Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Развитие первичных культур эпителиальных клеток почечных канальцев человека в монослоях и трехмерных условиях

907 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67920

⸱

13 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fisiología Renal, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Buenos Aires (UBA), 2Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay (IFIBIO Houssay), Universidad de Buenos Aires – Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET), 3Servicio de Nefrología, Hospital General de Niños Pedro de Elizalde, 4Laboratorio de Fisiopatogenia, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протоколы получения первичных культур эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC) из коры головного мозга почек для разработки монослоев и трехмерных культур на внеклеточном матриксе (3D-HRTEC).

Аннотация

Первичные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC) выделяют из почек, удаленных у педиатрических пациентов, перенесших нефрэктомию по назначению отделения детской нефрологии больницы General de Pediatría Pedro de Elizalde, Буэнос-Айрес, Аргентина. Макроскопически нормальная кора почек отделяется от мозгового мозга почек и разрезается на фрагменты. Затем фрагменты коры головного мозга расщепляют в растворе Хэнка с добавлением 0,1% коллагеназы типа 1 и фильтруют через сетку размером пор 70 мкм для отделения почечных канальцев от клубочков. Почечные канальцы подвергаются вторичному перевариванию коллагеназой для выделения эпителиальных клеток. Наконец, ферментное расщепление останавливают, и эпителиальные клетки выращивают в колбах, содержащих RPMI 1640 с добавками ниже 5%CO2при 37 °C до слияния. Клетки HRTEC могут быть выращены в виде монослоев на 96-луночных планшетах, стеклянных покровных стеклах в 24-луночных планшетах или держателях для клеточных культур, покрытых коллагеном. Кроме того, трехмерные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (3D-HRTEC) получают из клеток HRTEC, посеянных на матрице базальной мембраны (БМ). Контролируется агрегация клеток и формирование структур трубчатой формы. В течение многих лет мы использовали первичные культуры HRTEC для изучения цитотоксического действия, вызванного токсином Шига в детской почке, которое приводит к патофизиологическим изменениям, приводящим к гемолитико-уремическому синдрому (ГУС). Как HRTEC, так и 3D-HRTEC могут быть использованы для оценки воздействия различных токсинов, синтетических препаратов, биологических факторов, гормонов и т.д., в частности, на эпителий проксимальных канальцев почек человека.

Введение

В нашей группе первичные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC), полученных в монослоях и в трехмерных (3D-HRTEC) условиях, были использованы для изучения в детской почке цитотоксического действия шигатоксина 2-го типа (Stx2), вызванного желудочно-кишечной инфекцией Escherichia coli (STEC), продуцирующей шига-токсин.

Stx1 и Stx2 (Stxs) являются основными факторами вирулентности STEC, способными вызывать постдиарейный гемолитико-уремический синдром (ГУС)1. ГУС является системным осложнением, которое поражает около 5-10% детей, инфицированных STEC, и состоит из гемолитической анемии, тромбоцитопении и острого повреждения почек (ОПП) у детей, требующих поддерживающего лечения2. В Аргентине STEC-HUS является эндемическим заболеванием с ежегодной заболеваемостью 6,52 случая на 100 000 детей в возрасте до 5 лет (самый высокий показатель в мире), что является одной из ведущих причин острого повреждения почек3. Несмотря на то, что смертность составляет менее 4%3, примерно у 50% пациентов развиваются почечные последствия, которые являются второй по частоте причиной трансплантации почки в нашейстране4,5.

Перед интернализацией и проявлением своего цитотоксического действия Stx2 специфически связывается с гликолипидным рецептором глоботриаозилцерамида (Gb3), экспрессируемым на клеточной поверхности органов-мишеней6. Почки являются основным органом, повреждаемым Stxs из-за наличия Stx-чувствительных клеток, которые экспрессируют большое количество биологически активных рецепторов Gb3 в эпителиальных и эндотелиальных клетках почек 7,8.

Предыдущие работы, проведенные в HRTEC, культивируемых в виде монослоев, показали, что Stx2 ингибирует синтез белка, снижает жизнеспособность и пролиферацию клеток, а также индуцирует апоптоз и некроз 9,10,11,12. Кроме того, воздействие на 3D-HRTEC Stx2 ингибировало миграцию клеток и развитие канальцевых структур с характеристиками проксимальных канальцев почек12,13.

Первичные культуры HRTEC и 3D-HRTEC также были использованы для оценки влияния эстрадиола на пролиферацию клеток путем измерения включения 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клеток в S-фазе клеточного цикла14.

Для выделения эпителиальных клеток мы начинаем с фрагментов почек, полученных в результате детских нефрэктомий, показанных для коррекции урологических заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Комитет по этике Генерального госпиталя де Ниньос Педро де Элисальде одобрил использование почечных тканей человека для разработки первичных клеточных культур в исследовательских целях. Было получено письменное информированное согласие от ближайших родственников или опекунов от имени детей на использование образцов почек для исследования.

ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC) получены от педиатрических пациентов, перенесших нефрэктомию, показанную для коррекции урологических состояний или резекции опухоли, в Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde в Буэнос-Айресе, Аргентина.

1. Разработка первичных культур эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты коры головного мозга почек препарируются из почек, удаленных у педиатрических пациентов, перенесших нефрэктомию в больнице. Первичный посев HRTEC проводят в соответствии со методом, описанным ранее11.

Протокол описывается в следующих этапах:

  1. Храните фрагмент почки в холодильнике в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) или сбалансированном растворе соли Ганкса (Hanks) до тех пор, пока он не будет обработан в лаборатории.
  2. Рассеките почечную капсулу щипцами. Отделите почечную кору от мозгового вещества и разрежьте ее на мелкие фрагменты размером около 1 мм.
  3. Для выполнения расщепления фрагменты почек помещают в стерильный раствор Ганкса без Ca+ и Mg2+, дополненный 0,1% коллагеназой I типа.
    1. Инкубировать почечные фрагменты в течение 30 мин при 37 °С с встряхиванием.
  4. Чтобы остановить пищеварение, добавьте один объем PBS, содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и промойте образец три раза центрифугированием при 160 × г в течение 10 минут в центрифуге, охлажденной при 4 °C. При каждом центрифугировании выбрасывайте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в том же растворе.
  5. Пропустите продукт пищеварения через поровую сетку размером 70 мкм, чтобы отфильтровать канальцы и отбросить клубочки, которые остаются в фильтре.
  6. Отфильтрованные канальцы центрифугируют при 160 × г в течение 10 мин при 4 °С, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в стерильном растворе Ганкса, без Ca+ и Mg2+, с добавлением 0,2% коллагеназы I типа.
    1. Инкубировать образец в течение 30 минут при 37 °C с встряхиванием.
  7. Чтобы остановить пищеварение, добавьте один объем PBS, содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    1. Промойте образец три раза, центрифугируя при 160 × г по 10 мин каждый в центрифуге, охлажденной при 4 °C. При каждом центрифугировании выбрасывайте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в том же растворе.
  8. После последнего центрифугирования суспендировать клеточную гранулу в 5 мл полной питательной среды (RPMI 1640 с добавлением 5% FBS, L-глутамина [2 ммоль/л], пенициллина [100 Ед/мл], стрептомицина [100 мкг/мл] и добавки для роста эндотелиальных клеток [ECGS, 1%]).
    1. Высейте клеточную суспензию в колбу2 см 2 с вентилируемой крышкой.
    2. Инкубируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере и 5%CO2.
  9. На следующий день промойте культуру клеток 3 раза, выбросив жидкость из колбы, добавив по 5 мл PBS в каждую, и добавив в колбу 5 мл полной питательной среды. Эти промывки удаляют эритроциты и фрагменты канальцев, которые не были полностью переварены и не прикреплены к колбе с культурой.
  10. Инкубируйте эпителиальные клетки в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C, позволяя им расти монослоем до слияния.
  11. Меняйте среду на свежую полную питательную среду каждые 3 дня и ежедневно наблюдайте за культурой клеток под инвертированным микроскопом.

2. Разработка трехмерных культур HRTEC (3D-HRTEC)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе представлены шаги по созданию трехмерных культур (3D-HRTEC). Посевы 3D-HRTEC проводят в соответствии с методом, описанным ранее12.

  1. Используйте БМ-матрицу из мышиной саркомы Энгельбрета-Холма-Роя. Эта матрица БМ поставляется замороженной, и в таком состоянии она остается твердой. Раствор матрицы БМ разморозить на ночь на ледяной бане в холодильнике при температуре 4 °С, как указано производителем.
  2. Охладите наконечники в морозильной камере перед размещением матрицы BM и оставьте многолуночную пластину на льду, чтобы предотвратить затвердевание матрицы во время процесса.
  3. Возьмите аликвоту жидкой матрицы БМ (150 мл/см2) и поместите ее в каждую лунку пластины, чтобы покрыть дно лунки. Инкубируйте планшет в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C в течение 1 ч, чтобы матрица BM перешла в гелевое состояние.
  4. Между тем, чтобы отделить сливающиеся первичные культуры HRTEC, выбросьте питательную среду из колбы и добавьте 1 мл 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА.
    1. Распределите жидкость по всей поверхности колбы и инкубируйте в течение 5 мин при температуре 37 °C в инкубаторе для клеточных культур.
    2. Понаблюдайте под перевернутым микроскопом, все ли клетки отделились.
  5. Ресуспендируйте клетки в 10 мл питательной среды или PBS, пропустите их в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 160 × г в течение 10 мин при 4 °C.
    1. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной питательной среде, содержащей те же добавки, которые используются для первичных культур HRTEC.
    2. Подсчитайте количество клеток в камере Нейбауэра.
  6. Затравите 4 × 104 клеток/150 μл на лунку на матрицу BM. Инкубируйте клеточную культуру в течение нескольких дней в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C, во влажной атмосфере и с 5%CO2.
  7. Меняйте среду каждые 2 дня на свежую среду.
  8. Мониторинг агрегации клеток и формирования структур трубчатой формы под инвертированным оптическим микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Конфлюентные первичные культуры HRTEC показали аналогичную морфологию, наблюдаемую при световой микроскопии (Рисунок 1). Клетки характеризовали иммунофлуоресценцией, как описано в наших предыдущих публикациях, с использованием антител против аквапорина 1 (AQP1) и PECAM CD31 9,12,13. Иммунофлюоресцентные исследования показали, что более 90% HRTEC были положительными на AQP1, что свидетельствует об их...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первичные посевы должны быть выполнены в тот же день проведения нефрэктомии. Первичные культуры HRTEC могут быть использованы между 1-5 пассажами, чтобы гарантировать морфогенетическую стабильность клеток. После пятого пассажа клетки начинают изменять свою морфологию, демонстрируя фибробластоподобный вид или увеличивая вакуоли, и могут переходить в состояние покоя.

Если используется более крупный фрагмент почки, ДНК, высвобождаемая в результате лизиса клеток п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарны команде детских урологов в "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Буэнос-Айрес, Аргентина, за предоставленные образцы почек. Эта работа была поддержана грантами К. Зильберштейна из Университета Буэнос-Айреса (UBACYT20020190100072BA) и К. Ибарры и К. Зильберштейна из Национального совета по научным и техническим исследованиям (CONICET: PUE 0041). Эта работа была частично поддержана Иберо-американской программой науки и технологий в области развития (CYTED) (через Red STEC/SUH Nº 224RT0152).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа I типаSigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США637958
Добавка для роста эндотелиальных клетокSigma Merck, Сент-Луис, Миссури, СШАЕ2759
Матрица базальной мембраны MatrigelBD Biosciences, США; Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США356234
70 μ m Фильтр с поровой сеткойBD Bioscience, Массачусетс, СШАКод CSS010070
RPMI 1640 среда с L-глутамином Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, СШАР8758-500мл
Хэнкс Сбалансированный раствор соли  Без Ca2+ и Mg2+Gibco Invitrogen, Нью-Йорк, США14175046
Раствор трипсин-ЭДТАSigma Merck, Сент-Луис, Миссури, СШАТ4049

Ссылки

  1. Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
  2. Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
  3. Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
  4. Alconcher, L. F., Lucarelli, L. I., Bronfen, S., Meni Battaglia, L., Balestracci, A. Dynamic evolution of kidney function in patients with STEC-hemolytic uremic syndrome followed for more than 15 years: unexpected changes. Pediatr Nephrol. 40 (1), 143-150 (2025).
  5. Monteverde, M. L., et al. A decrease in the incidence of Shiga toxin-related hemolytic uremic syndrome as a cause of kidney transplantation at an Argentine Referral Center. Pediatr Transplant. 27 (4), e14489(2023).
  6. Sandvig, K., van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J. 19 (22), 5943-5950 (2000).
  7. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga toxin mechanisms of action in renal disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  8. Karpman, D., et al. Apoptosis of renal cortical cells in the hemolytic-uremic syndrome: in vivo and in vitro studies. Infect Immun. 66 (2), 636-644 (1998).
  9. Pistone Creydt, v, Silberstein, C., Zotta, E., Ibarra, C. Cytotoxic effect of Shiga toxin-2 holotoxin and its B subunit on human renal tubular epithelial cells. Microbes Infect. 8, 410-419 (2006).
  10. Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
  11. Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
  12. Márquez, L. B., Araoz, A., Repetto, H. A., Ibarra, F. R., Silberstein, C. Effects of Shiga toxin 2 on cellular regeneration mechanisms in primary and three-dimensional cultures of human renal tubular epithelial cells. Microb Pathog. 99, 87-94 (2016).
  13. Sánchez, D. S., et al. Eliglustat prevents Shiga toxin 2 cytotoxic effects in human renal tubular epithelial cells. Pediatr Res. 91 (5), 1121-1129 (2022).
  14. Sánchez, D. S., et al. Estradiol stimulates cell proliferation through classic estrogen receptors and GPER-1 in human renal tubular epithelial cell primary cultures. Biochem Biophys Res Commun. 512, 170-175 (2019).
  15. Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
  16. Chen, J., et al. Cooperative application of transcriptomics and ceRNA hypothesis: ln cRNA-00742/miR-116 targets CD74 to mediate vanadium-induced mitochondrial apoptosis in duck liver. J Hazard Mater. 480, 135904(2024).
  17. Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
  18. Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
  19. Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
  20. Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Развитие первичных культур эпителиальных клеток почечных канальцев человека в монослоях и трехмерных условиях
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.