Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение поглощения аналога глюкозы, 6-(N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино)-6-дезоксиглюкозы, в интактной нервной сетчатке мышей

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67921

⸱

14 марта 2025 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Различные типы клеток сетчатки, включая эндотелиальные клетки, нейроны и глиальные клетки, экспрессируют переносчики глюкозы (GLUT), чтобы обеспечить поглощение глюкозы клетками. Используя ex vivo нервную сетчатку мыши и флуоресцентный аналог глюкозы 6-NBDG, мы описываем относительно быстрый и недорогой метод измерения поглощения глюкозы всей сетчаткой мыши.

Аннотация

Сетчатка представляет собой высокометаболическую ткань с несколькими типами клеток, требующих глюкозы и ее производных для производства энергии в форме АТФ. Клетки сетчатки, включая эндотелиальные клетки, нейроны, фоторецепторы и глиальные клетки, экспрессируют транспортеры глюкозы (GLUTs; например, GLUT1-4), чтобы обеспечить поглощение глюкозы для производства энергии. GLUT1 является наиболее обильно экспрессируемым транспортером глюкозы в сетчатке. Этот протокол позволяет исследователям измерять поглощение глюкозы в нервной сетчатке мыши в условиях ex vivo с использованием флуоресцентного аналога глюкозы 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-дезоксиглюкозы (6-NBDG). После диссекции сетчатки общий уровень 6-NBDG в сетчатке может быть легко определен с помощью измерения конечной точки флуоресценции с помощью планшетного ридера. Для консистенции мы рекомендуем нормализовать результаты до уровня общего белка. Несмотря на то, что 6-NBDG обладает высокой специфичностью для GLUT1, поглощение этого аналога обнаруживается в присутствии ингибитора GLUT1 BAY-876. Таким образом, этот анализ обеспечивает относительно быстрый и недорогой метод измерения поглощения глюкозы ex vivo в нервной сетчатке всей мыши, которая частично опосредована GLUT1.

Введение

Глюкоза является важным метаболитом для нервной сетчатки, где она используется для обеспечения высоких скоростей гликолиза и митохондриального дыхания для производства энергии в форме аденозинтрифосфата (АТФ)1. Поскольку глюкоза является предпочтительным энергетическим субстратом, многие клетки сетчатки экспрессируют транспортеры глюкозы (GLUT), чтобы облегчить поглощение глюкозы из сосудистой сети и окружающих тканей2. GLUT включают в себя семейство внутренних мембранных гликопротеинов, которые отвечают за транспорт глюкозыв клетки млекопитающих. GLUT transporter-1 (GLUT1) является основным транспортером глюкозы в сетчатке, экспрессируемым вовсех слоях сетчатки 4 и капиллярными эндотелиальными клетками, составляющими гемато-ретинальный барьер (BRB)5. Интересно, что при нейродегенеративных заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС), включая болезнь Альцгеймера, снижение уровня белка GLUT1 и поглощения глюкозы предшествует атрофии мозга и нейрональной дисфункции у человека 6,7. В модели глазной гипертензии на крысах более низкие уровни GLUT1 также наблюдались в капиллярах8. Сниженный транспорт глюкозы во внешнюю сетчатку участвует в потере фоторецепторов у животных моделей пигментного ретинита человека, а также может играть роль в нейродегенерации сетчатки, например, при глаукоме. Таким образом, необходимо понимание транспорта глюкозы в нервной сетчатке, чтобы установить ее роль в нейродегенерации сетчатки.

В данной статье мы описываем новый, недорогой и простой биохимический метод измерения поглощения 6-NBDG в нервной сетчатке мышей ex vivo , т.е. исключая пигментный эпителий сетчатки и сосудистую оболочку. По сравнению с другими флуоресцентными аналогами, такими как 2-NBDG, 6-NBDG состоит из глюкозной части, на которой флуоресцентная нитробензодиазоаминовая группа замещает гидроксильную группу на углероде 6, предотвращая фосфорилирование гексокиназой и дальнейшееметаболическое разрушение9. Несмотря на то, что 6-NBDG обладает высокой специфичностью к GLUT1 со сродством связывания в 300 раз выше, чем у глюкозы9, мы обнаруживаем поглощение этого аналога в присутствии ингибиторов GLUT110. Таким образом, этот анализ обеспечивает относительно быстрый и недорогой метод измерения поглощения глюкозы ex vivo во всей сетчатке мыши, которая частично опосредована GLUT1.

Измерение поглощения глюкозы тканями в режиме реального времени является сложной задачей, часто требующей радиоизотопного мечения или методов визуализации с высоким разрешением. В данном случае мы используем флуоресцентный биохимический анализ для быстрого определения поглощения 6-NBDG в нескольких образцах сетчатки в условиях ex vivo . Протокол предоставляет информацию об общем поглощении глюкозы сетчаткой; он не предоставляет информации об уровнях поглощения 6-NBDG клетками сетчатки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Университета Вандербильта.

1. Подготовка к анализу

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовку следует проводить в день проведения анализа непосредственно перед проведением анализа. Это необходимо из-за чувствительности протокола ко времени.

  1. Общая подготовка перед экспериментом
    ПРИМЕЧАНИЕ: 6-NBDG светочувствителен и должен быть защищен от света. Накройте все растворы 6-NBDG алюминиевой фольгой.
    1. Исходный раствор 5 мМ 6-NBDG в 50% DMSO/1x PBS стабилен при -20 °C в течение 6 месяцев. Приготовьте стоковый раствор и сохраните 500 мкл аликвот для будущих анализов.
    2. Положите на лед коническую трубку объемом 50 мл с нейробазальной средой А (без глюкозы).
    3. Убедитесь, что водяная баня установлена на 37 °C.
    4. Пометьте 4 × 1,5 мл микроцентрифужных пробирок на сетчатку: 1) глюкозное голодание, 2) инкубация 6-NBDG, 3) ультразвуковая обработка и 4) пробирка для сбора образца для анализа Пирса (т.е. если всего у вас четыре сетчатки, вам понадобится 16 микроцентрифужных пробирок). На рисунке 1 приведена краткая информация о настройке трубки.
    5. Добавьте 200 мкл нейробазальной среды А из конической пробирки объемом 50 мл на льду в предварительно помеченные ультразвуковые пробирки и положите на лед для шага 2.5.4.
    6. Питание на считывателе пластин.
    7. Настройте информацию о планшете в программном обеспечении для чтения планшетов с помощью функции анализа флуоресцентной конечной точки со следующими параметрами: возбуждение 483 нм, излучение 550 нм и пороговое значение 530 нм (параметры, заранее определенные для 6-NBDG).
  2. Подготовка реагента перед экспериментом: 6-NBDG
    1. Сделайте рабочий раствор 6-NBDG в нейробазальной среде А в конечной концентрации 500 мкМ путем разведения 5 мМ запаса, полученного на шаге 1.1.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте накрыть все растворы 6-NBDG алюминиевой фольгой. Приготовьте соответствующий объем рабочего раствора 6-NBDG в 500 мкМ для всего анализа (требуется 200 мкл рабочего раствора 6-NBDG на сетчатку; укажите дополнительный объем для погрешности и количество, необходимое для создания стандартных растворов, в шаге 2.4.).
    2. Пипетку 200 мкл рабочего раствора 6-NBDG в предварительно маркированные пробирки, изготовленные на этапе 1.1.4 для стадии инкубации 6-NBDG.

2. Проведение анализа поглощения 6-NBDG

ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговый обзор приведен на рисунке 2 .

  1. Диссекция ткани сетчатки
    1. Успокойте мышь с помощью ингаляционной анестезии изофлураном (2% изофлуран в 5% углекислом газе/95% кислорода).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышь адекватно обезболивается, ущипнув подушечку лапы на обеих задних лапах. При правильном обезболивании не должно быть никаких дергательных движений (рефлекс отхода педалей). Если есть рефлекторное движение, вернитесь к пункту 2.1.1.
    2. Усыпьте мышь путем вывиха шейки матки с последующим обезглавливанием, а затем быстро усыпьте глаза. Поместите энуклеированные глаза в чашку Петри, наполненную 5-10 мл ледяной нейробазальной среды А (без глюкозы) на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены основные рекомендации по диссекции нервной сетчатки (за исключением пигментного эпителия сетчатки и сосудистой оболочки); Для получения более подробных инструкций и рекомендаций обратитесь к ранее опубликованному протоколу11 и следуйте разделу «Диссекция сетчатки мыши».
    3. Поместите чашку Петри под диссекционный микроскоп на лед.
    4. Сложите безворсовую салфетку в небольшой квадрат и смочите его нейробазальным фильтром А.
    5. Нанесите глаз на влажную безворсовую салфетку с помощью пластиковой пипетки для переноса с обрезанным концом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безворсовая салфетка обеспечивает повышенное трение, предотвращая движение глаза во время вскрытия.
    6. Возьмите иглу 26 G и проколите сторону роговицы перед лимбом.
    7. С помощью ножниц Vannas разрежьте вдоль лимба от точки прокола до удаления роговицы.
    8. После удаления роговицы захватите склеру на полпути между лимбом и диском зрительного нерва с помощью щипцов. С помощью другой пары щипцов в противоположной руке возьмитесь за линзу и быстро снимите ее одним быстрым движением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если хрусталик удаляется медленно, сетчатка будет оставаться прикрепленной к хрусталику и ее будет трудно препарировать.
    9. Переложите наглазник в чашку Петри с холодным нейробазалом А на льду.
    10. Используя щипцы обеими руками, возьмите наглазник и осторожно держите чашку у ora serrata.
      1. Чтобы освободить чашечку сетчатки от склеры, зажмите склеру с помощью щипцов, стараясь не зажать ткань сетчатки.
      2. Осторожно проведите щипцами между склеральной тканью и тканью сетчатки по всему глазному яблоку, пока вся сетчатка не освободится от лимба.
    11. С помощью ножниц Ваннас сделайте небольшой разрез в склере в области лимба.
    12. Возьмите щипцы, чтобы захватить края разреза и отделить склеральную ткань вплоть до области головки зрительного нерва. Возьмитесь за склеру с помощью щипцов в недоминантной руке и аккуратно отведите сетчатку от склеры с помощью закрытых щипцов в доминирующей руке.
    13. Отрежьте ножницами корешок зрительного нерва, чтобы полностью отделить сетчатку от склеры и любого оставшегося зрительного нерва.
    14. Перенесите сетчатку с помощью обрезанной переносной пипетки в заранее подготовленную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для глюкозного голодания с шага 1.1.4, которая содержит 200 мкл нейробазально-А среды (без глюкозы)-1 сетчатки на пробирку.
  2. Этап глюкозного голодания
    1. Перенесите пробирки с шага 2.1.14 на водяную баню при температуре 37 °C и выдерживайте при 37 °C в течение 20 минут.
  3. Инкубация NBDG
    1. Перенесите каждую сетчатку в новую предварительно помеченную пробирку для инкубации 6-NBDG на этапе 1.1.4, которая содержит 200 μL 500 μM 6-NBDG в нейробазальной среде А на этапе 1.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка должна быть передана с помощью переводной пипетки, которая была вырезана для увеличения наконечника и переноса сетчатки с минимальными повреждениями. Кроме того, это можно сделать с помощью пинцета, если вы уверены в своей способности перенести сетчатку без повреждений.
    2. Переведите трубки на водяную баню при температуре 37 °C и инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут.
  4. Приготовление стандартов 6-NBDG (диапазон концентраций 0 мкМ-40 мкМ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стандарты в течение 60-минутного инкубационного периода 6-NBDG (шаг 2.3.2). Стандарты можно готовить при комнатной температуре. Защищайте растворы от света.
    1. Маркируйте микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл #1-8 для 8 стандартов (см. Рисунок 3).
    2. Для стандарта #1 (40 мкМ 6-NBDG) пипетка 32 мкл 500 мкМ 6-NBDG стокового раствора, выполненного на шаге 1.2.1.
    3. Добавьте 368 мкл нейробазальной среды А в микроцентрифужную пробирку и тщательно перемешайте пипетированием вверх и вниз.
    4. Для стандартов #2-8 последовательно разбавляйте образцы следующим образом:
      1. Пипетка 200 мкл нейробазальной среды А в пробирки #2-8.
      2. Возьмите 200 мкл из стандартной пробирки #1 и наденьте его пипеткой в пробирку #2, затем тщательно перемешайте с пипеткой, пипетируя вверх и вниз.
      3. Возьмите 200 μЛ из стандартной пробирки #2 и сделайте пипетку пипеткой в стандартную пробирку #3. Тщательно перемешайте с помощью пипетки, пипетируя вверх и вниз.
      4. Возьмите 200 мкл из стандартной пробирки #3 и направьте ее пипеткой в пробирку #4, затем тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
      5. Возьмите 200 мкл из стандартной пробирки #4 и направьте ее пипеткой в пробирку #5, затем тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
      6. Возьмите 200 μл из стандартной пробирки #5 и пипетируйте ее в пробирку #6, затем тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
      7. Возьмите 200 μЛ из стандартной пробирки #6 и пипетируйте ее в пробирку #7, затем тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
      8. В пробирку #8 не добавляйте дополнительный раствор (т.е. он должен содержать только 200 мкл нейробазальной среды А, добавленной на шаге 2.4.4.1.).
  5. Промывка, ультразвуковая обработка и центрифугирование для сбора образцов
    1. Извлеките все трубки из водяной бани при температуре 37 °C после завершения 60-минутной инкубации 6-NBDG.
    2. Промойте каждую сетчатку 500 мкл ледяной нейробазальной среды А как можно быстрее и тщательнее.
      1. Чтобы умыться, удалите раствор 6-NBDG с помощью пипетки, стараясь не касаться и не повреждать ткани сетчатки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Существует также возможность переноса сетчатки с помощью пинцета из инкубационной пробирки 6-NBDG в свежую пробирку, содержащую 500 мкл нейробазальной среды А. Затем вам нужно будет сделать всего 3 дополнительных промывки. Сделайте это, если вас устраивает ваша способность не повредить сетчатку пинцетом.
      2. Затем слейте раствор в соответствующий контейнер для отходов. Немедленно пипеткой внесите 500 мкл холодной нейробазальной среды в ту же пробирку взамен раствора, который был удален. Заменяйте трубки на льду между стирками.
    3. Повторите еще 3 раза, всего 4 стирки.
    4. С помощью переводной пипетки с обрезанным краем или пинцета осторожно перенесите сетчатку в ультразвуковые трубки, содержащие нейробазальную среду А на льду (см. шаг 1.1.4).
    5. Измельчите сетчатку на мелкие кусочки с помощью небольших ножниц для препарирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно мойте инструменты в этаноле между разрезаниями каждой сетчатки, чтобы не загрязнить другие образцы.
    6. Обрабатывайте каждую сетчатку ультразвуком в течение 5-10 с с амплитудой 10 и немедленно положите ее обратно на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно очистите ультразвуковой щуп между образцами 100% этанолом, а затем сверхчистым H2O. На этом этапе либо предварительно охладите центрифугу до 4 °C, либо используйте центрифугу в холодильной камере с температурой 4 °C, если таковая имеется.
    7. Центрифуга при 4 °C в течение 15 мин при максимальной скорости 21130 x g or, если она меньше 21130 x g.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время 15-минутной центрифуги на шаге 2.5.7 пипетируйте 100 мкл стандартов #1-8, изготовленных на шаге 2.4, в черную 96-луночную пластину с прозрачным дном.
  6. Считывание образцов на планшетном считывателе
    1. После окончания 15-минутной работы центрифуги удалите 100 мкл надосадочной жидкости и поместите пипетку в 96-луночный планшет.
    2. Вставьте пластину в считыватель пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планшет должен содержать 100 мкл каждого образца и 100 мкл каждого стандарта.
    3. В программном обеспечении для чтения планшетов выберите анализ флуоресцентной конечной точки с параметрами, выбранными на шаге 1.1.7.
    4. Запустите анализ и сохраните результаты.
    5. Пипетки с 96-луночного планшета в предварительно помеченные пробирки из 1.1.4 для анализа Пирса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут быть немедленно проанализированы на белок (см. ниже) или храниться при температуре -80 °C.
  7. Проба Пирса для нормализации белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения точности анализ Пирса должен проводиться в двух экземплярах (как стандартных, так и образцовых).
    1. Используя стандарты анализа предварительно разбавленных белков по методу Пирса, пипетку по 10 мкл каждого из них в двух экземплярах в 96-луночную прозрачную донную пластину.
    2. Пипетку по 10 мкл каждого из образцов в двух экземплярах, начиная с шага 2.6.5, в 96-луночный планшет.
    3. Добавьте 150 мкл реагента Пирса во все лунки, содержащие стандарты или образцы. Накройте пластину на 96 лунок и перемешивайте в шейкере на средней скорости в течение 1 минуты.
    4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
    5. Вставьте пластину в считыватель пластин. Выберите анализ конечной точки поглощения и установите длину волны на 660 нм.
    6. Измерьте впитываемость стандартов и образцов и сохраните результаты. Рассчитайте общее содержание белка в микрограмме в каждом образце, построив стандартную кривую.
  8. Расчет поглощения 6-NBDG сетчаткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты 6-NBDG должны быть нормализованы по общему содержанию белка из-за неравномерных размеров сетчатки.
    1. Используя значения интенсивности флуоресценции, полученные на шаге 2.6, используйте показания флуоресценции от заранее определенных стандартов для построения стандартной кривой флуоресценции 6-NBDG и количественного определения концентрации 6-NBDG (μM) в каждом образце.
    2. Нормализуйте результаты образца до соответствующего количества белка для определения белка [6-NBDG] μM/μг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 4 представлены репрезентативные измерения флуоресценции глюкозы из сетчатки мыши WT, инкубированной с 6-NBDG в течение различных периодов времени. После 30-минутной инкубации уровни 6-NBDG составляли в среднем 336 ± 27,91 а.е., тогда как через 60 минут уровни 6-NBDG увеличивались в среднем до 616,3 ± 8,38 а.е. Дальнейшая инкубация в течение 30 мин привела к снижению уровня 6-NBDG (506,4 ± 5,3 а.е.). Через 60 мин вариабельность результатов была минимальной и, таким образом, было вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Таким образом, описанный метод позволяет исследователям фундаментальных наук измерять поглощение флуоресцентного аналога глюкозы, 6-NBDG, в мышиной нервной сетчатке ex vivo . Глюкоза является важным метаболитом для нервной сетчатки, ее поглощение поддерживает высокие показатели гликолиза и митохондриального дыхания, необходимые для производства энергии в форме аденозинтрифосфата (АТФ)1. Поскольку глюкоза является предпочтительным энергетическим субстратом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась из неограниченных ведомственных фондов, предоставленных Лорен К. Уэрхэм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
# 5 щипцовKatenaK5-6550Используется для диссекции сетчатки
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" иглаsol-M112658Используется для прокола роговицы во время диссекции
5 мл пробирокMTC bioc2540
50 мл пробирокAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Флуоресцентный аналог гукозы
96 луночных пластин черного цвета с прозрачным дномThermo Fisher Scientific265301
Анестетик Угольный фильтр КаннистерReFreshEZ-258Используется в анестезиологической установке
BAY-876Millipore SigmaSML1774Для ингибирования GLUT1.
Центрифуга при 4°°; CEppendorfEPP-5424
Сжатый газ (5% углекислого газа, 95% кислорода)Воздушный газUN3156Используется при установке изогнутых
щипцовRoboz хирургический инструментRS-5137Используется для диссекции сетчатки
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraИспользуется после этанола для очистки ультразвукового аппарата между образцами
Препарирующий микроскопOlympusszX12Используется для рассечения сетчатки
Этанол 200 proofDecon laboratories2701Используется для очистки ультразвука между образцами
Пенопластовый плавающий штатив для трубокThermo Fisher Scientific36-099-2328Для трубок во время инкубации в водяной бане ступени
Общие ножницыХирургический инструментRoboz RS-680Используется для сетчатки глаза диссекция
Изофлуран 250 мл флаконPiramal critical careNDC   6679401725Оборудование для анестезии
ИзофлуранVetequip продается VWR89012-492Используется для обезболивания перед эвтаназией
Kim салфеткиVWR82003-820
Считыватель микропланшетовМолекулярные устройстваSpectraMax M2 Считыватель микропланшетовИспользуется для считывания образца
Нейробазальная средаGibco12349-015
Носовой конус (низкий профильная маска для анестезии)Kent ScientificSOMNO-0801Используется для проведения анстезии
Объектив на препарирующем микроскопеOlympusDF plapo 1x pfИспользуется для диссекции сетчатки
чашкаПетри VWR25384-088Используется при диссекции сетчатки
Пробирный реактивThermo Fisher Scientific1861426
Наконечники для пипеток P20Olympus Пластмассы26-404
Наконечники для пипеток P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Пипетки для пипеток P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
программное обеспечение SoftMax Pro на компьютереМолекулярные приборыSoftMax Pro 7 программноеобеспечение используется для считывания образца
звукового дисмембранораThermo Fisher НаучнаяFB50110Образец ультразвука (сетчатка)
Переносные пипеткиFisherbrand13-711-9AMИспользуются для переноса сетчатки из одной пробирки в другую
Весенние ножницы VannasKatenaK4-5000Используются для рассечения сетчатки
Водяная баня установлена на 37 градусов; CН/ДН/ДИспользуется для инкубации
для анестезии

Ссылки

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881(2021).
  2. Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival. FASEB J. 36 (8), e22428(2022).
  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
  5. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).
  6. Winkler, E. A., et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).
  7. Mosconi, L., et al. Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease. J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).
  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
  9. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).
  10. Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters. Biochimie. 190, 1-11 (2021).
  11. Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies. J Vis Exp. 119, e55173(2017).
  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807(2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Поглощение глюкозыфлуоресцентный аналог глюкозыпоглощение 6-NBDGдиссекция сетчаткианализ на планшетном ридеретранспортеры глюкозыингибитор GLUT1нормализация белкасетчатка ex vivo
Измерение поглощения аналога глюкозы, 6-(N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино)-6-дезоксиглюкозы, в интактной нервной сетчатке мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.