Методическая статья

Введение летучих анестетиков личинкам данио-рерио для наблюдения за поведением

957 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67896

⸱

6 июня 2025 г.

 ,  , 
1Perelman School of Medicine, Department of Anesthesiology and Critical Care, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой доступный метод создания газонепроницаемой среды для введения летучих анестетиков личинкам данио-рерио для поведенческих экспериментов.

Аннотация

В этом исследовании описан уникальный метод введения летучих анестетиков, таких как изофлуран и севофлуран, личинкам рыбок данио во время поведенческих экспериментов. В то время как рыбки данио обладают многочисленными преимуществами в качестве модели позвоночных организмов, включая сложное поведение, генетическую податливость, прозрачные эмбрионы и быстрое развитие, их использование в изучении летучих анестетиков было ограничено. Для введения летучих анестетиков часто требуются сложные или громоздкие аппараты, которые могут быть недоступны, что создает препятствия для фармакологического изучения летучих анестетиков в водных модельных организмах. Этот метод представляет собой простую технику с использованием клейких силиконовых листов для создания газонепроницаемого уплотнения на стеклянных 96-луночных пластинах. Валидация проводилась путем оценки спонтанного движения, которая не показала существенных различий между закрытыми и открытыми скважинами в течение 90-минутного периода. Кроме того, концентрация анестетика оставалась стабильной с течением времени, что было измерено с помощью ВЭЖХ. Репрезентативные результаты включают экспериментальное определение медианных значений эффективной концентрации (EC50) для севофлурана. Данное исследование обеспечивает простой и доступный подход к фармакологическим экспериментам с использованием летучих анестетиков, который может быть легко адаптирован для изучения других летучих веществ и экспериментальных конечных точек.

Введение

Модели неводных животных (черви, мухи, грызуны, кролики, приматы и т. д.) исторически были моделями, наиболее часто используемыми для изучения анестезиологической фармакологии. У каждого из этих видов летучие анестетики (вводимые путем вдыхания газа) являются гораздо менее сложными, чем внутривенное введение анестетиков (вводимое либо внутривенно, либо внутрибрюшинным путем)1. В дополнение к технической проблеме, связанной с простым введением внутривенных препаратов, достижение устойчивого состояния анестезии гораздо проще с летучими агентами, чем с внутривеннымиагентами.

Введение внутривенных анестетиков личинкам водных видов может быть достигнуто путем диффузии из окружающей их водной среды 3,4 и, таким образом, больше похоже на введение летучих анестетиков для неводных видов. В течение многих лет головастики (Xenopus laevis) были моделью выбора для изучения анестетиков из-за простоты введения лекарств и устойчивой фармакокинетики, достигаемой простым добавлением анестетика в воду искусственного пруда 5,6. Тем не менее, существует относительно небольшое количество примеров изучения летучих анестетиков в этой модели из-за требований к газонепроницаемым аппаратам, которые часто специально сконструированы и могут быть громоздкимив использовании.

В последние годы рыбки данио стали предпочтительной моделью для изучения внутривенных анестетиков из-за той же простоты введения лекарств в дополнение к другим преимуществам, таким как их хорошо описанное сложное поведение и доступность коммерческих единиц для наблюдения за этимповедением. Во многих недавних исследованиях использовались такие коммерчески доступные наблюдательные устройства для скрининга нейроактивных соединений, включая анестетики, с использованием 96-луночных и 24-луночных планшетов для количественной оценки поведения личинок данио-рерио 4,10,11,12,13,14,15 . Личичиночные стадии особенно хорошо подходят для фармакологических исследований из-за их способности оценивать многие поведенческие реакции, их небольшого размера, высокой пропускной способности и хорошо охарактеризованных нейронных цепей 9,16,17. Тем не менее, одним из существенных ограничений в этих исследованиях анестетиков в модели рыбок данио является относительная сложность введения летучих анестетиков. Это ограничение привело к скудным примерам сравнения летучих и внутривенных препаратов 4,15,18. Возможность легко изучать и сравнивать оба класса анестетиков на одной животной модели добавляет важный инструмент, облегчающий изучение анестезиологической фармакологии во всех классах.

Традиционно, для изучения внутривенных анестетиков у водных организмов требовалось специализированное, часто индивидуальное, оборудование, которое может быть сложным в использовании или может быть недостаточно газонепроницаемым, чтобы предотвратить потерю анестетика на протяжении всего эксперимента. Описанная здесь процедура представляет собой легкодоступный альтернативный способ изготовления газонепроницаемого уплотнения в стеклянной камере, пригодного для наблюдения за поведением личинок рыбок данио рерио с помощью коммерческого наблюдательного устройства (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с рыбками данио проводились в соответствии с протоколами использования животных, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Взрослые рыбки данио содержались в водном комплексе Университета Пенсильвании под надзором Университетского лабораторного управления животных (ULAR). Тюбингенские длинноплавниковые рыбки дикого типа были выведены в домашних условиях для всех экспериментов и содержались в стандартных условиях содержания с 13/11-часовым циклом свет/темнота до тех пор, пока они не достигали 5 дней после оплодотворения (dpf). Эксперименты проводились с использованием биологических репликатов, при этом кладки получались от отдельных брачных пар для обеспечения адекватного биологического разнообразия. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление клеевых силиконовых листов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эквиваленты этого материала (силиконовый лист плюс клей) могут быть получены в коммерческих целях, но часто с большей стоимостью и меньшей доступностью.

  1. Разложите силиконовый лист толщиной 0,5 мм на чистой ровной поверхности.
  2. Осмотрите листы на наличие складок и по возможности избегайте их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконовые листы со складками могут не прилипать к ленте должным образом, что может привести к недостаточной герметизации лунок и/или плохой визуализации рыбок данио.
  3. Очистите листы 70% спиртом, чтобы удалить масло или мусор, и дайте им высохнуть.
  4. С помощью аппликатора, например, кисти, нанесите тонкий ровный слой адгезивной грунтовки на силиконовый лист. Чтобы избежать чрезмерного нанесения, работайте небольшими секциями, так как промотор клея быстро высыхает (схватывается за 1-5 с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без этого промотора адгезии лента не будет адекватно прилегать к силиконовому листу.
  5. После нанесения клеевого промотора совместите ленту с двойным покрытием с силиконовым листом бумажной подложкой вверх.
  6. Постепенно наклейте ленту на силикон с помощью валика, чтобы разгладить поверхность и удалить пузырьки воздуха (после первоначального нанесения работа силиконовой стороной вверх поможет визуализировать и удалить пузырьки воздуха).
  7. Дайте промотору клея полностью застыть в течение 24 часов на ровной поверхности.
  8. Нарежьте клейкий силикон на полоски шириной не менее 10 мм (диаметр лунки 7,5 мм плюс перекрытие с каждой стороны).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании каждого второго ряда луночной пластины более широкий перепад полос не окажет негативного влияния на скважины в соседних рядах, что может не только облегчить нанесение, но и быть необходимым для достижения герметизации по всей окружности лунки.
    1. Убедитесь, что полосы достаточно длинные, чтобы покрыть по крайней мере ширину одного ряда луночной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании луночного планшета, который не является 96-луночным, например, 24-луночного или 48-луночного планшета, размеры полос могут быть отрегулированы или обрезаны в соответствии с конкретными размерами планшета, обеспечивая надлежащее покрытие независимо от размера планшета.

2. Приготовление растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все исходные и тестовые растворы летучих анестетиков были изготовлены непосредственно перед экспериментом во избежание потери концентрации летучих соединений.

  1. Для каждого раствора (исходного или рабочего раствора) добавьте объем нелетучего растворителя (вода для эмбрионов Е3, ДМСО и т. д.) в пробирку для ВЭЖХ или сцинтилляции, чтобы при сочетании с окончательным разбавлением летучего анестетика общий объем достаточно заполнил флакон, оставив минимальное свободное пространство (см. рисунок 1А).
  2. Добавьте летучий анестетик с помощью газонепроницаемого шприца Hamilton и быстро закройте флакон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковые растворы во флаконах с септумными крышками могут использоваться для облегчения дальнейшего разведения путем переноса раствора газонепроницаемыми шприцами.
  3. Затем смешайте флаконы (вортекс, ультразвук) по мере необходимости и временно храните их, пока готовятся тарелки с рыбками данио.

3. Постановка поведенческого эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап протокола может потребовать некоторой практики. Рекомендуется работать без рыбы или растворов, содержащих драгоценный материал, до тех пор, пока не освоится с техникой.

  1. Перенесите по одной личинке данио рерио (5 dpf) в каждый второй ряд стеклянной 96-луночной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если оставить каждый второй ряд пустым, это снижает вероятность загрязнения соседних скважин в результате перелива, поскольку скважины герметизируются на шаге 3.4.
  2. Аккуратно удалите раствор Е3 из каждой лунки. Это можно делать по одному ряду за раз или на всей плите, если она способна работать быстро.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, в течение которого личинки находились вне раствора, было сведено к минимуму для снижения потенциального стресса. Альтернативные методы могут быть использованы на основе различных экспериментальных потребностей, включая только частичное удаление раствора перед добавлением лекарственного раствора для минимизации стресса. Протокол должен быть адаптирован к потребностям эксперимента, включая время уравновешивания, предоставленное животным для компенсации любого потенциального стресса, эффективность смешивания растворов и точность концентраций раствора, содержащего лекарственное средство, если не весь Е3 удаляется до добавления рабочего раствора.
  3. Затем с помощью переводной пипетки заполните каждую лунку в ряду экспериментальным раствором. Следите за тем, чтобы не появились пузырьки. Переполните каждую лунку (рисунок 1В).
  4. С помощью клеевых силиконовых полосок, изготовленных на шаге 1, быстро прижмите полоску вниз (Рисунок 1C). Это помогает предотвратить образование пузырьков и удерживает рыбу от перелива в соседние скважины.
  5. Плотно надавите на верхнюю часть пластины, чтобы убедиться, что каждая лунка запечатана.
  6. Повторяйте шаги 2-5 до тех пор, пока раствор не будет заменен и лунки для каждого второго ряда пластины лунки не будут запечатаны (рисунок 1D).
  7. Аккуратно переверните пластину и осмотрите на наличие пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие пузырьков воздуха будет мешать визуализации движения рыбок данио.
  8. Поместите пластину в блок наблюдения за поведением (силиконовым клеем вниз) и проведите поведенческий эксперимент (подробнее см. раздел «Результаты»).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сравнение с традиционными наблюдениями за скважинами
Чтобы оценить, оказывает ли адгезивное уплотнение какое-либо влияние на спонтанное движение, было проведено сравнение контрольной группы в открытых и герметичных лунках. Как видно на рисунке 2А, статистически значимой разницы в движении между этими группами не наблюдалось в течение стандартной продолжительности ~30 минут, используемой в экспериментах, описанных в этой статье. Признавая, что другие экспериментальные пара...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье описывается метод легкого введения летучих анестетиков, таких как севофлуран, личинкам рыбок данио, который был использован для количественной оценки активности летучих анестетиков у рыб дикого типа. Несмотря на то, что этот метод концептуально прост, может потребоваться практика, чтобы обеспечить адекватно герметизированный, свободный от пузырьков ряд скважин за короткий промежуток времени, чтобы свести к минимуму потери летучих агентов. Поскольку этот метод предназначен д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Фондом образования и исследований в области анестезиологии (FAER). Рисунок 1 создан в BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночные стеклянные микропланшетыZinsser Северная Америка3600500«Эти стеклянные микропластины изготовлены из специального боросиликатного стекла высокой чистоты, устойчивого к высоким температурам, а поверхности отполированы кислотой. Пластины имеют прямоугольную форму в стандартной микропластине SBS (85 x 127 мм). Эти стеклянные микропланшеты для реакторов предназначены в первую очередь для использования в химической промышленности и устойчивы к температурам до 530°°; В. Они могут быть автоклавированы. Они изготовлены из однородного стеклянного листа и имеют единую геометрию и форму, чтобы обеспечить постоянную температуру от скважины к скважине (в пределах 0,2 градуса Цельсия, тип).
2,0 мл прозрачный, большое отверстие, флаконы с резьбой 9 мм Chemglass Медико-биологические наукиКВ-1150-1232«Эти флаконы имеют увеличенное на 40% отверстие и специально разработаны для работы в автоматических пробоотборниках с роботизированными манипуляторами. Они также включают в себя уникальную конструкцию ступенчатого флакона, которая точно центрирует вставку ограниченного объема в горлышке флакона. "
Лента с двойным покрытием 3M 9490LEАббВи Инк24WG90"Лента 3M с двойным покрытием 9490LE с клеем для ламинирования 3M 300LSE обеспечивает высокую прочность сцепления с большинством поверхностей, включая многие пластики с низкой поверхностной энергией, такие как полипропилен и порошковые краски. Акриловый клей также обеспечивает отличную адгезию к поверхностям, слегка загрязненным маслом, обычно используемым для деталей машин. Лента 3M с двойным покрытием 9490LE предлагает дополнительную функцию клея для ламинирования 3M 300MP с одной стороны для обеспечения отличной прочности сцепления с различными вспененными и тканевыми материалами (6 дюймов x 5 ярдов)».
Наблюдательная камера DanioVisionНолдусДВОК-0041«DanioVision — это комплексная система, предназначенная для высокопроизводительного тестирования личинок рыбок данио в многолуночных планшетах. Он включает в себя наблюдательную камеру и известное программное обеспечение для отслеживания видео EthoVision XT».
Блок термостатирования DanioVisionНолдусДВТКУ-0011«Термостат DanioVision представляет собой проточную систему: вода равномерно течет под плитой скважины с температурой по вашему выбору. Температура одинакова по всей пластине лунки».
Программное обеспечение Ethovision XT16НолдусБАЗА NSE-EV"EthoVision XT - это наиболее широко используемое программное обеспечение для отслеживания видео, которое отслеживает и анализирует поведение, движения и активность любого животного, зарегистрированное под торговой маркой Noldus"
ИзофлуранПирамал РеанимацияНДЦ # 66794-017-10Жидкость для ингаляций, негорючий невзрывной ингаляционный анестетик, содержащий 100 мл изофлурана. Хранится при контролируемой комнатной температуре 20°М; до 25º C
Scotch-Weld Мгновенная адгезивная грунтовка AC79 Clear3 МИН."62-3916-0860-1 (идентификатор продукта) C2103N (Лот)""3M Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 предназначен для использования на трудноадгезируемых эластомерах с низким поверхностным энергопотреблением, таких как EPDM, силикон и другие каучуки. Подготовка поверхности и нанесение просты, а адгезивная грунтовка быстро сохнет, что позволяет быстро выполнять работы».
Силиконовые листы толщиной 0,5 ммРазличные поставщикиН/ДПолупрозрачные силиконовые листы были приобретены у нескольких поставщиков
Speedball Pop-in Brayer из твердой резины с пластиковой рамой, 4 дюйма"Спидбол793728«Speedball Pop-In Hard Brayer имеет ролик, который выдвигается для легкой очистки. Пластиковая, цельная рама со съемным роликом шириной 4 дюйма. Изготовлен из чистого натурального каучука с шлифованной отделкой. Брайер из твердой резины имеет ширину 4 дюйма с прочной пластиковой рамой и отлично подходит для нанесения клея».
Завинчивающиеся крышки SureSTART 9 мм, уровень 2 для высокопроизводительного применения, тип: Винтовая крышка AVCS Черный полипропилена, белый силикон/КРАСНЫЙ ПТФЭ Septa 1,0 ммТермо Сайентиал6ASC9ST1B«Используйте винтовые крышки Thermo Scientific SureSTART 9 мм с винтовыми флаконами с отверстием 9 мм. Колпачки уровня 2 изготовлены и протестированы для обеспечения низкого кровотечения, надежности и воспроизводимости результатов рутинных анализов ГХ-МС и ЖХ-МС. Выбирайте из полипропиленовых колпачков с универсальными силиконовыми/ПТФЭ-перегородками различных значений твердости, предназначенными для уменьшения проблем с иглами автосамплера. В наших крышках AVCS используется технология усовершенствованной системы закрытия флаконов, обеспечивающая оптимальную компрессию при закрытии флакона».
Ультан СевофлуранАббВи ИнкНДЦ # 0074-4456-04Летучая жидкость для ингаляций, упакована во флаконы янтарного цвета, содержащие 250 мл севофлурана. Хранится при контролируемой комнатной температуре 15°М; до 30º C
Wheaton жидкие сцинтилляционные флаконы, крышки, прикрепленные к флаконам, стекло, металлическая фольга / пульпа, 24-400, 20 мл DWK Медико-биологические науки986561Сцинтилляционные флаконы объемом 20 мл из боросиликатного стекла типа I, ПЭТ или ПНД. Выпускается с прикрепленным колпачком.

Ссылки

  1. Wasilczuk, A. Z., Maier, K. L., Kelz, M. B. The mouse as a model organism for assessing anesthetic sensitivity. Methods Enzymol. 602, 211-228 (2018).
  2. Shortal, B. P., et al. Development and validation of brain target-controlled infusion of propofol in mice. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  3. Halbach, K., et al. Yolk sac of zebrafish embryos as backpack for chemicals. Environ Sci Technol. 54 (16), 10159-10169 (2020).
  4. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 1-10 (2020).
  5. Stetter, M. D., et al. Isoflurane anesthesia in amphibians: Comparison of five application methods. In American Association of Zoo Veterinarians. , Puerto Vallarta, Mexico. 255-257 (1996).
  6. Woll, K. A., Eckenhoff, R. G. High-throughput screening to identify anesthetic ligands using Xenopus laevis tadpoles. Methods Enzymol. 602, 177-187 (2018).
  7. Meyer, H. Zur Theorie der Alkoholnarkose. Arch Exp Pathol Pharmakol. 46, 338-346 (1901).
  8. Downes, H., Courogen, P. M. Contrasting effects of anesthetics in tadpole bioassays. J Pharmacol Exp Ther. 278, 284-296 (1996).
  9. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
  10. Abramova, V., et al. Effects of pregnanolone glutamate and its metabolites on GABAA and NMDA receptors and zebrafish behavior. ACS Chem Neurosci. 14, 1870-1883 (2023).
  11. Germann, A. L., et al. Comparison of behavioral effects of GABAergic low-and high-efficacy neuroactive steroids in the zebrafish larvae assay. ACS Chem Neurosci. 15, 909-915 (2024).
  12. Hoyt, H., et al. Photomotor responses in zebrafish and electrophysiology reveal varying interactions of anesthetics targeting distinct sites on gamma-aminobutyric acid type A receptors. Anesthesiology. 137, 568(2022).
  13. Li, F., et al. Characterization of the locomotor activities of zebrafish larvae under the influence of various neuroactive drugs. Annals Trans Med. 6, 173(2018).
  14. McCarroll, M. N., Gendelev, L., Kinser, R. Zebrafish behavioural profiling identifies GABA and serotonin receptor ligands related to sedation and paradoxical excitation. Nat Commun. 10, 4078(2019).
  15. Plasencia, D. M., Rodgers, L. H., Knighton, A. R., Eckenhoff, R. G., White, E. R. Antagonism of propofol anesthesia by alkyl-fluorobenzene derivatives. Sci Rep. 14, 15943(2024).
  16. Dash, S. N., Lipika, P. Flight for fish in drug discovery: A review of zebrafish-based screening of molecules. Biology Lett. 19, 20220541(2023).
  17. Nelson, J. C., Michael, G. Zebrafish behavior as a gateway to nervous system assembly and plasticity. Development. 149, 177998(2022).
  18. Zhang, L., et al. Sevoflurane postconditioning ameliorates cerebral hypoxia/reoxygenation injury in zebrafish involving the Akt/GSK-3β pathway activation and the microtubule-associated protein 2 promotion. Biomed Pharmacother. 175, 116693(2024).
  19. Abdallah, S. J., Thomas, B. S., Jonz, M. G. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218, 1777-1786 (2015).
  20. Targ, A. G., Yasuda, N., Eger, E. I. Solubility of I-653, sevoflurane, isoflurane, and halothane in plastics and rubber composing a conventional anesthetic circuit. Anesth Analg. 69, 218-225 (1989).
  21. Yang, X., et al. Drug-selective Anesthetic insensitivity of zebrafish lacking γ-aminobutyric acid Type A receptor β3 subunits. Anesthesiology. 131, 1276-1291 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи