДНК в этой позиции SNP, и эта позиция не была бы пригодна для рРНК SNP-FISH.

В соответствии с протоколом SNP FISH, образцы могут быть визуализированы путем установки на предметные стекла и помещены под герметичную защитную крышку, после чего проводится конфокальная микроскопия. С помощью зондов, перечисленных в таблице 3, сигнал рРНК, полученный из Y, детектируется излучением Alexa Fluor 647, а сигнал рРНК, полученный из X, детектируется излучением Alexa Fluor 488. Ожидается, что сигналы рРНК будут наблюдаться в ядрышке, которое может быть идентифицировано как бедное DAPI отверстие в ядре (рис. 3A). Ядрышко особенно легко идентифицировать в половых клетках благодаря их большому ядру и ядрышку (рис. 3A). Слабый сигнал обычно также может быть обнаружен в цитоплазме (рис. 3), но это неспецифический сигнал, который также может быть обнаружен в образцах без рРНК, содержащих комплементарный SNP (т.е. сигнал Y в клетках, лишенных Y рДНК, или сигнал X в клетках, лишенных X рДНК; Рисунок 3B-C). Кроме того, искусственное совместное мечение рРНК X и Y иногда может быть обнаружено в соматическом хабе, даже в образцах, в которых отсутствуют локусы рДНК X или Y (рисунок 3B-C, желтые стрелки). Таким образом, для оценки локус-специфичной транскрипции следует использовать только ядерные сигналы. Ожидается, что большинство клеток, особенно соматических, имеют только сигнал Y-рРНК, что указывает на то, что рРНК транскрибируется исключительно из локуса Y-рДНК (рис. 3A, желтый пунктирный круг и красная стрелка)^10,17. Тем не менее, коэкспрессия X- и Y-рРНК часто обнаруживается в половых клетках, особенно в стволовых клетках зародышевой линии¹³ (рисунок 3A, белые пунктирные круги). Сигналы X и Y рРНК в коэкспрессирующих клетках могут быть смежными и образовывать одно ядрышко (верхняя клетка рис. 3А) или могут быть раздельными, образуя два ядрышка (фиг. 3А нижняя клетка). Примеры на рисунке 3 представлены из rDNA SNP-FISH с использованием наборов зондов, нацеленных только на два SNP (два SNP ITS1), демонстрируя, что для rDNA SNP-FISH необходимы только два SNP. Тем не менее, более устойчивые сигналы наблюдаются при использовании зондов, нацеленных на все четыре SNP¹³.

Отрицательный контроль является важным включением в этот анализ, чтобы подтвердить, что зонды не вступают в перекрестную реакцию с неправильной мишенью SNP, особенно при первом устранении неполадок метода. Контроль с отрицательной Х-хромосомой включает в себя любое состояние, при котором отсутствует рДНК Х-хромосомы, например, у мужчин есть Х-хромосома с делецией рДНК. Ожидается, что контрольные группы с отрицательной Х-хромосомой будут обнаруживать только сигнал Y-рРНК и не будет обнаруживать X-рРНК (рис. 3B). Контроль отрицательной Y-хромосомы включает любое состояние, при котором отсутствует рДНК Y-хромосомы. Примерами этих состояний являются любые женские ткани XX, ткани самцов, лишенных Y-хромосомы, или самцов, несущих Y-хромосому с делецией рДНК¹⁵. Ожидается, что контрольные группы с отрицательной Y-хромосомой будут обнаруживать только сигнал X-рРНК и не будут иметь обнаруживаемого сигнала Y-рРНК (рис. 3C). Обратите внимание, что эти элементы управления важны не только для определения специфичности пробника, но и для определения фона сигнала или артефактов. Любые новые зонды или условия анализа, которые обеспечивают специфичность в таких контрольных группах, могут быть точно использованы для обнаружения локус-специфичной транскрипции рДНК.

Различные генетические условия, условия развития или условия окружающей среды могут изменить вероятность того, что рДНК транскрибируется исключительно из локуса рДНК Y-хромосомы^13,17. Частота транскрипции рДНК из одного или нескольких локусов может быть количественно определена и напрямую сравнена между образцами. Для количественного сравнения различий в транскрипции локуса рДНК каждая клетка должна быть индивидуально классифицирована как Y-доминантная, ко-доминантная или X-доминантная. Клетки классифицируются как Y- и X-доминантные только в том случае, если обнаружен только соответствующий сигнал. Любая клетка с сигналами рРНК Y и X считается ко-доминантной, даже если один сигнал намного слабее другого. Таким образом, ячейки, содержащие очень сильные сигналы X и Y, качественно считаются такими же, как ячейки с сильными сигналами Y и слабыми X или сильными сигналами X и слабыми Y. Общий процент всех клеток во всех образцах в каждой категории может быть сравнен между образцами с помощью критерия хи-квадрат. Несмотря на то, что этот анализ хорошо подходит для качественного определения того, транскрибируется ли конкретный локус рДНК или нет, мы не наблюдали последовательных оценок между образцами при прямом количественном определении интенсивности флуоресценции отдельных сигналов SNP-FISH. Таким образом, мы не рекомендуем проводить количественные оценки интенсивности сигнала FISH между образцами или относительной интенсивности сигналов X и Y рДНК в пределах одной клетки. Источник этого несоответствия в интенсивности флуоресценции неясен, хотя это может быть связано с неэффективным связыванием замаскированных зондов, которые не связываются со всеми мишенями рРНК.

Рисунок 1: Схема метода SNP-FISH. (А) Традиционные антисмысловые олигонуклеотидные зонды FISH вступают в перекрестную реакцию с нецелевыми РНК, которые отличаются только одним нуклеотидом. (B) В методе SNP-FISH используется олигонуклеотид комплементарной маски, связанный с 3'-областью олигонуклеотидного зонда. Маска оставляет только 10 нуклеотидов свободными для связывания с целевой последовательностью. Немаскированная зондовая область не может стабильно связываться с нецелевыми последовательностями, которые отличаются одним или несколькими нуклеотидами. Маска диссоциирует от зонда после того, как зонд связывается с мишенью, обеспечивая стабильную связь между зондом и мишенью. (C) По-разному меченые парные SNP-зонды в сочетании с общей маской специфически связываются с мишенями, которые отличаются одним нуклеотидом без перекрестной реакции. (D) Несколько зондов могут быть объединены вместе, чтобы специфично помечать различные гаплотипы рРНК. Были охарактеризованы четыре различия SNP между локусами X и Y рДНК в штамме y¹w¹ Drosophila melanogaster . Один SNP в 18S рРНК, один в 28S рРНК и два в ITS1 части пре-рРНК. Отображаются X- и Y-специфичные гаплотипы рРНК, используемые для SNP-FISH. Зонды, нацеленные на вариант X-рДНК на четырех однонуклеотидных полиморфизах рРНК, конъюгируются с общим флуорофором (зеленым), а зонды, нацеленные на варианты Y-рДНК, конъюгируются с другим флуорофором (пурпурным). Для каждого SNP используется общая маска (всего четыре). SNP-специфическое связывание зонда в каждой позиции SNP на рРНК может специфично помечать рРНК из локусов X- и Y-рДНК с помощью до четырех олигонуклеотидных зондов FISH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Примеры результатов секвенирования SNP гомозиготной и гетерозиготной рДНК. Пример хроматограммы секвенирования из 18S SNP секвенирования ДНК из (А) женских и (В) мужских образцов. Позиция 18S SNP обозначена звездочкой (*). Одиночный сигнал тимина (Т) для положения SNP в женском образце указывает на наличие тимина в положении SNP в локусе рДНК X-хромосомы. Двойной сигнал в положении SNP, разделенный между тимином и цитозином (C) в мужском образце, указывает на наличие цитозина в положении SNP в локусе рДНК Y-хромосомы (что можно предположить из знания о том, что тимин находится в локусе X-хромосомы). Результаты секвенирования просматривали с помощью ApE – программного обеспечения для редактирования плазмид¹⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Примеры результатов SNP-FISH на яичках дрозофилы с использованием только двух наборов зондов SNP-FISH. Примеры SNP FISH в яичках животных с (A) как X, так и Y рДНК, (B) только Y рDNA или (C) только X рDNA. В этих примерах использовались только наборы зондов, маркирующие два SNP рРНК ITS1, демонстрируя, что рРНК SNP FISH работает всего с двумя целевыми SNP. Половые клетки идентифицируются по их большому круглому ядру, а соматические клетки — по их меньшему и менее круглому ядру. Стволовые клетки зародышевой линии идентифицируются по их положению непосредственно рядом с соматическим хабом, отмеченным звездочкой (*). Половые клетки, которые транскрибируют рДНК из локусов рДНК X и Y, идентифицируются ядерными сигналами FISH как X, так и Y (белые пунктирные круги, A-A''). Половые клетки, которые транскрибируют ДНК только из локуса Y-рДНК, имеют только Y-ядерный сигнал FISH (желтый пунктирный круг). Соматические клетки, экспрессирующие только Y, помечены красной стрелкой. Искусственное совместное мечение локусов X- и Y-рДНК можно наблюдать в соматическом хабе (желтая стрелка). Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: последовательность рРНК локуса Х-хромосомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В данной статье мы описываем метод использования SNP-FISH для различения транскриптов 45S рРНК, полученных из локусов рДНК X и Y хромосомы в тканях Drosophila melanogaster . Наиболее важным шагом в этом протоколе является точное генотипирование 45S SNP для использования в качестве мишеней SNP-FISH. Мы предоставляем праймеры и протокол для известного 45S SNP генотипа Drosophila 45S, но другие методы секвенирования могут выявить новые SNP, которые могут быть использованы в качестве альтернативы для анализа. Любые позиции SNP, обнаруженные идентичными между локусами рДНК X и Y-хромосомы (т.е. в образцах мужской ДНК существует один пик секвенирования), не могут быть использованы для SNP FISH. Некоторые позиции SNP могут быть признаны неоднородными в пределах одного локуса рДНК (т.е. результаты секвенирования не дают ни одного варианта SNP для образцов XX или дают только очень незначительный второй пик секвенирования в образцах XY). SNP, которые являются гетерогенными в пределах одного локуса рДНК, также не подходят для этого анализа, поскольку один из вариантов будет общим для двух локусов рДНК, что делает транскрипцию из одного или нескольких локусов неразличимой. Кроме того, благодаря хранению спермы²⁰ у самок, ДНК, выделенная от спаренных самок, может содержать рДНК Y-хромосомы. Таким образом, крайне важно, чтобы для анализа секвенирования XX использовались неспаренные самки. Важно отметить, что этот метод требует, по крайней мере, двух хромосом-специфичных SNP, чтобы позволить по меньшей мере двум локус-специфичным зондам связываться с каждой молекулой рРНК для детектирования, ограничивая его применение локусами рДНК по меньшей мере двумя различающими SNP между ними. Наличие большего количества SNP позволяет большему количеству зондов связываться с каждой рРНК и может обеспечить большую эффективность сигнала. Интересно, что этот метод помечает рРНК только в ядрышке, несмотря на то, что две пары зондов нацелены на SNP в 18S и 28S рРНК, которые экспортируются в цитоплазму (рРНК, содержащая два сайта-мишени ITS1, существует только в ядрышке). Отсутствие цитоплазматического сигнала FISH предполагает две неисключительные возможности: 1) одних только зондов 18S и 28S недостаточно для обнаружения цитоплазматической рРНК, возможно, потому, что рРНК более рассеяна по всей цитоплазме, чем в ядрышке, или 2) существует более низкая эффективность связывания зонда с рРНК, интегрированными в зрелые рибосомные субъединицы, чем с необработанной 45S рРНК. Дополнительные SNP в составе 18S и 28S рРНК могут обеспечить SNP-чувствительное FISH обнаружение цитоплазматических рРНК.

Другие методы оценки локус-специфичной транскрипции рРНК включают подходы к секвенированию рРНК, которые дифференцируют экспрессию вариантов рРНК, отнесенных к конкретным локусам⁶. Аналогичным образом, кПЦР может дифференцированно оценивать экспрессию вариантов рРНК, которые достаточно различны, чтобы обеспечить уникальное обнаружение ^5,21, хотя неясно, представляет ли подавление этих вариантов подавление всего локуса рДНК. Хотя эти методы могут быть эффективными для количественной оценки экспрессии конкретных вариантов рРНК, они не могут быть выполнены с разрешением для одной клетки. Гетерогенность сайленсинга рДНК Х-хромосомы в тканях дрозофилы позволяет предположить, что в транскрипции локуса рДНК¹⁷ существует сильная межклеточная изменчивость, и подчеркивает необходимость в методах, которые могут объяснить эту изменчивость. Признаки визуализации, связанные с активной транскрипцией в локусах рДНК, такие как вариант гистона H3.3¹⁰ или фактор транскрипции Pol I UBF²², были использованы для идентификации локус-специфичной транскрипции рРНК с разрешением одной клетки. Тем не менее, оба этих метода требуют конденсированных хромосом митотических клеток для того, чтобы различать транскрипцию, происходящую в любом конкретном локусе рДНК. В клетках дрозофилы локусы рДНК на Х- и Y-хромосомах могут быть идентифицированы по форме хромосомы¹⁰, но идентификация транскрипционно активных локусов рДНК в клетках человека также требует совместного окрашивания с хромосомно-специфичными метками²². Метод SNP-FISH не требует ни хромосомно-специфического ко-мечения, ни мечения транскрипционных маркеров и может быть оценен на любой стадии клеточного цикла или постмитотических клетках, обеспечивая гибкость для использования в различных тканях и экспериментальных условиях.

Данный метод snp-fish с рРНК может быть модифицирован для использования с другими SNP, которые различают рРНК дрозофилы , или потенциально может быть применен к SNP, которые различают локусы рДНК у других организмов. Применение этого метода к организмам с более чем двумя локусами рДНК потребует, чтобы локус имел уникальный вариант варианта рДНК гаплотип, содержащий, по меньшей мере, два SNP, которые отсутствуют ни в одном другом локусе рДНК и которые являются общими для всех 45S копий в этом локусе. Это требование означает, что метод сможет указать транскрипцию только из одного конкретного локуса по сравнению со всеми остальными (т.е. однонуклеотидные полиморфизмы рРНК из локуса 1 по сравнению с однонуклеотидными полиморфизмами, общими для локусов 2 и 3). Однако, если каждый локус рДНК имеет совместимый гаплотип, можно объединить несколько экспериментов для индивидуальной оценки транскрипции каждого локуса по одному. Относительно низкая жесткость температуры гибридизации (37 °C), используемой в этом протоколе, позволяет обеспечить прочное связывание зонда, особенно учитывая короткую, немаскированную часть зонда, хотя было показано, что гибридизация при более высоких температурах (50-75 °C) усиливает сигнал некоторых зондов FISH²³. Более высокие температуры гибридизации могут увеличить смещение нити маски и увеличить связывание зонда, но слишком высокие температуры могут дестабилизировать связывание зонда-маски и потерять SNP-специфичность. По этой причине мы не ожидаем, что SNP-FISH будет специфично маркировать ДНК, потому что температуры, необходимые для плавления двухцепочечных мишеней ДНК для обеспечения связывания зонда, также дестабилизируют связывание зонда с маской и устраняют SNP-чувствительную специфичность мишени. Тем не менее, оптимизация температуры гибридизации для новых зондов SNP рРНК может усилить сигнал, особенно когда доступны только два сайта SNP. Потеря сайленсинга рДНК Х-хромосомы связана со снижением числа копий рДНК у дрозофилы¹³, поэтому разработка анализов SNP-FISH для характеристики локус-специфичной транскрипции рРНК в других системах может служить полезным инструментом для оценки целостности рДНК и функции рибосом. Кроме того, этот метод был модифицирован для использования с вариантом делеции у дрозофилы, и этот вариант с одной структурной рРНК был пригоден для детектирования (возможно, из-за большей аффинности связывания мишени без зондовой маски)¹⁷. Использование структурных вариантов рРНК в сочетании с вариантами SNP расширяет возможности применения в других системах. Поскольку механизмы, регулирующие транскрипцию локуса рДНК, остаются в значительной степени неясными, гибкость и потенциальная адаптивность rRNA SNP-FISH к другим системам делают его мощным инструментом для будущих исследований по изучению транскрипции рРНК.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Термоамплификатор	Bio Rad	12015382	Можно использовать любой термоамплификатор
0,2 мл 8 полосковых плоских пробирок для ПЦР	VWR	89133-912	Можно использовать любые совместимые пробирки
1 кб ДНК-лестница	NEB	N3232S	Для использования при проверке секвенирования размера ампликона ПЦР методом гель-электрофореза
1,5 мл градуированные микроцентрифужные пробирки	США Scientific	1615-5510	Любая сертифицированная пробирка без РНКазы подойдет
для 2 мМ dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	используется для гель-электрофореза. Можно использовать любой буфер TAE.
5M NaCl			Любой NaCl может быть использован или приготовлен из любого источника
Агароза	VWR	97064-250	Любая агароза может быть использована
ApE - программное обеспечение для редактирования плазмид	Н/Д	Н/Д
Прозрачный лак			Любой лак для ногтей из любого розничного продавца может быть использован
Покровное стекло, No 1 Толщина	Thomas Scientific	6672A38
Деионизированный формамид	Fisher Scientific	NC9569627
декстрана сульфат натрия	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1081
Дюмон #5 щипцы	Fine Science Tools	11252-20	Используется для препарирования образцов
ЭДТА (0,5М), Ph 8,0	ThermoFisher Scientific	R1021	Можно использовать любой сопоставимый продукт
Этанол	VWR	89125-172	Можно использовать любой 200-градусный этанол. Используется для разбавления до 70% этанола для пермеабилизации и очистки при состояниях, не содержащих Rnase
Бромид этидия	ThermoFisher Scientific	15585011
Горизонтальная система электрофореза Mini Gel Система электрофореза	Fisher	Scientific 14-955-170	Любая система гель-электрофореза может быть использована
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Чашка для окрашивания	микротестов Electron Микроскопия Sciences	71564	Используется для препарирования образцов
Шейкер для нутатирования	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	Можно использовать любой шейкер для нутатирования
Парапленка	США Scientific	3023-4526
Фосфатно-солевой буфер (10X) pH 7,4, РНКаза без РНКазы	Life Technologies	AM9624
Пирс 16% формальдегид (w/v), без метанола	Life Technologies	28908
Прецизионная универсальная водяная баня	Life Technologies	TSGP02	Можно использовать любую водяную баню
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Любой набор для экстракции геля Можно использовать
Раствор рекомбинантной протеиназы K (20 мг/мл)	Invitrogen	AM2546	Любой сопоставимый продукт может быть использован
без РНАЗ UltraPure BSA	ThermoFisher Scientific	AM2618
S. cerevisiae тРНК	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), РНКаза без РНКазы	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	15567027	Можно использовать
любой сопоставимый продуктUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977023
комплекс ванадилрибонуклеозидов	NEB	S1402S
VECTASHIELD монтажная среда с DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost Microscope Slide	VWR	48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster линия	Bloomington Drosophila Stock Center	1495
Zeiss LSM 980 Конфокальный микроскоп	Zeiss Микроскопия		Zeiss Можно использовать любой конфокальный микроскоп с совместимым излучением и детектированием
Zeiss Stemi 2000-C Стереомикроскоп и источник света	Микроскоп Центральный	455053	Можно использовать любой стеромикроскоп