Методическая статья

Обнаружение герметичности мембраны эндоплазматической сетки, ассоциированной с митохондриями, с помощью индуцируемых биосенсоров FRET

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод измерения значений FRET индуцируемых биосенсоров FRET, направленных на ER (с меткой CFP) или митохондрии (с меткой YFP) in vitro для оценки плотности мембран ER, ассоциированных с митохондриями (MAM), что влияет на генерацию Aβ, и этот метод может использоваться для первичного скрининга синтетических или натуральных MAM-модулирующих агентов как потенциальных терапевтических средств для AD.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многочисленные исследования показали, что количество, длина и ширина зазора (толщина) контактов с ER-митохондриями, или мембран, ассоциированных с митохондриями (MAM), влияют на их биологическую роль. Наши предыдущие исследования показали, что стабилизация узких MAM, характеризующихся шириной зазора примерно 7 нм, приводит к повышению уровня амилоидных β (Aβ), тогда как наличие рыхлых MAMs с шириной зазора около 40 нм снижает выработку Aβ в трёхмерной (3D) нейронной модели болезни Альцгеймера (AD). Для изучения эффекта MAM с разной шириной зазоров были разработаны биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) — ER-CFP (циановый флуоресцентный белок) и Mito-YFP (жёлтый флуоресцентный белок) соответственно — для количественной оценки узких MAM (ширина зазора <10 нм) в отличие от рыхлых или не-MAM. FRET возникает, когда донорский флуорофор (CFP) и акцепторный флуорофор (YFP) находятся в пределах 10 нм друг от друга, что делает эту систему подходящей для оценки близости MAM. Этот протокол описывает использование спектрального ратиометрического FRET для измерения степени плотного образования MAM.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии-ассоциированные эндоплазматические контакты ретикулума (MERC), которые биохимически изолированы как мембраны ЭР, ассоциированные с митохондриями (MAM), связаны с несколькими нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Альцгеймера (AD)1. Недавно предложенная «гипотеза MAM» предполагает, что MAMs играют центральную роль в формировании амилоидного β (Aβ), тем самым инициируя патогенный каскад AD. Этот каскад включает образование нейрофибриллярных узлов (NFT), кальциевый дисхомеостаз инейровоспаление 2. MAMs состоят из богатых холестерином, липиднообразных микродоменов в эндоплазматическом ретикуле и внешней митохондриальной мембране (OMM), связанных специфическими привязывающими белками, которые способствуют их структурному и функциональномуразнообразию 3. Стабилизация контактов между ЭР-митохондриями влияет на различные клеточные процессы, включая кальциевую сигнализацию ЭР и апоптоз 4,5. Оценивается, что 5%–20% митохондрий формируют физический контакт с отделением неотложной помощи для формированияMAMs 6. Несколько исследований показали, что число, длина и ширина зазора (толщина) между ER и митохондриями на участках MAM являются важными факторами, определяющими их функциональную роль. Криоэлектронная микроскопия и in vivo анализы печени мышей показали, что метаболическое состояние гепатоцитов регулирует как толщину (от 14 нм до 20 нм), так и длину (от 145 нм до 270 нм)MAMs 7.

МАМ также становятся потенциальными терапевтическими целями для различных расстройств, включая рак и метаболические нарушения. Толщина или ширина зазора MAM регулирует выживаемость клеток. Конститутивные стабилизаторы MAM MAM 1X и MAM 9X, разработанные для стабилизации плотных (6 нм ± ширины зазора 1 нм) и рыхлых MAM (ширина зазора 24 нм ± 3 нм) соответственно, показали, что стабилизация плотных MAM значительно увеличивает генерацию Aβ в новой трёхмерной модели нейронной культуры AD. В отличие от этого, стабилизация рыхлых MAMs не имелаэффекта 8. Таким образом, преобразование стабилизации тугих MAM в рыхлые MAM может быть полезно для снижения амилоидной патологии. Структурные и функциональные сложности, а также отсутствие точного количественного анализа степени стабилизации MAM затрудняют таргетирование MAM для открытия лекарств. Новый анализ аксональной скорости митохондрий на основе живых клеток и кимографии показал, что аксональная скорость митохондрий может использоваться как метрика для количественного измерения стабилизации MAM, поскольку более плотный контакт с ER значительно снижает аксональную скорость митохондрий по сравнению со свободными митохондриями 8,9. Используя индуцируемый стабилизатор MAM в клетках Neuro 2A (N2A APP), экспрессирующих hAPP, мы обнаружили, что сокращение ширины разрыва MAM увеличивает генерацию Aβ в зависимости отдозы 8. Индуцируемые стабилизаторы MAM — это плазмиды экспрессии, кодирующие CFP (цианофлуоресцентный белок)-эпитопно-метированный ER-таргетинг и YFP (жёлтый флуоресцентный белок)-эпитопно-меткие биосенсоры, нацеленные на митохондрии, сросшиеся с доменами рапамицина-индуцируемого рапамицина FK506 (FRB) или 12-кДа FK506-связывающим белком (FKBP). Биосенсоры были обозначены как ER-CFP и Mito-YFP соответственно. CFP — это донорский флуорофор, который передаёт энергию акцепторному флуорофору YFP при их разделении >10 нм. Клетки (N2A APP), экспрессирующие индуцируемые биосенсоры, увеличили генерацию Aβ после обработкирапамицином 8, что свидетельствует о увеличении увеличения плотных MAMs увеличения генерации Aβ. Эти методы будут полезны для скрининга маломолекулярных модуляторов MAM и их эффективной концентрации, необходимой для стабилизации оптимального уровня плотных MAM, которые будут превращать патогенные ("Aβ увеличивающийся") в терапевтические ("Aβ понижающие") MAM, не полностью дестабилизируя контакты ER и митохондрии, что важно для выживания клеток.

Экспериментальнаямодель
В этом исследовании использовались клетки Neuro2A(N2A), конститутивно экспрессирующиеAPP 751 (N2A APP). Эти клетки выделяют обнаруживаемые уровни Aβ в условную среду (CM) по сравнению с наивными N2A-клетками. КлеткиN2A APP поддерживались в DMEM с добавлением 10% FBS, 100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамата с добавлением 200 мкг/мл G418, как описано ранее10.

Плазмида экспрессии
Плазмида экспрессии была получена путём слияния митохондриальной таргетирующей последовательности YFP (жёлтый флуоресцентный белок), меченой YFP (жёлтым флуоресцентным белком), меченой ER-таргетной последовательностью фосфатидилинозитол-3-фосфатазы Sac1 фосфатазы Sac1 [Sac1(521-587)] с саморасщепляющейся последовательностью Tav2A, кодирующей пептидную последовательность EGRGSLLTCGDVEENPGP, обозначенную как pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP 8. Плазмида экспрессии, сращённая с Tav2A, также окружена нуклеотидными последовательностями, кодирующими домен FK506 рапамицина связывающего (FRB) домен [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] или домен белка FK506-связывающим (FKBP) домен (MGVEKQVIRPGNGPPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). Плазмида термоядерного синтеза FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, обозначенная здесь как MAM-Tav2A, была создана для получения эквимолярных уровней экспрессии FRB-YFP-AKAP1(34-63) и Sac1(521-587)-CFP-FKBP для рационометрического анализа FRET. Sac1(521-587)-CFP-FKBP, обозначаемый как ER-CFP, является донорским фтором, тогда как Mito-YFP-FRB, обозначаемый как Mito-YFP, является акцепторным флуорофором, который генерирует FRET при разделении на ~10нм 8. Таким образом, биосенсоры на базе FRET обнаруживают узкие MAM (6-10 нм, ширина зазора). FRB и FKBP были введены для индуцирования сокращения ширины зазоров MAM при добавлении рапамицина в зависимости от дозы, что можно было количественно измерить, измеряя увеличенный сигналFRET 8.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Трансфекция

  1. Трансфектировать клеткиN2A APP с плазмидой экспрессии MAM-Tav2A (14-18 ч).
    1. Перед началом работы пластина 1 × 106 APPячеек N2A в каждую скважину с 6-колодцевыми пластинами с стеклянными покрытиями и поддерживают клетки в среде роста в течение 12–16 часов.
    2. Трансфект 1-3 мкг плазмиды MAM-Tav2A (дополнительный файл 1) с использованием реагента для трансфекции липофектамина согласно протоколу производителя.
    3. После 12-16 часов трансфекции проводите медикаментозное лечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте клетки, трансфекционированные с помощью экспрессионной плазмиды, кодирующей только донора (ER-CFP) или акцептора (Mito-YFP), которые используются в качестве фона FRET.

2. Лечение наркозависимости

  1. Лечите клетки N2A, экспрессирующие MAM-Tav2A, АПП Рапамицином (Rapa) или Rapalog (Log) (3-6 ч).
    1. Перед обработкой приготовьте запасные растворы (10 мм) Рапы и Бревна.
    2. Замените носители на свежие носители с 0 нМ, 100 нМ или 250 нМ Рапа или Лог.
    3. После 3 часов лечения добавьте 3,3% параформальдегида (PFA) для фиксации клеток.
    4. Подготовьте стекла к флуоресцентной конфокальной микроскопии, нанеся одну каплю антифейдного реагента.
    5. Закрепите чехлы поверх капли и аккуратно прижмите щипцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные накладки хрупкие и требуют осторожности. В качестве альтернативы стеклянным накладкам используйте стеклянные дно пластины. Основным недостатком использования стеклянных пластин является невозможность применения антифейдного реагента, что затрудняет визуализацию из-за отбеливания флуорофоров. НЕ используйте антифейдный реагент, содержащий DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол), так как его синяя флуоресценция мешает FRET между CFP и YFP.

3. Конфокальная микроскопия для флуоресцентно-резонансной передачи энергии (FRET)

  1. Поместите стекли под перевёрнутый микроскоп и отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока клетки не станут видимыми.
  2. Возбуждайте флуорофор с помощью лазера 440 нм и захватите изображения с помощью эмисии 468-503 нм для донорного CFP (FKBP-CFP-ER) или 525-565 нм для акцептора YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Регулируйте интенсивность сигнала с помощью встроенного флуоресцентного фильтра, пока фоновый сигнал не рассеится (он должен быть почти полностью чёрным).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для съёмки флуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения NIS Element AR использовался конфокальный микроскоп. Использовалось увеличение в 60 раз при разрешении 512 пикселей.
  4. Сохраняйте изображения в формате .nds.
  5. Выполнить спектральный ратиометрический анализ FRET.

4. Рационометрический анализ FRET (6–12 ч)

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентное излучение донора ER-CFP (468-503 нм) и акцептора Mito-YFP (525-565 нм) было обнаружено с помощью конфокального микроскопа. Программное обеспечение ImageJ использовалось для количественной оценки средней интенсивности флуоресценции пикселей после фонового вычитания. Соотношение интенсивности излучения YFP к CFP было рассчитано и использовано как индикатор для спектрального анализа FRET.

  1. Open Image J (Фиджи).
  2. Либо перетащите .nds-файл на Image J, либо нажмите File -> Open и выберите Image.
  3. На следующем экране выберите поле «Разделение каналов ».
  4. Нажмите на панель C = 0 .
  5. Нажмите на Анализ > Измерить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите среднее значение для последующего расчёта.
  6. Нажмите на Процесс -> Математика -> Вычитать.
  7. Встречайте среднее значение.
  8. Повторите шаг 4 для панели C = 1.
  9. Нажмите на инструмент выбора от руки .
  10. Обведите интересующую ячейку, затем нажмите Ctrl+ T, чтобы записать её в ROI.
  11. Нажмите на «Показать всё » внизу ROI, чтобы показать то, что вы уже выбрали.
  12. Выберите все выбранные ячейки и нажмите Измерить, запишите эти значения в Excel.
  13. Нажмите на панель C = 1 и выберите «Показать всё».
  14. Выберите все ячейки, снова нажмите «Измерить» и запишите эти значения в отдельный столбец в Excel.
  15. В Excel создайте функцию, которая накладывает значения донорского сигнала на реципиента (C0/C1). Это коэффициент FRET.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рационометрический анализ FRET обогащённых FACS клетокN2A APP , экспрессирующих MAM-Tav2A, показал дозозависимое повышение уровня Aβ40 после обработки рапамицином8. Рапамицин действует, ингибируя млекопитающую мишень сигнального пути рапамицина (mTOR), который, в свою очередь, снижает экспрессию TREM2 (триггерный рецептор, экспрессированный на миелоидных клетках 2) в микроглии, что приводит к снижению клиренса бляшек Aβ в моделях 5XFAD у мышей болезниАльцгеймера 11. Аналог рапамицина AP21967, обычно называемый рапалогом (Log), проявляет низкую аффинность к mTOR и, следовательно, относительно нетоксичен для клеток. Однако он сохраняет способность связываться с доменом FRB с той же аффинностью, что и рапамицин, благодаря компенсирующей мутации, формирующей полости (K2095P), введённой в доменFRB 12.

Лечение Rapa и Log увеличило отношение FRET (рисунок 1). Лечение практически не повлияло на уровень APP или других MAM-белков, таких как IP3R3 или VDAC1. Таким образом, увеличение плотных (<10 нм) MAM увеличивало генерацию Aβ invitro 8. Примечательно, что анализы FRET, проведённые в наивных клетках N2A, также дали схожие результаты.

figure-results-1
Рисунок 1: Сокращение ширины зазора MAM увеличило генерацию Aβ in vitro. (A) Схема индуцируемого стабилизатора CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-TAV2A), который подвергается саморасщеплению, генерируя эквимолярные уровни донора (CFP-FRB-ER или ER-CFP) и акцептора (Mito-FKBP-YFP или Mito-YFP), а также способствует FRET/FLIM при присоединении к эндогенным тугим MAM или при усилении плотного образования MAM путём индуцирования взаимодействия FRB и FKBP с рапамицином (Rapa) или его аналогом Rapalog (Log). (B) IB клеток, экспрессирующих MAM-Tav2A (Tav2A), демонстрируя эквимолярную экспрессию CFP-ER (синий бокс) и Mito-YFP (жёлтый квадрат) после саморасщепления Tav2A. (C) Конфокальные изображения клеток, обработанных ДМСО (Вех) или Рапа (250 нМ), переэкспрессирующих MAM-Tav2A. (D,E). Рационометрический анализ FRET клеток, обработанных без (Veh) или с 100 нМ рапамицином (Rapa) (D) или рапалогом (Log) (E). Значения FRET представлены в виде соотношений интенсивности между каналом 2 (465–500 нм) и каналом 1 (525–555 нм). Для каждого анализа FRET случайным образом выбиралось 40-50 клеток для генерации ROI по отдельности. Односторонний ANOVA. p < 0,0001. (F) Репрезентативное изображение западного блотклеток N2A APP, экспрессирующих MAM-Tav2A, после 24-часовой обработки ривастигимином (Riv: 0 или 50 мкм). MAM-Tav2A генерировал эквимолярные уровни донора (CFP-ER) и акцептора (Mito-YFP). (G) Количественное определение коэффициента FRET между донором и акцептором обработанного автомобилем (0 мкм) или обработанного Riv (50 мкм). (H) Aβ ELISA (Wako) в кондиционированной среде (CM) клеток, обработанных транспортными средствами (0 мкм) или обработанными Riv (50 мкм), показал значительное снижение уровня Aβ40 (pM) после обработки Riv-обработкой 50 мкм. n = 6, p < 0,001. (I) значения FRET (ratio) и Aβ (pM) подсчитываются в таблице. Рисунок был изменён из Зеллмераи др. 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: файл последовательности плазмид MAM-Tav2A. ДНК-последовательность плазмиды экспрессии, кодирующей ER-таргетированную последовательность Sac1 (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQ KEKID587), связанную с последовательностями FKBP и CFP, а также митохондрии-таргетированная последовательность AKAP1 (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63), связанная с FRB и YFP-последовательностью, привязанной к саморазрезающейся последовательности Tav2A (EGRGSLLTCGD VEENPGP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модуляция MAMs — это новая область исследований, имеющая потенциальные последствия для различных заболеваний, включая рак, метаболические нарушения и нейродегенеративныезаболевания 13. Многие фармакологические препараты, включая антагонист динеина LDC-3/Dynarrestin, антидиабетический препарат метформин и противораковый препарат сульфорафан, нарушают MAMs и в настоящее время находятся в стадии доклинических и клинических испытаний по раку и метаболическим нарушениям. Эти фармакологические агенты модулируют контакты ER-митохондрий или ширину контакта MAM, регулируя взаимодействия между белками, привязывающими MAM, такими как PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 и IP3R3 14,15,16,17,18,19,20. Антагонист сигма-1-рецептора (S1R) (NE-100) понизил MAMs и значительно снизил уровень аксонального Aβ в трёхмерной нейронной моделиAD 21. Недавний отчет показал, что потеря S1R увеличивает количество рыхлых MAM и снижает плотные MAM, что указывает на S1R как терапевтическую мишень для модуляции плотностиMAM 8,9.

Живая FRET (флуоресцентно-резонансная передача энергии) нейронов, полученных у трансгенных крыс болезни Альцгеймера (AD), выявила значительное нарушение в узких MAM (<10 нм), при этом не заметных изменений в рыхлых MAM (~20 нм) по сравнению с дикими, что были в контрольнойгруппе дикого типа 1. Индуцируемые стабилизаторы MAM на основе FRET/FLIM, включающие FRB и FKBP-индуцируемые домены димеризации рапамицина (Rapa)/rapalog (Log), экспрессируемые в клетках N2AAPP, показали, что лечение Rapa/Log повышает плотность MAM и увеличивает производство Aβ40 в дозозависимомвиде 8,9. Это дало первое доказательство того, что сужение ширины зазора MAM способствует амилоидогенной обработке. Одобренный FDA антиамнестический препарат ривастигимин, который в настоящее время проходит доклиническое исследование для лёгкой и умеренной стадииAD 22,23, значительно снизил уровень Aβ40 (p < 0,001), не изменив экспрессию VDAC1 или BACE1, а также не повлиял на частоту колокализации между CFP-ER и Mito-YFP 8,9. Ривастигимин, по-видимому, влияет на стабилизацию MAM, модулируя уровни белка митофузина-2 (MFN2)24. Это открытие совпадает с другими исследованиями, сообщающими, что ривастигмин снижает уровень Aβ в культивируемых нейронах и моделях мышей AD (3xTg)25,26. Поскольку ширина разрыва MAM регулирует различные клеточные процессы, необходимые для выживанияклетки 27, таргетная модуляция стабильности MAM может предложить более эффективную терапевтическую стратегию против накопления Aβ, чем полная дестабилизация MAM, что может привести к нежелательным побочным эффектам.

Основным ограничением метода является то, что рациометрическая техника FRET опирается на эквимолярную экспрессию донора и акцептора. Коэкспрессия экспрессионных плазмид, кодирующих донора или акцептора, приводит к непоследовательным результатам. Использование саморазрезающегося Tav2A, соединяющего донора и акцепторный биосенсор, обеспечивает эквимолярную экспрессию биосенсоров. Однако уровни экспрессии биосенсоров были проверены с помощью вестерн-блот-анализа перед FRET-анализом.

Рапамицин (Rapa) может быть не идеален для оценки влияния ужесточения MAM на выработку Aβ, поскольку он ингибирует млекопитающую мишень сигнального пути рапамицина (mTOR), что приводит к снижению уровня TREM2 (экспрессируемого рецептора триггера на миелоидных клетках 2) в микроглии и, соответственно, снижает клиренс бляшек Aβ в моделях мышей болезни Альцгеймера (AD) (5XFAD)11. В качестве альтернативы может использоваться аналоговый AP21967 рапамицина, обычно называемый рапалог (Log). Log обладает низкой аффинностью к mTOR, что делает его относительно нетоксичным для клеток. Тем не менее, он сохраняет способность связываться с FRB-доменом с аналогичной аффинностью к рапамицину благодаря введения компенсирующей мутации с образующей полости (K2095P) в доменеFRB 12.

Описанный метод имеет большое значение. Несмотря на доказательства нескольких доклинических исследований, показывающих многообещающее терапевтическое влияние синтетических или натуральных маломолекулярных модуляторов MAMs при раке и метаболических нарушениях, клинические испытания пока не проводились. Одной из основных причин этого является отсутствие надёжного метода, способного количественно измерять стабильность MAM, что является необходимым условием для разработки эффективных методов терапии. Для количественной оценки связи MAM между структурами и функциями требуется полный обзор клетки, что невозможно достичь для зрелых нейронов традиционным TEM или другими высокоразрешающими микроскопиями, но можно получить с малымувеличением 28. Таким образом, традиционные методы, такие как TEM, крио-TEM или сканирующая электронная микроскопия (SEM), могут обнаруживать клеточные структуры на наноуровне, но имеют ограничения в измерении степени стабилизации MAM, поскольку высокадинамичная природамитохондрий 29 иER 30,31 делает структуры MAMвременными 32,33,34 . Для изучения структурно-функциональной связи MAM было предложено измерять аксональную скорость митохондрий, соединённых с ER через плотные или свободные MAMs с помощью анализа живых клеток икимографии 8,9. Это соответствует сообщениям, показывающим снижение аксонального транспорта митохондрий в корковых нейронах из мозга AD35 и дифференцированных клеток ADcybrid 36. Несмотря на высокую количественную точность, метод живых клеток визуализации может быть неполезен для высокопроизводительного скрининга лекарств. В отличие от этого, анализ FRET/FLIM в будущем может применяться как более быстрый количественный метод, чем существующая микроскопия с живыми клетками или высокого разрешения, для выявления малых молекулярных терапевтических средств для АД.

Протокол FRET, описанный здесь, был продемонстрирован как применим, особенно в контексте искусственно индуцированной связи между ER и митохондриями. Его простота позволяет эффективно оценить стабильность контакта между ЭР-митохондриями и исследовать последствия на амилоидную патологию, что и является основной целью этого подхода. Мы стремимся дальше использовать этот метод для скрининга библиотеки потенциальных малых молекул, модулирующих MAM, в недавно разработанной трёхмерной (3D) платформе скрининга лекарствAD 37. Результаты будут чрезвычайно полезны при выборе потенциальных анти-Aβ маломолекулярных MAM-модуляторов13 in vitro , которые можно будет расширить для in vivo или клинических исследований в будущем.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни одного.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы искренне благодарим доктора Рудольфа Э. Танци, профессора Массачусетской общей больницы (MGH), за его проницательные комментарии к рукописи. Благодарим доктора Масато Маэсако, ассистент-профессора MGH, за то, что он поделился своим опытом в области анализов FLIM. Благодарим доктора Георгия Хайноцкого, профессора Университета Томаса Джефферсона в Филадельфии, за щедрое предоставление экспрессионных плазмид, кодирующих ER-CFP или Mito-YFP. Это исследование было поддержано Фондом лечения Альцгеймера для RB.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BSAFisher Scientific501781532
Конфокальный микроскоп Olympus FV3000RS (Токио, Япония)N/A
DMEM с добавкой GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6-лунковые пластинки VWR International41122107
GAPDH поликлональное антителоThermo Fisher ScientificPA1-988
Желатин VWR International9000-70-8
Генетикин (G418 сульфат)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP моноклональное антителоInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, версия 9.5.0N/A
ГепаринSigma-Aldrich H0200000
Программное обеспечение ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Инвертированный конфокальный микроскоп Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, версия 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris гель  InvitrogenNP0321BOX
Пенициллин/Стрептомицин/Амфотерицин B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Трипсин-ЭДТАGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

234234JoVE
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи