Здесь мы описываем протоколы получения первичных культур эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC) из коры головного мозга почек для разработки монослоев и трехмерных культур на внеклеточном матриксе (3D-HRTEC).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Развитие первичных культур эпителиальных клеток почечных канальцев человека в монослоях и трехмерных условиях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC) выделяют из почек, удаленных у педиатрических пациентов, перенесших нефрэктомию по назначению отделения детской нефрологии больницы General de Pediatría Pedro de Elizalde, Буэнос-Айрес, Аргентина. Макроскопически нормальная кора почек отделяется от мозгового мозга почек и разрезается на фрагменты. Затем фрагменты коры головного мозга расщепляют в растворе Хэнка с добавлением 0,1% коллагеназы типа 1 и фильтруют через сетку размером пор 70 мкм для отделения почечных канальцев от клубочков. Почечные канальцы подвергаются вторичному перевариванию коллагеназой для выделения эпителиальных клеток. Наконец, ферментное расщепление останавливают, и эпителиальные клетки выращивают в колбах, содержащих RPMI 1640 с добавками ниже 5%CO2при 37 °C до слияния. Клетки HRTEC могут быть выращены в виде монослоев на 96-луночных планшетах, стеклянных покровных стеклах в 24-луночных планшетах или держателях для клеточных культур, покрытых коллагеном. Кроме того, трехмерные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (3D-HRTEC) получают из клеток HRTEC, посеянных на матрице базальной мембраны (БМ). Контролируется агрегация клеток и формирование структур трубчатой формы. В течение многих лет мы использовали первичные культуры HRTEC для изучения цитотоксического действия, вызванного токсином Шига в детской почке, которое приводит к патофизиологическим изменениям, приводящим к гемолитико-уремическому синдрому (ГУС). Как HRTEC, так и 3D-HRTEC могут быть использованы для оценки воздействия различных токсинов, синтетических препаратов, биологических факторов, гормонов и т.д., в частности, на эпителий проксимальных канальцев почек человека.
Введение
В нашей группе первичные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC), полученных в монослоях и в трехмерных (3D-HRTEC) условиях, были использованы для изучения в детской почке цитотоксического действия шигатоксина 2-го типа (Stx2), вызванного желудочно-кишечной инфекцией Escherichia coli (STEC), продуцирующей шига-токсин.
Stx1 и Stx2 (Stxs) являются основными факторами вирулентности STEC, способными вызывать постдиарейный гемолитико-уремический синдром (ГУС)1. ГУС является системным осложнением, которое поражает около 5-10% детей, инфицированных STEC, и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Комитет по этике Генерального госпиталя де Ниньос Педро де Элисальде одобрил использование почечных тканей человека для разработки первичных клеточных культур в исследовательских целях. Было получено письменное информированное согласие от ближайших родственников или опекунов от имени детей на использование образцов почек для исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные культуры эпителиальных клеток почечных канальцев человека (HRTEC) получены от педиатрических пациентов, перенесших нефрэктомию, показанную для коррекции урологических состояний или резекции опухоли, в Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde в ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Конфлюентные первичные культуры HRTEC показали аналогичную морфологию, наблюдаемую при световой микроскопии (Рисунок 1). Клетки характеризовали иммунофлуоресценцией, как описано в наших предыдущих публикациях, с использованием антител против аквапорина 1 (AQP1) и PECAM CD31 9,12,13. Иммунофлюоресцентные исследования показали, что более 90% HRTEC были положительными на AQP1, что свидетельствует об их.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Первичные посевы должны быть выполнены в тот же день проведения нефрэктомии. Первичные культуры HRTEC могут быть использованы между 1-5 пассажами, чтобы гарантировать морфогенетическую стабильность клеток. После пятого пассажа клетки начинают изменять свою морфологию, демонстрируя фибробластоподобный вид или увеличивая вакуоли, и могут переходить в состояние покоя.
Если используется более крупный фрагмент почки, ДНК, высвобождаемая в результате лизиса клеток п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарны команде детских урологов в "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Буэнос-Айрес, Аргентина, за предоставленные образцы почек. Эта работа была поддержана грантами К. Зильберштейна из Университета Буэнос-Айреса (UBACYT20020190100072BA) и К. Ибарры и К. Зильберштейна из Национального совета по научным и техническим исследованиям (CONICET: PUE 0041). Эта работа была частично поддержана Иберо-американской программой науки и технологий в области развития (CYTED) (через Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Коллагеназа I типа | Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США | 637958 | |
| Добавка для роста эндотелиальных клеток | Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США | Е2759 | |
| Матрица базальной мембраны Matrigel | BD Biosciences, США; Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США | 356234 | |
| 70 μ m Фильтр с поровой сеткой | BD Bioscience, Массачусетс, США | Код CSS010070 | |
| RPMI 1640 среда с L-глутамином | Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США | Р8758-500мл | |
| Хэнкс Сбалансированный раствор соли Без Ca2+ и Mg2+ | Gibco Invitrogen, Нью-Йорк, США | 14175046 | |
| Раствор трипсин-ЭДТА | Sigma Merck, Сент-Луис, Миссури, США | Т4049 |
Ссылки
- Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
- Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
