Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Биопленочный анализ на Clostridioides difficile с применением для разработки лекарств

988 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 июля 2025 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Биопленки бактериального патогена Clostridioides difficile и их значение в заболевании недостаточно изучены. Недавние результаты показали роль рецидива, подчеркнув его важность. В этой статье мы описываем адаптацию анализа биопленки в сочетании с метаболическим считыванием с применением для разработки лекарств против биопленок.

Аннотация

Clostridioides difficile — это желудочно-кишечный бактериальный патоген, способный использовать дисбиотическую микробиоту для размножения, секреции токсинов и повреждения кишечного эпителия. У пациентов с инфекцией C. difficile (CDI) антибиотики (15–30%) или трансплантация фекальной микробиоты (<10%) будут неэффективными. Поэтому разработка дополнительных терапевтических вмешательств имеет решающее значение. Роль биопленок C. difficile в рецидиве неясна. Тем не менее, биопленки в других организмах ответственны за хроническое и рецидивирующее заболевание, что позволяет предположить, что это также может иметь место при рецидивирующем CDI. Мы предполагаем, что биопленки C. difficile представляют собой ценную терапевтическую мишень. Целью представленного здесь протокола является адаптация анализа образования биопленки для идентификации перемещаемых соединений с активностью в отношении установленных биопленок C. difficile . Протокол уточняет надежный и воспроизводимый анализ для формирования биопленок, связывает его с метаболическим анализом и применяет его для разработки лекарств. В этом протоколе описывается анализ образования биопленки, показания биомассы и метаболической активности, тестирование чувствительности к лекарственным препаратам, скрининг лекарственных препаратов в библиотеке репозиционирования и репрезентативные результаты.

Введение

Clostridioides difficile является спорообразующим, анаэробным бактериальным патогеном, способным наносить серьезные повреждения желудочно-кишечному тракту человека (ЖКТ) путем выработки токсинов. C. difficile является причиной почти полумиллиона случаев заболевания в год, из которых ~30 000 смертельных исходов (CDC, 2015). Лечение инфекции C. difficile (CDI) значительно увеличивает и без того перегруженную систему здравоохранения (~$4,8 млрд)1,2,3. Наиболее подвержены риску лица с иммуносупрессией, воздействием антибиотиков и/или пожилые люди, все популяции, которые продолжают значительно расширяться как в США, так и во всем мире.

C. difficile в значительной степени зависит от состояния микробиоты ЖКТ хозяина, и поэтому лечение антибиотиками является ключевым предрасполагающим фактором для CDI. Идентификация устойчивых к антибиотикам клинических изолятов C. difficile еще больше усложняет лечение 8,9,10. Более того, от 15% до 30% пациентов, получавших антибиотики по поводу CDI, не подведут к первоначальному лечению 5,11,12,13,14,15,16. Как только у пациента возникает рецидивный эпизод, вероятность рецидивных эпизодов увеличивается до 45%-64% (эскалатор рецидива) и сопровождается повышенным риском дальнейших неудач лечения16,17. Важно отметить, что большинство случаев рецидива CDI вызваны исходным штаммом, который вызвал первый эпизод инфекции у хозяина18,19, что предполагает продолжение колонизации C. difficile даже после успешного лечения. В то время как было показано, что споры сохраняются в желудочно-кишечном тракте и приводят к рецидиву в моделях ex vivo и мышей20, биопленки C. difficile и их роль в заболевании и рецидиве недостаточно изучены. Биопленки представляют собой микробные сообщества, защищенные самостоятельно производимым внеклеточным матриксом, что делает их очень устойчивыми к воздействию окружающей среды, таким как лечение антибиотиками и иммунныереакции. Кроме того, образование биопленки является значимым фактором вирулентности 22,23,24,25, а при бактериальных инфекциях, таких как вызванные Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, биопленки играют ключевую роль в рецидивах и хронических проявлениях 26,27. В последнее время биопленки C. difficile были предложены в качестве резервуара для рецидивирующих инфекций 28,29,30 и, следовательно, представляют собой важную мишень для лечения и/или профилактики рецидива CDI.

Современные модели для изучения биопленок C. difficile включают модели биопленок колоний31,32, микроферментаторы33, модели кишечника хемостата34,35 и системы жидких культур с использованием колб или луночных планшетов36,37. Все эти модели позволили получить ключевую информацию о биопленках C. difficile на разных стадиях развития и в различных средах. Тем не менее, некоторые из этих моделей (например, микроферменторы, хемостатные модели кишечника, биопленки колоний) не подходят для разработки лекарств. На сегодняшний день большинство исследований, связанных с поиском лекарств, были сосредоточены на планктонном образе жизни C. difficile 38,39,40,41. Таким образом, описанный здесь протокол направлен на адаптацию, стандартизацию и валидацию существующей 96-луночной модели биопленки с целью разработки платформы для скрининга библиотек для идентификации перемещаемых молекул со способностью убивать устоявшиеся (24 часа назад) биопленки C. difficile. Валидация протокола проводилась путем сравнения возможностей образования биопленки между лабораторно адаптированным штаммом (630 Δerm) и эпидемическим клиническим изолятом (штамм UK1, выделенный во время вспышки в 2006 году в больнице Сток-Мандевиль в Соединенном Королевстве42). Образование биопленки количественно определяли с помощью классического анализа кристаллической фиалки для измерения биомассы и метаболического анализа для измерения жизнеспособности биопленок. Были выявлены значительные различия в способностях образования биопленки между штаммами, что позволяет предположить потенциальные клинические последствия. Кроме того, анализ был использован для определения профилей чувствительности к антибиотикам установленных биопленок. Наконец, в качестве доказательства концепции был проведен скрининг коробки Global Health Priority от некоммерческой организации Medicines for Malaria Venture (MMV), занимающейся поиском новых методов лечения забытых болезней, таких как малярия, с целью выявления соединений, обладающих активностью в отношении установленных биопленок C. difficile. Описанный здесь протокол адаптирует и валидирует классический анализ биопленки для использования в качестве платформы для скрининга лекарственных препаратов, нацеленных на зрелые биопленки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клеток к биопленочному анализу

ВНИМАНИЕ: Clostridioides difficile является патогеном человека и требует локализации BSL-2.

Споры, использованные для этого исследования, были получены от доктора Кэрол Кумамото из Медицинской школы Университета Тафтса. Запасы спор C. difficile были подготовлены так, как описано ранее 43,44,45. Затем споры аликвотируются в объеме 10 мкл в пробирки для ПЦР для вытеснения планшетов. Все среды и фосфатный буферный солевой раствор (PBS), необходимые для эксперимента, должны быть предварительно восстановлены в анаэробной камере за 24 ч до использования. Это достигается путем ослабления крышки бутылки, содержащей среду или PBS внутри камеры.

  1. Предварительно восстановите в анаэробной камере агаровую пластину Brain Heart Infusion с добавлением 0,1% таурохолата и 0,1% (мас./об.) L-цистеина (BHIS) в анаэробной камере, желательно на ночь или не менее 3 часов для полного восстановления. Установите температуру анаэробной камеры на 37 °C.
  2. Нагрейте ПЦР-пробирку, содержащую 10 μл спор, в течение 20 минут при температуре 70 °C. Это можно сделать на водяной бане или в термоамплифике.
  3. Поместите споры в анаэробную камеру, перемешайте с помощью осторожного пипетирования 5-6x и пипетируйте 10 μL на предварительно восстановленной BHIS-планшете. Выполните серию из четырех квадрантов, как описано ранее46, и инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 °C (температура анаэробной камеры).
  4. Через 24 часа роста должны быть видны изолированные колонии. Выберите одну колонию и с помощью одноразовой петли перенесите в пробирку, содержащую 10 мл жидкости BHIS. Инкубировать в течение ночи (14-18 ч).
  5. Определяют плотность клеток путем последовательного разведения ночной культуры в камере.
    1. Проводят 10-кратное разведение культуры на ночь. В результате разведения 103 получается поддающийся подсчетам образец для каждого из штаммов, используемых в данном протоколе. Однако для клинических изолятов с различиями в росте может потребоваться стандартизация этого этапа.
    2. Выньте пробирки из анаэробной камеры, поместите 10 мкл каждого образца в гемоцитометр и посчитайте с помощью светлопольного микроскопа, как описано производителем гемоцитометра.
    3. Следуйте инструкциям производителя, чтобы определить концентрацию клеток после подсчета.

2. Образование биопленки

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол можно адаптировать к различным размерам скважин, он был оптимизирован для платформы с 96 лунками. Если размер лунки изменяется, концентрацию ячеек необходимо регулировать в зависимости от площади поверхности лунки.

  1. После определения концентрации клеток из ночной культуры отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 107 клеток/мл в BHIS (с добавлением 10% (w/v) L-цистеина и 0,1М глюкозы).
    Примечание: Ранее было показано, что добавка глюкозы 0,1М увеличивает образование биопленки штаммом C. difficile 630 Δerm 47. Для этого протокола концентрация 1 x 107 клеток/мл была выбрана после тестирования различных начальных концентраций (рис. 1). Надежное образование биопленки может быть достигнуто и без добавок глюкозы.
  2. Диспонируйте 100 мкл клеток в лунки 96-луночного микротитровального планшета (с плоским дном и обработанной культурой тканей), оставляя контрольные (только клетки) и пустые (только среда) колонки. Инкубировать в течение 24 ч в анаэробной камере (37 °C).
    1. Если испарение среды становится проблемой, поместите пластины из биопленки подальше от любого нагревательного блока. В качестве альтернативы можно поместить биопленки внутрь дополнительного контейнера или накрыть проницаемыми 96-луночными пластинчатыми мембранами.
  3. Аккуратно удалите среду из всех лунок, начиная с заготовки. Это удалит неадгезивные клетки и оставит после себя биопленку. Этот шаг имеет решающее значение, так как интерес представляют только клетки внутри биопленки.
  4. Аккуратно промойте биопленки 2 раза 200 мкл предварительно сниженного PBS. Чтобы выполнить эту промывку аккуратно, слегка наклоните 96-луночную пластину, вставьте наконечники пипетки к стенке лунки, сдвиньте кончики близко ко дну лунки, не соскребая дно, и медленно аспирируйте. Если PBS остался внизу, повторите процесс еще раз. На этом этапе можно удалить неадгезивные клетки, и это нормально. Снимите PBS перед тем, как вынуть пластину из анаэробной камеры.
  5. На этом этапе используйте биопленки для: измерения биомассы (см. Шаг 3); измерение метаболической активности (см. Шаг 4); Определение чувствительности к лекарственным препаратам и скрининг лекарственных препаратов (см. Шаг 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был валидирован для адаптированного в лаборатории штамма 630 Δerm и эпидемического штамма UK1. Отдельные клинические изоляты и штаммы могут демонстрировать слабую способность к образованию биопленки. Чтобы свести к минимуму разрушение биопленки, стирайте PBS 1x вместо 2x и уменьшите объем стирки до 100 μл.

3. Измерение биомассы биопленки с помощью анализа кристаллической фиалки

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом было основано на ранее описанном протоколе48.

  1. После промывки биопленок в анаэробной камере (см. шаг 2.4) снимите пластину и перенесите ее в вытяжной шкаф для химикатов.
  2. Чтобы закрепить биопленки, аккуратно добавьте в каждую лунку по 150 мкл метанола. Накройте тарелку крышкой на 10 минут.
  3. Удалите метанол и дайте лункам полностью высохнуть со снятой крышкой. Это займет от 30 до 45 минут.
  4. Добавьте 100 мкл 0,3% кристаллического фиалки во все лунки и окрашивайте в течение 10 мин. Осторожно удалите кристаллический фиалка, чтобы предотвратить окрашивание края лунки и стенок, так как это может повлиять на показания.
  5. Дайте тарелке высохнуть, сняв крышку. Это должно занять от 30 до 45 минут.
  6. Промойте лунки 3 раза 200 μл дистиллированной воды и дайте пластине полностью высохнуть. Это должно занять от 30 до 45 минут.
  7. После высыхания используйте светлопольный микроскоп для получения изображения биопленок (Рисунок 2A). Хотя этот шаг является необязательным, он позволяет более тщательно наблюдать за клетками в биопленке.
    1. Поместите 96-луночный планшет на инвертированный светлопольный микроскоп с помощью адаптера для планшетов. Определите репрезентативные лунки для каждой испытываемой деформации.
    2. Сделайте снимки для каждой лунки с нужным увеличением. Изображения, представленные в этом протоколе, были сделаны с 40-кратным увеличением.
  8. После получения желаемых изображений перенесите пластину обратно в вытяжной шкаф для химических веществ для удаления пятен.
  9. Чтобы удалить пятна с биопленки, добавьте 150 μл 33% уксусной кислоты и поместите на шейкер на средней скорости на 10 минут.
  10. Удалите 90 μL из каждой лунки и переложите на новую 96-луночную пластину с плоским дном. Считывание поглощения на длине волны 595 нм с помощью считывателя пластин (рис. 2B).

4. Измерение жизнеспособности биопленки с помощью метаболического красителя PrestoBlue

  1. Проводите измерение метаболической активности в соответствии с протоколом производителя для анализа с ключевыми изменениями. Нагрейте считыватель планшетов до 37 °C перед подготовкой биопленок к анализу. Рекомендуется использовать планшетный считыватель, способный измерять флуоресценцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы метаболическая активность может быть измерена при наружном диаметре600; Тем не менее, мы не обнаружили, что этот подход достаточно чувствителен для этих анализов. Пользователям рекомендуется ознакомиться с протоколом производителя и при необходимости стандартизировать его.
  2. После промывки биопленок PBS в анаэробной камере, как описано выше (см. шаг 2.4), извлеките пластину из камеры.
  3. Вместе с планшетом удалите 9 мл предварительно восстановленного BHIS (с добавлением 10% (w/v) L-цистеина и 0,1 М глюкозы).
  4. Быстро добавьте 1 мл реагента PrestoBlue к 9 мл предварительно восстановленного BHIS и вортекса. Не уменьшайте количество реагента заранее, так как это может повлиять на окраску реагента (см. Обсуждение).
  5. Добавьте по 100 мкл смеси BHIS-PrestoBlue в каждую лунку. Поместите планшет в считыватель планшетов со следующими настройками: Температура при 37 °C, тип анализа как кинетический; время чтения – 30 мин; частота считывания каждые 2 мин; Интенсивность флуоресценции в зависимости от типа имеющегося считывателя пластин. Измерения, описанные в этом протоколе, были выполнены с использованием длин волн возбуждения/излучения 560 нм/ 590 нм соответственно.
  6. После прочтения выбросьте таблички.
  7. После получения значений флуоресценции из показаний планшета используйте пустые лунки (только для среды) для вычитания шума из всех лунок образца. После этого лунки биопленки, обработанные каждым соединением, разделить контрольной лункой, содержащей необработанную (100%) биопленку, для получения метаболической активности.

5. Добавление препаратов в биопленки

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная ниже конфигурация может быть изменена для анализа чувствительности к лекарственным препаратам и скрининга лекарств с фиксированной концентрацией. Для обоих методов, описанных ниже, рекомендуется использовать тест PrestoBlue.

  1. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) отдельных антибиотиков
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки обрабатываются в течение 48 часов, что увеличивает вероятность загрязнения. Очень важно сначала обработать глухие лунки и следовать асептическим процедурам. Значения MIC, представленные в литературе для других штаммов C. difficile , и тестовые анализы реакции на дозу использовались для определения начальных концентраций антибиотиков для анализов MIC, представленных в этом протоколе. Такой подход будет полезен для определения исходных концентраций антибиотиков при работе с клиническими изолятами.
    1. Промойте зрелые (возрастом 24 часа) биопленки с PBS в анаэробной камере, как описано выше (см. шаг 2.4).
    2. Добавьте 200 мкл предварительно восстановленного BHIS (с добавлением 10% (w/v) L-цистеина и 0,1 М глюкозы) среды, содержащей двукратное разведение исследуемого антибиотика, в каждую лунку, за исключением контрольной (только клетки) и пустой (только среды) колонок в планшете.
    3. Инкубировать еще 24 ч. В этом исследовании для валидации анализа использовали ванкомицин (начальная концентрация 200 г/мл), метронидазол (начальная концентрация 16 г/мл) и фидаксомицин (начальная концентрация 4 г/мл). Значения MIC приведены в таблице 1.
    4. Чтобы предотвратить высыхание пластин, держите подальше от нагревательного узла в анаэробной камере или используйте газопроницаемую мембрану.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы на внешних лунках пластины можно использовать предварительно отредуцированный PBS или срединный ров (300 мкл).
    5. Через 24 ч после инкубации с препаратами удалите среду и аккуратно промойте биопленки 1x с PBS. Обрабатывайте биопленки с помощью анализа Crystal violet или PrestoBlue.
  2. Скрининг библиотек лекарств
    1. Промойте зрелые (возрастом 24 часа) биопленки с PBS в анаэробной камере, как описано выше (см. шаг 2.4).
    2. Добавьте 200 мкл среды, содержащей фиксированную концентрацию соединений библиотеки лекарств, в каждую лунку, кроме контрольной (клетки в средах без антибиотиков) и пустой (среды без антибиотиков) колонок в планшете. Инкубировать еще 24 ч. Во избежание высыхания пластин держите подальше от нагревательного узла в анаэробной камере.
    3. Через 24 ч после инкубации с препаратами удалите среду и аккуратно промойте биопленки 1x с PBS. Обрабатывайте биопленки с помощью анализа кристаллической фиалки или метаболического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью описанного выше протокола является адаптация и валидация 96-луночной модели формирования биопленки в качестве платформы для скрининга лекарственных средств для идентификации перемещаемых соединений с активностью в отношении установленных биопленок C. difficile. Определяли влияние различных плотностей клеток (104,10 5, 106 и 107 клеток/мл) на образование биопленки, а образование биопленки количественно определяли с помощью окрашива...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Образование биопленки C. difficile и роль, которую она играет в заболевании, не совсем понятны. Последние данные свидетельствуют о роли биопленок в рецидиве заболевания28,34. Образование биопленки является значимым фактором вирулентности 22,23,24,25, а при бактериальных инфекциях, таких как вызванные Staphylococcus aureus

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Благодарности

J.A.R. разработал исследование и протокол, а также написал рукопись. А.С. и.З. провели эксперименты и помогли усовершенствовать протокол. Эта работа была поддержана стартовыми фондами от Техасского университета в Сан-Антонио (UTSA) до J.A.R., а A.S. была поддержана программой UTSA MARC (T34GM145507). Авторы выражают благодарность организации Medicines for Malaria Venture (MMV, Швейцария) за предоставление библиотеки Global Health Priority Box.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
УКСУСНАЯ КИСЛОТА SAF-CT ACS 500 млFisher ScientificA38S500
АГАР БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ ГР 1 кгFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 планшетный ридерFisher ScientificBTH1MG
БУТЫЛОЧКА ДРОЖЖЕВОЙ ЭКСТРАКТ 500 ГFisher ScientificDF0127179
BRAIN HEART INFUSION БУЛЬОНFisher Scientific
Кристаллический фиолетовый USP класс 100GVWR97061-850Для окрашивания биопленок для анализов биомассы
CytoOne 96-луночный планшет TC, плоское дно, прозрачный, обернутый в индивидуальную пленку крышки, 50/кейсСША ScientificCC7682-7596
D-(+)-глюкоза, безводный50712744Фишера
Диметилсульфоксид для молекулярной биологии (ДМСО)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICIN 250MGFisher ScientificAC468312500
L-ЦИСТЕИН 98+% 1KGFisher ScientificAAA104350BДля C. difficile media
METHANOL 99,8 АКРОЗЕАЛЬ 1LTFisher ScientificAC364390010
МЕТРОНИДАЗОЛ, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
Фосфатный буферный раствор (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Реагент жизнеспособности клетокFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Используется для запечатывания планшетов с лекарствами матери и дочери перед хранением
ТАУРОХОЛАТ НАТРИЯ 100MG VWR100291-598
ВАНКОМИЦИНBP29581Фишера
CM1135R Научный Научный

Ссылки

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Формирование биопленкиметаболический анализчувствительность к препаратамопределение биомассыскрининг лекарственных средстврецидивирующая инфекциятерапевтическая мишень

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.