Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Надёжный и воспроизводимый протокол для генерации органоидов из нейронных трубок из эмбриональных стволовых клеток одной мыши

467 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67883

⸱

19 декабря 2025 г.

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

В этой статье

Краткое содержание

Трёхмерные органоиды нейронных трубок (НТО), полученные из эмбриональных стволовых клеток мышей, являются ценными инструментами для изучения центральной нервной системы на ранних этапах развития. Здесь представлена пошаговая демонстрация оптимизированного протокола для культивирования NTO in vitro, обеспечивающего стабильные условия культуры и стратегии устранения неполадок для надежной и воспроизводимой генерации NTO.

Аннотация

Развитие млекопитающих — это чрезвычайно сложный процесс, характеризующийся необходимостью точной концентрационно-зависимой от времени сигнализации для правильного формирования узоров и морфогенеза. Несмотря на значительный технологический прогресс и собранные знания, многие аспекты развития млекопитающих остаются недостижимыми. При исследовании всего организма становится сложно разгадать влияние отдельных путей или механизм, с помощью которого внешние стимулы направляют помехи окружающих тканей и факторов. Для решения этой сложности появились трёхмерные (3D) модели in vitro , такие как органоиды, которые стали ценными инструментами. Органоиды, полученные из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), обладают тканеподобными чертами, которые очень похожи на их in vivo аналогов по паттернам экспрессии и функциональности. Важно, что они обеспечивают доступ к манипуляциям и обширным биологическим исследованиям в контролируемых экспериментальных условиях. Несмотря на происхождение из плюрипотентных культур, органоидные системы часто демонстрируют гетерогенность и значительную вариабельность, что ограничивает их полезность при изучении сложных и сложных биологических вопросов. Поэтому существует острая необходимость в подробных протоколах, направленных на гармонизацию процедур, приводящих к высококачественным воспроизводимым данным, сокращению используемых материалов и, что важно, позволяет исследовать запутанные явления. В этом контексте здесь представлен оптимизированный протокол культивирования нейротрубочных органоидов (НТО) in vitro . Обеспечивая стабильные условия культуры и предлагая комплексные стратегии устранения неполадок, этот протокол обеспечивает надёжную и воспроизводимую генерацию НТО, которые служат адекватной моделью для изучения актуальных научных вопросов, включая механизмы нейронной индукции, паттернинг и раннее развитие центральной нервной системы.

Введение

Развитие млекопитающих, начинающееся с одной тотипотентной стволовой клетки, представляет собой сложный процесс, включающий индукцию формирования паттернов иморфогенез 1,2. Это развитие требует строго регулируемых клеточных программ для управления динамическими взаимодействиями между клетками и их средой. Стволовые клетки обладают внутренней способностью воспринимать, интегрировать и реагировать на системные и локальные сигналы, включая градиентыморфогенов 3, механическиеграницы 4, клеточное размножение и ремоделирование окружающейсреды 5. Внешние пространственно-временные сигналы также стимулируют многоклеточные ответы, изначально в однородных тканях, чтобы обеспечить точное формирование сложных структур. Стволовые клетки, отличающиеся своими способностями ксамообновлению 6,7 и дифференцировке, играют ключевую роль в эмбриональном развитии и восстановлении взрослых тканей, основными типами которых являются эмбриональные стволовые клетки (ESC), взрослые стволовые клетки (ASC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).

ESC извлекаются из внутренней клеточной массы (ICM) бластоцисты и обычно культивируются в двумерной (2D) среде на питательных клетках или внеклеточном матриксе с использованием специальных культурных сред для поддержания ихплюрипотентности 8. В последние годы потребность в более реалистичных условиях и технологиях клеточных культур резко возросла, поэтому были созданы трёхмерные (3D) модели клеток и тканей для изучения фундаментальных биомедицинскихпроцессов 9. Особенно в биологии развития эти трёхмерные модели, такие как органоиды, предлагают надёжный метод моделирования морфогенеза тканей и органогенеза ex vivo9. Органоиды формируются через самоорганизацию пролиферирующихся стволовых клеток, которые спонтанно развиваются в сложные трёхмерные структуры посредством нарушения симметрии и формирования узоров. Этот процесс похож, хотя и не идентичен тому, что наблюдается in vivo, и в основном происходит без внешнего руководства, а обусловлен внутренней динамикой ивзаимодействиями 10. Поскольку органоиды близко имитируют структуру и функции реальных органов, они могут дать более точное представление биологии млекопитающих по сравнению с традиционными двумерными клеточнымикультурами 11. Кроме того, одним из основных преимуществ является этическое преимущество, поскольку органоиды снижают потребность в животных моделях, решая вопросы, связанные с испытаниямина животных 12,13. Кроме того, органоиды предоставляют платформу для высокопроизводительного скрининга лекарств, улучшая прогнозирование эффективности и токсичности препарата. Однако существует и ряд сложностей, связанных с использованием органоидов. Хотя они более реалистичны, чем двумерные культуры, они не полностью воспроизводят сложность и взаимодействия целых органов в живоморганизме 14. Кроме того, между органоидами могут наблюдаться значительные вариативности, даже если они получены из одного типа клеток, что приводит к несоответствиям в экспериментальныхрезультатах 15. Поэтому культивирование органоидов надёжным и воспроизводимым образом крайне важно и требует продвинутых технических навыков, специализированного оборудования и детальных протоколов.

Нервная система — это сложная сеть, отвечающая за координацию действий и обработку сенсорной информации путём передачи и приема сигналов по всему телу, тем самым контролируя и координируя все необходимые функции, включая движение, ощущения, мышление и автономные функции, такие как сердцебиение и пищеварение. Предшественником центральной нервной системы, состоящей из мозга и спинного мозга, является нервная трубка. Крайне важно понимать, как формируются и функционируют нейронные структуры в раннем развитии нейронных трубок, чтобы получить представление о различных неврологических расстройствах и нарушениях развития. Нейроразвивающие расстройства сложно изучать in vivo, особенно если они происходят от людей по этическим соображениям. Нейроорганоиды, такие как мозговыеорганоиды 16,17, значительно расширили понимание развития и заболеваний нервной системы, предоставляя универсальные и доступные модели, которые близко имитируют человеческую мозговую ткань. Эти трёхмерные структуры, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), воспроизводят различные аспекты развития мозга, включая формирование отдельных областей мозга, клеточное разнообразие и сложные нейронныесети 16,18,19. Позволяя исследователям наблюдать стадии развития в реальном времени и изучать ключевые регуляторные механизмы, эти органоиды дают глубокое понимание нормального развития мозга. Органоиды мозга также позволяют моделироватьнейроразвивающие 19 и нейродегенеративныезаболевания 20, такие как микроцефалия16,21, инфекция вирусомЗика 22, расстройства аутистическогоспектра 23 и другие, проясняя механизмы заболевания и выявляя потенциальные терапевтические цели. Кроме того, мозговые органоиды служат ценными платформами для тестирования и разработки лекарств, облегчая оценку эффективности и токсичности препарата в среде, похожей на человеческий мозг, и ускоряя персонализированные подходы к медицине. Кроме того, они обеспечивают контролируемую среду для изучения взаимодействия генов и окружающей среды, расширяя понимание сложных заболеваний, возникающих в результате взаимодействия генетических и экологических факторов. Однако, поскольку нейроорганоиды, как и мозговые органоиды, обычно формируются из совокуплений клеток, они часто демонстрируют значительную клеточную гетерогенность и вариабельность экспериментальных результатов, что, в свою очередь, влияет на интерпретацию полученных данных, создавая серьёзную сложность дляисследователей 17. По этой причине оптимизация протокола и точные критерии контроля качества критически важны для ослабления ценных данных, которые адекватно отражают состояние in vivo.

Майнхардт и егоколлеги оказали решающее влияние, впервые сообщив о протоколе клональных нейроорганоидов, имитирующих раннее развитие нейронных трубок, сформированного из отдельных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), что значительно минимизирует межорганоидную гетерогенность. Эта инновация позволяет исследователям изучать процессы и механизмы развития, а также нейронные паттерны в точной и определённой среде с исключительной разрешающей способностью. До сих пор многие лаборатории разрабатывали нейроорганоиды, в основном мышиного или человеческого происхождения, имитирующие различные части нейронной трубки и её развитие, как изложено встатье 25. Однако, исходя из имеющейся информации, протокол, установленный Майнхардтом и др.24 , является единственным методом, при котором NTO надежно формируются из одной клетки, самоорганизуются и эффективно формируются в дорсовентральные судьбы после одного глобального импульса ретиноевой кислоты (РА) без добавления других вентрализующих факторов, таких как Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26, или использование микрофлюидных камер, предоставляющих пространственную информацию за счёт формирования градиента. Протокол, приведённый здесь, был адаптирован из Майнхардта и др.24 , как указано в Краммере и др.26. В этом протоколе одиночные мышиные ESC посеиваются в матриксе клеточной культуры и подвергаются определённым условиям нейродифференцировки. В течение двух дней эти клетки клонально расширяются и эпителиализируются, формируя 3D-кругло-эллипсоидную структуру с одним просветом и апикально-базально стратификационными клетками вокруг него. На второй день глобально применяемый 18-часовой импульс сигнальной молекулы РА усиливает нейронную дифференциацию, позади переносит НТО от среднего мозга до уровня заднего мозга/шейного отдела спинного мозга и к шестому дню вызывает формирование единой функциональной платформы, которая формирует НТО от вентрального к дорсальному.

Оптимизированный протокол обладает несколькими ключевыми преимуществами. Он обеспечивает устойчивую эпителизацию в первые три дня и образует относительно небольшие сферические ткани диаметром примерно 200 мкм, каждая из которых содержит один просвет. Органоиды образуются клонально из отдельных клеток и хранятся в безсывороточной, химически определённой культурной среде. В течение шести дней достигается постепенная нейронная дифференцировка от плюрипотентных культур, в результате чего органоиды к 6-му дню демонстрируют переднюю тождественность среднего мозга и дорсовентрально появляются структуры, похожие на задний или шейный мозг, после глобальногоРА импульса 26.

Несколько аспектов были адаптированы и отличаются от первоначальногопротокола 22,25 для повышения воспроизводимости и пропускной способности. К ним относятся модифицированные условия культуры ESC, уменьшение количества входных клеток, улучшенная среда дифференцировки и скорректированный протокол дифференцировки, который исключает добавление Ноггина в дни 0-2 (уже применяется в26). Кроме того, плотность посева оптимизирована для использования в плитах с 96 скважинами, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ. В совокупности эти доработки привели к увеличению эффективности формирования и паттернинга NTO на 40% — с первоначальных ~40%24 до нынешних ~80%26 в обновлённой версии.

Здесь (рисунок 1) приведено подробное описание оптимизированного протокола, который позволяет обеспечить надёжную и воспроизводимую генерацию NTO в матрице клеточной культуры. Протокол охватывает все этапы обработки NTO — от первоначального внедрения ESC для дифференциационных тестов до последующего обслуживания, фиксации и анализа. Также включены рекомендации по контролю качества через ежедневную визуальную оценку морфологии NTO, а также критическую характеристику идентичности органоидов с помощью окрашивания антител для проверки правильного паттерна и нейронной дифференциации. Кроме того, предлагаются комплексные подходы к устранению неполадок, позволяющие проводить критическую оценку на каждом этапе протокола, что необходимо для обеспечения воспроизводимости и надёжности экспериментальных протоколов. Эти подробные инструкции помогают выявлять и решать возможные проблемы, минимизировать ошибки и оптимизировать результаты. Это крайне важно для поддержания целостности научных экспериментов и для того, чтобы другие учёные могли успешно воспроизводить работу и делать всесторонние выводы на основе полученных данных, тем самым продвигая область.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Обзор протокола. (A) Passing ESC (см. шаг 1.1). (B) Аликотирование матрицы клеточной культуры и посева отдельных ЭСК для дифференцировки в НТО (см. шаг 1.2). (C) Алицитирование лечения РА и РА (см. шаг 2). (D) Удаление РА и регулярная ежедневная замена среды (см. шаг 3). Эта фигура была создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно проверяйте клетки и НТО для оценки качества перед любой дальнейшей процедурой (замена среды, лечение, фиксация и т.д.). Все процедуры, требующие прямого воздействия клеток с воздухом, должны выполняться в шкафу для обеспечения стерильности и предотвращения загрязнения культуры.

1. Обслуживание, передача и засев мышиных ESC для дифференцировки NTO

  1. Пассаж
    1. Поддерживайте ESC в контейнерах для клеточной культуры или в колодцах с 6-колодной пластиной, предварительно покрытой 0,15% желатином, в течение 30 минут при 37 °C.
    2. Проходные ESC каждые 2-3 дня, с ежедневной заменой среднего вещества со второго дня.
    3. Предварительно нагрейте все реагенты (средне, PBS, ферментный раствор) при минимуме 21 °C и максимум 37 °C перед использованием.
    4. Проверьте клетки под фазово-контрастным микроскопом (см. репрезентативные изображения, рисунок 2). Убедитесь, что колонии имеют подходящий размер и правильную морфологию (рисунок 2A), а также убедитесь, что они прилипают к дну блюда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если дифференцировано более 10% мышиных ЭСК отбросьте (рисунок 2B), и подготовьте свежеразмораженную культуру, которую следует пройти как минимум дважды перед засевом ESC для дифференциационного теста. Опытные исследователи могут судить по визуальной оценке (см. также Mulas и др.28) или с помощью окрашивания антител для экспрессии маркеров (например, OCT4, см. также Ying и др.29).
    5. Откройте крышку миски/тарелки, слегка наклоните её и аккуратно впитывайте среду. Держать клетки вне инкубатора как можно скорее. Оставьте клетки без субудита как можно короче, чтобы не высыхать культуру.
    6. Промывайте колонии 500 мкл предварительно подогреного PBS (добавьте в клетки в одну яме пластины с 6 колодцами) и сразу же снова аспирируйте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг крайне важен, потому что: i) перенос среды ESC (2iLIF) должен быть избежан до того, как дифференциационный анализ (или образование NTO будет затруднено), ii) FBS или BSA в культурной среде могут остановить диссоциацию. Это относится к ESC, культивируемым в другой среде ESC, содержащим FBS или BSA.
    7. Добавьте 500 мкл предварительно нагретого ферментного раствора и перенесите клетки обратно в инкубатор.
    8. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 3 минут с помощью таймера.
    9. После инкубации достаньте пластину и проверьте клетки под микроскопом фазового контраста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ESC должны были отделяться от культивной пластины; если нет, постучите по тарелке крепко, но осторожно (рисунок 2C).
    10. Добавьте 1 мл среды N2B27 (Таблица 1), нанося его непосредственно на ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении среды (N2B27) глутамин поддерживают максимум 5-10 минут при 37 °C, желательно при комнатной температуре. ESC следует промывать с тарелки, оставляя «пустые» участки в посевной чаше.
    11. Используйте пипетку P1000 и слегка наклоните тарелку, чтобы все колонии, прилипшие к культурной чаше, можно было смыть.
    12. Чтобы отделить сгустки клеток, слегка наклоните тарелку, разместите кончик пипетки (P1000) в центр блюда, прижавите кончик к дну блюда, но немного отклонившись от перпендикулярной оси, и промите ячейки наружу. Повторяйте пять-десять раз, чтобы разрушить клеточные сгустки.
    13. Проверьте, правильно ли клетки диссоциированы на отдельные клетки под фазовым контрастным микроскопом (рисунок 2D), и повторяйте, если ещё остаются сгустки.
    14. После полной диссоциации переместите клеточную суспензию в чистую стерильную коническую центрифугную трубку объёмом 15 мл, промыйте пустую яму, в которой клетки были культивированы, с 1 мл среды N2B27, и переместите в ту же коническую центрифугную трубку, что и клеткавая суспензия.
    15. Вращение клеток в течение 5 минут при 453 г в ультрацентрифугах.
    16. Аккуратно аспирируйте супернатант.
    17. Суспензировать клетки в соответствующем числе среды N2B27 (например, 1 мл) и подсчитать клетки (см. таблицу 2 для рекомендуемого количества клеток для анализа дифференцировки в NTO).
  2. Дифференциация ЭСК в органоиды нейронных трубок (НТО)
    1. Алицитирование матрицы клеточной культуры
      1. Разморозить бутылку с матрицей клеточной культуры на льду на ночь при 4 °C (никогда при комнатной температуре и не размораживая вручную). Не оставляйте матрицу клеточной культуры при 4 °C дольше, чем необходимо; Aliquot и заморозка как можно скорее, чтобы сохранить его функциональность.
      2. В шкафу для биобезопасности положите на лёд микроцентрифугные трубки объемом 1,5-2 мл для предварительного охлаждения, а бутылку с матрицой клеточной культуры храните на свежем льду.
      3. Аккуратно смешайте размораживаемую матрицу культуры, чтобы избежать образования пузырей, так как пузырьки могут вызвать отслоение от колодца/чашки после желе.
      4. Аликвот клеточную культуру при желаемом объёме (рекомендуется 0,5–1 мл) и замораживайте при -20 °C до дальнейшего использования. Избегайте замены наконечника между аликвотами, так как наконечники комнатной температуры могут привести к затвердеванию матрицы клеточной культуры внутри, что приведёт к значительной потере. Вместо этого охладите кончики пипетки до 4 °C, храня их в холодильнике перед использованием.
    2. Посев отдельных клеток в матриксе клеточной культуры
      1. Количественно определите количество необходимых клеток (100 клеток/мкл матрицы клеточной культуры, см. Таблицу 2).
      2. Перенесите соответствующий номер ячейки (суспензия ячейки) в чистую коническую центрифугную трубку объёмом 15 мл и добавьте 1 мл N2B27.
      3. Вращите клетки вниз в течение 5 минут при 453 г в центрифугах.
      4. Аспирируйте супернатант и поместите коническую центрифугу на лёд.
      5. Аккуратно подвесьте клеточную гранулу на льду в соответствующем объеме размораженной и жидкой культурной матрицы, избегая образования пузырьков.
      6. Распределите соответствующее количество суспензии матричной клетки в тонком слое на чашу с стеклянным или пластиковым дном, оптимальную для визуализации (см. таблицу 2, рисунок 3A-C), не касаясь стенок многоколодцевых пластин. Из-за высокого поверхностного натяжения капля матричной культуры клетки может перемещаться из центра ямы в стенки, если они ранее касались, что приводит к недостаточному распределению клеток/НТО.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если используете пластины с несколькими лунками: сначала нарисуйте круг из матрицы клеточной культуры с помощью наконечника пипетки P200 (пластины с 96 ямецами) или наконечника P200, прежде чем «заполнить» её суспензией матрицы клеточной культуры (рисунок 3B).
      7. Поместите многоколодцевую тарелку/тарелку в инкубатор при 37 °C, чтобы матрица клеточной культуры затвердела. Оцените 1 минуту на мкл матрицы клеточной культуры при меньших количествах и максимум 15 минут при 40 мкл и более.
      8. После инкубации достаньте пластину и добавьте соответствующий объём среды (см. таблицу 2). ESC в матриксе клеточной культуры не должны высыхать во время посева для анализа дифференцировки в NTO или при замене среды. После желлификации среду необходимо нанести как можно скорее. Желлификация обычно завершается за 1 минуту при 37 °C на 1 мкл матрици клеточной культуры и максимум 15 минут для 40-100 мкл клеточной культуры при распределении в тонком слое.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать высыхания ESC в матрице клеточной культуры, используйте максимум 8 колодец пластины на 96 лунок с многоканальной пипеткой или одну чашу с стеклянным дном диаметром 35 мм, как и в любой другой многоколодной пластине. Держать клетки вне инкубатора как можно скорее.
      9. Проверьте плотность посева и распределение клеток в матрице культуры клетки под фазово-контрастным микроскопом (рисунок 3C,D). Рекомендуется оптимальная плотность посева (Таблица 2 и Рисунок 3). Однако для некоторых применений, таких как ранний анализ, плотность посева может быть преимуществом до 10 раз выше.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно смешайте суспензию матрицы клеточной культуры клетки, повторно суспензировав наконечником пипетки P300 или P1000 перед посевом для дифференциационного теста, чтобы компенсировать вариативность количества клеток между колодцами/тарелками. Этот этап не рекомендуется перед посевом каждой колодцы для защиты от потери матрици клеточной культуры, так как она может затвердеть и прилипнуть к кончику пипетки.

Таблица 1: Средние компоненты (основание N2B27, 2iLIF, N2B27diff). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Информация о количестве клеток на тарелку, объеме матрицы клеточной культуры, объёме среды и времени желлификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

2. Лечение РА НТО для усиления нейронной дифференциации и индуцирования постериоризации и вентрализации

  1. Алицитная ретиноевая кислота (РА)
    1. Довести порошок полностью транстрансмирного РА до комнатной температуры (хранится при -20 °C).
    2. Восстановить порошок в соответствующем объёме DMSO до конечной концентрации 100 мМ.
    3. Aliquot 1 мкл по 100 мМ RA в одну флакон с винтовой крышкой по 1,5 мл каждый.
    4. Добавьте аргон, пока трубка не станет «полной».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку аргон тяжелее кислорода, он опускается на дно трубки, чтобы закрыть и защитить РА от воздуха. Это ощущается на руках, когда трубка выходит наружу, когда трубка заполнена.
    5. Плотно закройте флакон. РА очень чувствителен к свету и воздуху.
    6. Храните аликвоты в темноте при -80 °C до дальнейшего использования. В качестве альтернативы восстановленный РА можно хранить в микроцентрифугных трубках объёмом 1,5 мл в жидкостиN2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: восстановленный и разбавленный РА можно хранить в холодильнике, если покрыт фольгой, максимум 2 дня.
  2. Лечение РА у НТО в течение 18 часов (рисунок 4A)
    1. Достаньте 1 мкл аликвота с концентрацией 100 мМ при -80 °C и храните в темноте до размораивания при комнатной температуре (например, на ладони или в трубочной стойке в биобезопасном шкафе без включения света).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если аликвоты RA хранятся в жидкостиN 2, немедленно откройте крышку трубки микроцентрифуга, чтобы избежать взрыва, затем снова закройте и перейдите к шагу 2.2.2.
    2. После размораивания добавьте 400 мкл предварительно нагретой среды N2B27diff при концентрации 250 мкм с помощью пипетки P1000. Тщательно перемешайте для достижения однородности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, РА можно восстановить и разбавить в чистой среде DMSO вместо среды N2B27diff, хотя это увеличивает концентрацию DMSO в культуре. При приготовлении среды (N2B27diff) глутамин держится максимум 5-10 минут при 37 °C, а лучше — при комнатной температуре.
    3. Достаньте тарелки/тарелки для выращивания НТО из инкубатора и положите их в стерильный шкаф для биобезопасности.
    4. Изучите растущие НТО под микроскопом фазового контраста. Морфология НТО имеет решающее значение для предоставления информации о жизнеспособности культуры и эффективности эксперимента (рисунок 4B-D).
    5. Снимите крышку тарелки/тарелки и слегка наклоните её в сторону. Аспирируйте среду аккуратно, используя пипетку P200 или аспиратор, не нарушая матрицу клеточной культуры. Держите NTO без среды как можно короче, чтобы избежать высыхания из культуры и/или смеси клеточной культуры.
    6. Добавьте соответствующий объём N2B27diff с раствором RA 250 нМ (см. Таблицу 2), накройте крышкой и перенесите NTO обратно в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, особенно если РА не был полностью смешан, могут образовываться осадки, которые сложнее растворить в нормальном N2B27diff. В этом случае отбросьте аликвот и создайте свежие РА аликвоты, так как в этих осадках концентрация РА неизвестна и неконтролируема.

3. Удаление РА и регулярная ежедневная замена средних средств НТО

  1. Перенесите посевную пластину из инкубатора в стерильный шкаф для биобезопасности.
  2. Снимите крышку и слегка наклоните тарелку в сторону.
  3. Аккуратно аспирируйте N2B27diff, содержащий RA, используя пипетку P200 или аспиратор, не касаясь матрици клеточной культуры.
  4. Добавьте предварительно нагретую PBS (используйте достаточно объёма, чтобы покрыть каплю матрицы клеточной культуры или, как указано в таблице 2), затем снова наклоните пластину и аккуратно удалите, чтобы смыть остатки РА.
  5. Добавьте соответствующий объём N2B27diff (как указано в таблице 2), прокладывая среду вдоль стенки скважины/антенны, чтобы избежать повреждения капли матрицы клеточной культуры.
  6. Заменяйте средний раствор ежедневно следуя шагам 3.1-3.3, затем аккуратно добавьте свежий предварительно подогреный N2B27diff, пипетирая среду на стенку колодца/тарелки, прежде чем вернуть NTO обратно в инкубатор. Прямое и интенсивное пипетирование или добавление холодной среды/PBS на каплю матрицы клеточной культуры может привести к её разрушению и отсоединению от тарелки/тарелки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нарушении путей с помощью малых молекул или рекомбинантных белков важно ежедневно заменять среду. Если препараты должны применяться дольше одного дня, растворы необходимо готовить свежими ежедневно или как минимум каждые два дня для обеспечения стабильности белка и лекарств и сохранения правильных концентраций.

4. Фиксация НТО

ПРИМЕЧАНИЕ: НТО фиксированы, как описано Краммером и др. 26. В зависимости от используемого антитела может потребоваться PFA из разных источников (купленных в магазине, на собственном рынке и т.д.).

  1. Оттаять PFA аликвот при 4 °C ночью.
  2. Довести PFA до комнатной температуры перед использованием.
  3. Если используется более высокая стандартная концентрация PFA, разведите PFA до 4% в среде N2B27diff или PBS в химической вытяжке.
  4. Вынимите NTO из инкубатора и перенесите их в химический капюшон.
  5. Откройте крышку и набавьте 4% PFA в соотношении 1:1 непосредственно к NTO, чтобы получить итоговую концентрацию 2% (например, 100 мкл 4% PFA в 100 мкл N2B27diff в пластине на 96 лунках).
  6. Накройте крышку обратно и инкубируйте NTO в течение 30 минут при комнатной температуре. Установите таймер, так как длительное закрепление может ухудшить эффективность некоторых антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFA токсичен и не должен вдыхаться. Работайте аккуратно и осторожно под химическим каппотом. Некоторые антитела требуют использования специфического PFA или более короткого/оптимизированного времени фиксации.
  7. Через 30 минут снимите крышку и слегка наклоните пластину в сторону, затем выполните шаги 3.3–3.4.
  8. Аккуратно добавьте предварительно нагретый PBS (используйте достаточно объёма, чтобы покрыть каплю матрицы клеточной культуры или как указано в таблице 2) и инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Повторите этот шаг три раза, чтобы удалить все оставшиеся PFA.
  9. После окончательной промывки добавьте соответствующее количество PBS (см. таблицу 2), запечатайте пластину парапленкой и храните при 4 °C до дальнейшего использования.

5. Окрашивание антител у НТО

  1. Окрашивание антител — ценный инструмент для оценки правильной идентичности НТО, а также для успешности анализа/эксперимента. Окрашивание антител может проводиться как описано в Meinhardt et al.24 и Krammer et al.26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если NTO кажутся неоптимальными (рисунок 4E-G) или не показывают правильное пространственно-временное выражение маркеров (рисунок 5–рисунок 7), материал отброшен, так как он не соответствует стандартам качества.
  2. Оставьте раствор блока/проницаемости (1x PBS с 1% BSA и 0,5% Triton-X) при 4 °C и адаптируйтесь к комнатной температуре перед использованием.
  3. Для полного восстановления и анализа в 3D поддерживайте антитела (1 и 2 градуса) при 4 °C как минимум 1, а лучше 2-3 ночи, чтобы обеспечить хорошее проникновение антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-5612-й антител Alexa Fluor может дать более сильный фоновый сигнал в матриксе клеточной культуры в первые три дня дифференциационного теста.

6. Очистка НТО

  1. Готовьтесь кзачистке 26
    1. Завершите процесс окрашивания антител перед началом процедуры очистки (убедитесь, что1-й и 2-йантитела инкубированы и тщательно вымыты).
    2. Добавьте пропилгаллат в очищающий раствор (2 мг пропилгаллята на мл раствора) для минимизации фотоотбеливания НТО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите очищение за 1-2 часа до съёмки, чтобы предотвратить окисление (жидкость превращается из светло-жёлтого/кремового в тёмно-ярко-жёлтый или даже коричневый) или кристаллизацию раствора для очищения. Если происходит кристаллизация, растворяйте их путем добавления PBS в скважину.
  2. pH раствора и меры предосторожности при смешивании
    1. Поддерживайте правильный pH раствора очистки, чтобы избежать быстрого окисления или растворения матрици клеточной культуры.
    2. Избегайте сильного встряхивания или резкого смешивания раствора, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.

7. Анализ НТО

  1. Подготовка к микроскопии
    1. После завершения окрашивания антител и очищения всей ткани используйте конфокальный микроскоп с 10-40x объективами для визуализации.
  2. Визуальная оценка
    1. Используйте визуальную оценку и ручную количественную оценку для эффективного определения адекватной экспрессии нейронных маркеров и организации дорсовентральных органов.
  3. Программное обеспечение для 3D-анализа
    1. Для 3D-анализа используйте программное обеспечение, такое как CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) или аналогичный инструмент для оценки пространственных маркеров и структурных деталей.
  4. Проверка идентичности NTO
    1. Подтвердить правильную идентичность НТО, оценив временную экспрессию нейронных маркеров и пространственно-временную экспрессию специфических дорсовентральных маркеров. Этот шаг необходим для того, чтобы убедиться, что дифференциационный анализ был успешным до дальнейших исследований.
  5. Аспекты характеристики: См. рисунок 4, а также рисунок 6 и 7 , чтобы проверить следующие критические аспекты успеха культуры:
    1. Обратитесь к рисунку 4 и окрашиванию ZO-1, показанных в Meinhardt et al.24 , чтобы подтвердить успешную эпителизацию и формирование просвета.
    2. Успешная нейронная дифференциация характеризуется понижением OCT4 и повышением SOX1, за которым следует экспрессия β3TUBULIN (подробно описанов статье 24). Обратитесь к рисункам 6 и 7 для подтверждения успешной нейронной дифференцировки.
    3. Дорсовентральная форма подтверждается наличием вентральной пластины FOXA2+/SHH+ и экспрессией PAX3+ на противоположном дорсальном полюсе (подробное вентральное оформление в26). См. рисунок 6 и 7 для подтверждения успешного дорсовентрального паттерна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ESC мыши R1 использовались для всех представительных примеров на иллюстрациях, представленных в этой рукописи. Другие упомянутые мышиные ESC могут проявлять незначительные различия во времени эпителизации, нейронной дифференцировке или эффективности паттернирования при засеване для NTO, однако результаты не должны существенно отличаться от приведённых данных.

Только качественные ESC (рисунок 2A), засеянные с соответствующей плотно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь представлены несколько оптимизационных адаптаций и улучшений исходного протокола для создания высококачественных NTO для облегчения стандартизации между лабораториями. Ключевые модификации включают различные условия культуры ESC, уменьшение количества входных ячеек, улучшенную среду дифференцирования, модифицированный протокол дифференцировки и корректировку плотности посева для высокопроизводительного анализа с использованием многоколодных пластин. Ряд аспектов протокола особенно ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить нынешних и бывших членов лаборатории Танака за их поддержку и обсуждения при разработке этого протокола. Особенно благодарим А. Пельцля за критическое изучение рукописи, внесённые советы и помощь со схемами, а также Э. Хацидаки за критическое чтение рукописи, редактирование и поддержку с схемами, а также за получение финансирования PUD 25 совместно с Юргеном А. Кноблихом. Эта публикация была профинансирована Австрийским научным фондом (FWF): «Самостоятельный проект публикации номер PUD 25». Кроме того, этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение ERC AdG 742046), а также от Австрийского научного фонда (FWF) [10.55776/ F7803-B] (модуляция стволовых клеток). Для целей открытого доступа авторы применили публичную лицензию на авторское право CC BY к любой версии Автором принятой рукописи (AAM), возникшей в результате этой подачи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антенна 35 мм | No 1.5 Coverslip | Диаметр стекла 14 мм | Без покрытияКорпорация MatTekCat# P35G-1.5-14-C
АккутазаИнвитрогенКат# 00-4555-56
Фракция альбумина (BSA) V (pH 7.0)Panreac AppliChemCat# A1391
Полностью транс-ретиноевая кислотаMerckCat# R2625
Добавка B-27 (50 раз), без сывороткиGibcoКот# 17504044
Матрица базальных мембран (Матригель)КорнингКот# BDL354234Концентрация белка 10 мг/мл 
Микропластины CellCarrier-96 UltraПеркинЭлмерКот# 6055302
CellProfiler 4Стерлинг и др. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021ТокрисCat# 4423
КУБИК-R+(N)Мацумото и др., 2019Н/Д
ДиметилсульфоксидСигма ОлдричCat# D2650
DMEM/F-12, без глутамина.GibcoКот# 21331020
Дульбекко s Фосфатно-буферный физиологический раствор (DPBS, 1X)GibcoКот# 14190144
Центрифуга Эппендорфа 5810 RЭппендорфКот# 5811000015
Eppendorf Microtube 3810XMerckКот# EP0030125150
Конические центрифугные трубки FalconКорнингКот# 352095
ЖелатинMerckCat# G2500
L-глутамин (200 мМ)GibcoКот# A2916801
Инкубатор CO2 HeracellVIOS 160i, 165 лThermoFisher ScientificКот# 51033557
ИмарисOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Микроскоп с инвертированным светодиодом фазового контраста (CKX53)Олимп
2-меркаптоэтанол (50 мм)GibcoКот# 31350010
Моноклональная мышь анти-OCT-3/4Санта-Крус БиотехнологияКат# sc-5279; RRID:AB_628051Используйте 1:200
Моноклональная мышь против PAX3DSHBCat# PAX3-C; RRID:AB_528426Используйте 1:100
Моноклональный кролик против SHHТехнологии клеточной сигнализацииCat# 2207; RRID:AB_2188191Используйте 1:300
Моноклональный кролик анти-и бета; 3-ТубулинТехнологии клеточной сигнализацииCat# 5568; RRID:AB_10694505Используйте 1:500
Моноклональная мышь против ZO-1ИнвитрогенКат# 33-9100; RRID:AB_2533147Используйте 1:200
Мышь LIFQkineCat# Qk018-1000
Добавка N-2 (100X)GibcoКот# 17502048
Нейробазальная средаGibcoКот# 21103049
Параформальдегид, реагентный класс, кристаллическийMerckCat# P6148
PD 0325901ТокрисCat# 4192
Раствор пенициллина-стрептомицинаGibcoКот# 15140130
Фазово-контрастный микроскоп
Поликлональная козла анти-FOXA2R& DCat# AF2400; RRID:AB_2294104Используйте 1:400
Поликлональный козёл анти-SOX1R& D SystemsCat# AF3369; RRID:AB_2239879Используйте 1:200
Данные RNA-Seq, связанные с рисунком 6Ишихара и др., 2022GEO: GSE214368
Премиальный микробиологический шкаф безопасности SafeFASTГруппа Dasit БЫСТРЕЕКот# F00025200000
Пируват натрия (100 мм)GibcoКот# 11360070
Вращающийся дисковый конфокальный инвертированный микроскоп (IX3)Олимп
Triton X-100Сигма ОлдричCat# 9036-19-5

Ссылки

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.