Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация биопленки Proteus mirabilis со сверхвысоким разрешением с помощью экспансионной микроскопии

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67932

⸱

18 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлен комплексный протокол для PmbExM, метода экспансионной микроскопии, разработанного специально для биопленок Proteus mirabilis . PmbExM использует ступенчатую ферментативную обработку образцов биопленки для достижения изотропного 4,3-кратного расширения, что позволяет проводить анализ пространственной организации клеточных и субклеточных структур в этих сидячих микробных сообществах со сверхвысоким разрешением.

Аннотация

Доступ к подробной визуальной информации и количественным данным из микробиологических образцов с помощью обычной оптической микроскопии ограничен дифракционным барьером. Одним из решений для повышения разрешения является экспансионная микроскопия (ExM), инновационный и экономичный метод сверхвысокого разрешения, который физически увеличивает образцы примерно в четыре раза по сравнению с их исходным размером. Для успешного расширения необходимо гомогенизировать механические свойства биологического материала. Биопленки представляют собой бактериальные сообщества, прилипающие к поверхности и встраивающиеся во внеклеточный матрикс, который они производят; они требуют адаптации протоколов ExM для размещения их уникальных структурных компонентов. В данной статье представлена биопленка Proteus mirabilis ExM (PmbExM), специализированный вариант ExM, позволяющий визуализировать биопленки P. mirabilis со сверхвысоким разрешением, выращенные в течение 48 ч. Протокол ориентирован на целенаправленную деградацию ключевых структурных компонентов образцов с помощью серийного ферментативного разложения, оптимизированного вблизи их теоретических условий. PmbExM использует комбинацию ферментов, включая α-амилазу, целлюлазу и литиказные гликозидгидролазы для гидролиза полисахаридов; мутанолизин для гидролиза пептидогликанов; и протеиназа К для гидролиза белка. Эти процедуры разложения не зависят от процесса гелеобразования, что позволяет модифицировать их для удовлетворения конкретных требований к гомогенизации в различных моделях биопленки. Эта приспособляемость открывает широкие возможности для применения в различных видах бактерий и условиях произрастания. ExM применялся к различным видам биопленок с общими субоптимальными коэффициентами расширения. В отличие от этого, PmbExM достигает теоретического максимального коэффициента расширения стандартного акриламид-акрилатного гидрогеля ExM без существенного искажения морфологии или топологии. Целью данной работы является создание доступного протокола сверхвысокого разрешения для визуализации архитектуры, сборки, клеточных и внутриклеточных особенностей биопленок P. mirabilis .

Введение

Флуоресцентная микроскопия является широко используемым инструментом для изучения архитектуры, состава и функции биопленки1. Тем не менее, способность оптической микроскопии разрешать структурные, клеточные и субклеточные особенности биопленок ограничена дифракционным барьером. Экспансионная микроскопия (ExM) — это инновационный, доступный и простой в использовании метод сверхвысокого разрешения, который имеет большой потенциал для выявления структуры биопленки за пределами дифракционного предела 2,3. ExM повышает разрешение, изотропно увеличивая биологические образцы примерно в четыре раза по сравнению с их исходным размером. Способ включает полимеризацию in-situ набухающего ионного гидрогеля по всему образцу с сохранением относительного пространственного расположения молекулярных мишеней при тщательном нанесении 4,5.

Для правильной работы ExM гомогенизация механических свойств биологического материала является важнейшим шагом6. Стандартные варианты ExM были разработаны на клеточных культурах и тканях млекопитающих, где они эффективно достигали гомогенизации только путем протеолитического расщепления протеиназы К 4,5 или денатурации мягкого белка с помощью детергентов и автоклавирования7, что давало изотропное 4-кратное расширение. Однако в случае бактерий и бактериальных биопленок пептидогликановая клеточная стенка и элементы матрицы EPS, такие как структурные полисахариды, являются препятствиями для расширения 2,3,8,9.

В этой статье описываются процедуры экспансионной микроскопии биопленки Proteus mirabilis (PmbExM), адаптированного варианта ExM, предназначенного для расширения биопленок P. mirabilis, клинически значимой грамотрицательной палочки, связанной с высокой устойчивостью к антибиотикам и катетер-ассоциированными инфекциями мочевыводящих путей10. PmbExM использует комбинацию мутанолизина, α-амилазы, целлюлазы, литиказы и ферментативных препаратов протеиназы К для гидролиза клеточной стенки пептидогликана, полисахаридов и белков соответственно. Результаты показывают, что этот метод позволяет достичь 4,3-кратного изотропного расширения 48-часовых биопленок P. mirabilis . Этот метод позволяет визуализировать архитектуру биопленки P. mirabilis со сверхвысоким разрешением, сборку и внутриклеточные особенности с помощью двойногоокрашивания. Кроме того, PmbExM может быть адаптирован к другим моделям биопленки путем корректировки обработки ферментов в соответствии с целевыми видоспецифичными компонентами биопленки.

Целью данной статьи является подробное описание процедур, связанных с гелеобразованием, разложением, расширением и монтажом образцов биопленки для PmbExM. Кроме того, в этой работе описываются условия роста бактерий, форматы образцов и методы флуоресцентного окрашивания, используемые авторами, а также процедура обработки и анализа данных, которая может быть легко применена исследователями с ограниченным опытом обработки изображений. Для получения более полного и подробного руководства по обработке и анализу изображений, пожалуйста, обратитесь к Castagnini, D. et al.3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Общий процесс PmbExM обобщен на рисунке 1. Пожалуйста, обратитесь к Дополнительному файлу 1 , чтобы найти состав всех названных растворов (т.е. раствор мономера, раствор для расщепления протеиназы К и т.д.), использованных в данной работе. Аналогичным образом, обратитесь к Дополнительному файлу 2, Дополнительному файлу 3 и Дополнительному файлу 4 для упрощенной процедуры обработки и анализа данных, которая может быть использована исследователями, не имеющими большого опыта в обработке изображений. Протокол может быть комфортно выполнен в течение 2,5-3 недель: первая неделя посвящена очистке и стерилизации покровного стекла, выращиванию биопленки и фиксации образца; вторая неделя — окрашивание образцов и сам протокол PmbExM, а третья — монтаж образцов и получение изображений. Кроме того, рассмотрите 1 неделю предварительной подготовки для необходимых материалов и растворов. Подробная информация о реагентах, материалах, оборудовании и программном обеспечении, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Закрепление, полимеризация, расщепление и диализ протокола PmbExM для успешного расширения, наблюдения и анализа биопленки P. mirabilis . В левом столбце указаны шесть состояний выборки на выбранных этапах во время протокола расширения. Он начинается с фиксированного, пропитанного и окрашенного образца биопленки, следуя четырем промежуточным состояниям до окончательного гелеифицированного и расширенного состояния, готового к микроскопии и анализу изображений со сверхвысоким разрешением. ЭПС-матрица биопленки показана зеленым цветом, клеточная стенка бактерий представлена фиолетовыми линиями, общая структура белковой клетки показана серым цветом, а акриламид-акрилатный полимер ExM представлен волнообразными синими линиями. Все ферменты, участвующие в процессе, представлены символами Pac-Man: 3 гликозидгидролазы (зеленые) для гидролиза экзополисахаридов: α-амилаза, целлюлаза и литиказ; мутанолизин (фиолетовый) для деградации пептидогликановой клеточной стенки; и протеиназа К (серый) для общего переваривания белка. Цвета символов Pac-Man соответствуют соответствующим целевым структурам. Все объекты, показанные с низкой непрозрачностью или пунктирными границами, представляют собой состояние ферментативной деградации. Этот рисунок модифицирован из Castagnini, D. et al.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Очистка и стерилизация стеклянных покровных стекол для образования биопленки

  1. Ультразвуком 12 мм стеклянную покровную пленку погружают в 1 М гидроксид натрия в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем обильно промывают деионизированной водой.
  2. Ультразвуком очистите покровные стекла в этаноле 70% (v/v) в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем промойте 95% (v/v) этанолом.
  3. Дайте покровным стеклам высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
  4. Стерилизовать автоклавированием.

2. Рост биопленки Proteus mirabilis

  1. Выращивайте P. mirabilis в 10 мл бульона Luria Bertani (LB) в течение 24 ч при температуре 37 °C без встряхивания.
    Примечание: Коммерчески доступный штамм типа P. mirabilis (см. Таблицу материалов) был приобретен и использован в этом исследовании, но рекомендуется использование любого легкодоступного штамма P. mirabilis .
  2. Возьмите 1 мл из культуры и добавьте его в 9 мл свежего и стерильного бульона LB, чтобы получить бактериальную суспензию в соотношении 1:10.
  3. Проверьте оптическую плотность (OD) на длине волны 600 нм бактериальной суспензии 1:10 равной 0,1. При необходимости отрегулируйте, добавляя небольшие объемы свежей культуры LB или P. mirabilis до тех пор, пока она не достигнет OD600 = 0,1.
  4. Введите стеклянные покровные стекла 12 мм (предварительно очищенные и стерилизованные) в стерильную полистирольную 24-луночную пластину (по одному покровному стеколу на лунку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вся поверхность покровного стекла касается дна колодца. Биопленка будет образовываться на той стороне покровного стекла, которая обращена вверх.
  5. Засейте лунки планшета 350 мкл бактериальной суспензии наружным диаметром600 = 0,1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется засевать только внутренние лунки пластины, в то время как наружные лунки (т.е. лунки в рядах А и D и в столбцах 1 и 6) заполнять стерильной водой или бульоном ЛБ. Это связано с тем, что внешние колодцы подвержены более высокой скорости испарения жидкости, чем внутренние скважины, что влияет на рост биопленки.
  6. Поместите засеянную пластину внутрь инкубатора и расположите ее под углом 45 градусов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте обычные лабораторные материалы, такие как центрифужные пробирки объемом 50 мл или коробки для наконечников для микропипеток. Наклоненное положение позволит сформировать на поверхности покровных покрытий воздушно-жидкостную границу раздела, на которой биопленка P. mirabilis установит свою самую толстую область.
  7. Дайте биопленкам образоваться в течение 48 ч при 37 °C, не встряхивая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка для выращивания биопленки не подходит для инкубации продолжительностью более 48 часов из-за высыхания биопленки из-за испарения среды.

3. Фиксация и хранение биопленочных образцов

  1. Осторожно извлеките питательную среду из лунок и дважды осторожно промойте биопленконесущие покровные стекла стерильным фосфатным буферным раствором (PBS) в течение 5 минут при комнатной температуре при очень слабом перемешивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разрушения биопленок при повторяющемся обмене жидкости, используя небольшие объемы для инкубации или промывки. 300-400 мкл жидкости достаточно для погружения биопленок в 24-луночный планшет. Настоятельно рекомендуется медленное и методичное пипетирование, а также избегание прямого попадания обменных растворов на биопленки.
  2. Осторожно удалите PBS и замените его 400 мкл 4% (w/v) параформальдегида (PFA) в PBS на 20 минут при комнатной температуре для фиксации биопленки.
  3. Удалите PFA и замените его 300 мкл 1% PBST (1% v/v Triton X-100 в PBS) для пермеабилизации клеток. Выдерживать 20 минут при комнатной температуре.
  4. Замените 1% раствор PBST на 300 мкл 0,3% PBST (3% против Triton X-100 в PBS). Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.
  5. Удалите 0,3% PBST и замените его 300 μL смеси метанола и 0,3% PBST в соотношении 50:50 для обезвоживания образца. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем заменить смесь 1 мл абсолютного метанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно добавьте 1 мл метанола, направляя его к стенкам колодца. Этот больший объем метанола используется для предотвращения его полного испарения во время хранения образца.
  6. Храните образцы при температуре -20 °C не менее 1 дня и не более месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется запечатывать пластины с помощью гибкой восковой пленки, чтобы замедлить испарение метанола и высыхание образцов.
  7. После использования последовательно регидратируйте образцы, заменив метанол на 300 мкл смеси метанола и 0,3% ПБСТ в соотношении 50:50, а затем на 300 мкл 0,3% ПБСТ при комнатной температуре.

4. Биопленочное флуоресцентное окрашивание

  1. Инкубируйте регидратированные образцы биопленки с 300 мкл 50 мкг/мл флуоресцентного лектинового конъюгата агглютинина зародышей пшеницы (далее просто РГА-конъюгат; см. Таблицу материалов) в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре для окрашивания клеточной стенки/капсулы/экзополисахаридов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с соответствующими темами, касающимися флуоресцентного окрашивания, в разделе «Обсуждение». С этого момента защищайте образцы от света.
  2. Удалите конъюгированный раствор WGA и дважды аккуратно промойте 300 мкл PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.

5. Шаги PmbExM

  1. Анкеровка MA-NHS и акриламид-акрилатная полимеризация
    1. Инкубировать окрашенные образцы биопленки с 400 мкл 1 мМ N-гидроксисукцинимидилового эфира метакриловой кислоты (MA-NHS) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре с легким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MA-NHS представляет собой активированный эфир, склонный к гидролизу в водной среде, поэтому обрабатывайте образцы сразу после приготовления 1 мМ в растворе PBS.
    2. Выполните три аккуратных промывки по 10 мин 300 μл PBS при комнатной температуре.
    3. Извлеките PBS и замените его 300 μл раствора мономера. Инкубировать в течение ночи (O.N.) при 4 °C.
    4. Постройте предварительные камеры гелеобразования. Используйте предметное стекло в качестве основы и поместите на него два куска сложенного двустороннего скотча, которые будут действовать как распорки размером 400 мкм. Расположите распорки на расстоянии 8-10 мм друг от друга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 2А для получения дополнительной ясности о том, как построить предварительную камеру гелеобразования. Используемый здесь двусторонний скотч имел толщину около 100 мкм, поэтому он был обрезан и сложен сам по себе, чтобы создать распорки размером 3 мм x 5 мм x 0,4 мм. Измерьте толщину имеющегося двустороннего скотча и расположите его соответствующим образом. Поглощение гелеобразующего раствора распорками ленты незначительно. В качестве альтернативы двустороннему скотчу круглые стеклянные покровные стекла толщиной 12 мм могут быть склеены каплями воды и сложены в кучу до необходимой высоты.
    5. Устраивайте влажные камеры для защиты образцов во время полимеризации от высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычную коробку с наконечниками для микропипеток можно легко превратить во влажную камеру, сняв пластиковый каркас наконечников и заменив его влажными бумажными полотенцами.
    6. Приготовьте свежий объем желирующего раствора путем тщательного смешивания объемов раствора мономера, 10 % (по массе) N, N, N', тетраметилэтилендиамина (TEMED), 0,5 % (по массе) 4-гидрокси-TEMPO (4-HT) и 10 % (по массе) персульфата аммония (APS) в пропорции 47:1:1:1 соответственно. Смешивайте APS с остальными реагентами на желирующем растворе только после выполнения шагов до 5.1.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем готового желирующего раствора будет зависеть от количества обрабатываемых образцов биопленки. Например, для обработки трех образцов биопленки готовят 900 мкл гелеобразующего раствора, смешивая 846 мкл раствора мономера с 18 мкл 10 % (по массе) TEMED, 18 μл 0,5 % (по массе) 4-HT и 18 μл 10 % (по массе) APS. Чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию, APS следует добавлять в смесь в последнюю очередь и только после того, как образцы, предварительные камеры гелеобразования и влажные камеры готовы к использованию. Поддерживайте все упомянутые реагенты и охлаждайте недавно приготовленный желирующий раствор во время этого этапа.
    7. Сразу после приготовления желирующего раствора аккуратно удалите раствор мономера и замените его 300 мкл прежнего. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 5 минут.
    8. Во время выполнения шага 5.1.7 снимите остатки защитного покрытия с полос двустороннего скотча, расположенных на предметных стеклах, и в пространство между ними поместите 40 μл гелеобразующего раствора.
    9. После выполнения шага 5.1.7 извлеките каждый покровный стекло с биопленкой из лунки и поместите его поверх капли гелеобразующего раствора объемом 40 мкл, предварительно нанесенной на предметное стекло. Ориентируйте покровное стекло так, чтобы биопленка на его поверхности контактировала с желирующим раствором.
    10. Завершите конструкцию камеры гелеобразования, аккуратно надавливая на биопленконесущую защитную крышку с помощью пинцета, чтобы обеспечить ее прилегание к двусторонним скотчовым прокладкам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта сэндвич-подобная установка состоит из так называемой камеры гелеобразования (Рисунок 2B).
    11. Дайте образцам полимеризоваться во влажной камере и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C без перемешивания.
    12. Визуализируйте образцы с помощью флуоресцентной микроскопии (см. шаг 6.2.1) без разборки камер гелеобразования для получения изображений с предварительным расширением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте гелеобразные образцы вне влажной камеры более чем на час, так как предварительно расширенные гели склонны к высыханию, что делает образец непригодным для использования. Пожалуйста, обратитесь к шагу SF2.3 (Дополнительный файл 2) для ознакомления с соответствующими процедурами приобретения перед расширением.
    13. Разберите камеры гелеобразования и обрежьте излишки геля вокруг интересующей области образца биопленки с помощью хирургического лезвия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется обрезать гели, чтобы облегчить работу с расширенными образцами и их монтаж. Кроме того, чтобы отслеживать пространственную ориентацию интересующей области в образцах, обрежьте гели в асимметричную форму или оставьте характерный вырез в геле для легкого распознавания правильной ориентации.
    14. Поместите покровные стекла с обрезанными гелями внутрь новой 24-луночной пластины так, чтобы гель был обращен вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гелеобразные образцы должны оставаться прикрепленными к их оригинальному стеклянному покровному стеколу.
  2. Ферментативное расщепление I-III и окрашивание ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация механических свойств образцов биопленки P. mirabilis следует за серией ферментативных расщеплений, которые авторы разделили на 3 этапа, основанные на биологической структуре, подлежащей деградации: гидролиз полисахаридов (Digestion I), пептидогликановый гидролиз (Digestion II) и гидролиз белка (Digestion III).
    1. Пищеварение I
      1. Погрузите образцы в 1 мл раствора для расщепления α-амилазы. Инкубировать O.N. при 50 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Большие объемы (т.е. 0,5-1 мл) ферментативного раствора используются для предотвращения высыхания образца из-за высокой температуры инкубации.
      2. Удалите раствор α-амилазы и промойте гели в течение 5 минут при комнатной температуре с 300 μл буфера для разложения целлюлазы.
      3. Удалите буфер для расщепления целлюлазы и замените его 500 μл раствора для разложения целлюлазы. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 45 °C.
      4. Удалите раствор для разложения целлюлазы и промойте гели в течение 5 минут при комнатной температуре с 300 μл буфера для разложения литиказы.
      5. Удалите буфер для разложения литиказы и замените его 500 μл раствора для разложения литиказы. Выдерживать в течение 2 ч при 30 °C.
    2. Пищеварение II
      1. Удалите раствор для разложения литиказы и промойте гели в течение 5 минут при комнатной температуре с 300 мкл буфера для разложения мутанолизина.
      2. Удалите буфер для расщепления мутанолизина и замените его 1 мл раствора для расщепления мутанолизина. Инкубировать O.N. при 55 °C.
    3. Дищемент III
      1. Удалите раствор для расщепления мутанолизина и промойте гели в течение 5 минут при комнатной температуре с 300 мкл буфера для расщепления протеиназы К. Удалите буфер для расщепления протеиназы К и замените его 500 мкл раствора для расщепления протеиназы К. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C.
    4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Окрашивание ДНК
      1. Удалите раствор протеиназы К и промойте гели 300 мкл 10x PBS в течение 5 минут при комнатной температуре.
      2. Удалите 10x PBS и замените его 300 μL красного флуоресцентного красителя 5 μM в 10x PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите раздел «Обсуждение» для комментариев о окрашивании ДНК для процедур ExM.
  3. Расширение
    1. Удалите раствор протеиназы К (или раствор для окрашивания ДНК, если был выполнен необязательный шаг 5.2.4) и перенесите гели в чашку Петри диаметром 60 мм. Поместите по одному гелю на чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте маленькую плоскую кисть, чтобы надавить гель на стеклянную покровную крышку. С помощью лабораторного пинцета возьмите стеклянный покровный листок и используйте его в качестве платформы для геля. Не допускайте падения геля с покровного стекла с помощью щетки при подъеме его из колодца пластины. Не допускайте, чтобы гели складывались сами по себе.
    2. Заполните чашку Петри избытком деионизированной воды, полностью погрузите гель и выдерживайте при слабом перемешивании при комнатной температуре в течение 20 минут. Меняйте воду 4-5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что расширяющийся гель становится практически невидимым при погружении в воду. Расположите чашку Петри напротив света, чтобы облегчить нахождение геля и не повредить его всасыванием из пипетки Пастера или микропипетки во время водообмена.

figure-protocol-2
Иллюстрация 2: Камера гелеобразования и монтаж образца. (A) Камера предварительного гелеобразования. На горке расположите 2 двусторонние прокладки из ленты (желтого цвета). Стеклянный покровный лист (figure-protocol-3 = 12 мм) находится поверх него в качестве ориентира расстояния. (Б) Камера гелеобразования. Бактериальная биопленка (зеленого цвета) образуется на нижней поверхности покровного стекла. Распорки толщиной 400 μм (оранжевые) изготовлены из двусторонних вырезов из ленты толщиной 100 μм. Прокладки позволяют гелю встроить весь образец и избежать перелива гелеобразующего раствора с краев камеры, предотвращая сдавливание образца между предметным стеклом и покровным стеклом. (C) Камеры для визуализации, напечатанные на 3D-принтере (перейдите по следующей ссылке, чтобы получить доступ к файлам .stl https://github.com/scianlab/ExM). Образец расширенного геля (слева) и образец расширенного геля, погруженный в деионизированную воду (справа). Расширенные гели становятся практически незаметными при погружении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Наблюдение и анализ

  1. Монтаж развернутых образцов
    1. Подготовьте камеры визуализации с полилизиновым покрытием для иммобилизации образца во время визуализации11: Замочите стеклянную поверхность камеры визуализации (см. Таблицу материалов) 0,1% (масс./об.) поли-L-лизина на 20 минут при комнатной температуре.
    2. Удалите раствор поли-L-лизина и выполните две промывки с избытком деионизированной воды. Дайте высохнуть на воздухе в течение 1 часа или поместите в инкубатор при температуре 37 °C, чтобы ускорить процесс сушки.
    3. После пятого цикла диализа, начиная с шага 5.3.2, удалите воду, покрывающую гели, и с помощью небольшой плоской щетки поместите образец на стеклянную покровную крышку размером 24 мм x 50 мм. Используйте прямоугольный покровный лист в качестве платформы для геля и снимите его с чашки Петри.
    4. Удалите лишнюю воду из геля с помощью папиросной бумаги, чтобы вода не блокировала прямой контакт между поверхностью геля и полилизиновым покрытием на стеклянной поверхности камеры для визуализации.
    5. Осторожно поместите гель на стеклянную поверхность камеры для визуализации, не допуская задержки пузырьков воздуха между гелем и стеклом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная поверхность камеры визуализации должна быть полностью сухой. Если были получены изображения до расширения, рассмотрите правильную ориентацию расширенного геля, чтобы облегчить поиск ранее захваченных полей зрения в предварительно расширенном образце.
    6. Добавляйте деионизированную воду до полного погружения геля (см. рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вспученные гели должны оставаться увлажненными в течение всего процесса визуализации, чтобы избежать усадки во время сканирования.
  2. Получение изображений
    1. Визуализируйте и захватывайте изображения образцов на доступном флуоресцентном микроскопе с ограничением дифракции.
      Примечание: Авторы использовали конфокальный микроскоп с вращающимся диском с 63-кратным объективом для погружения в воду с числовой апертурой 1,2 (NA). Для возбуждения флуорофорами использовалась линия твердотельного лазера на длинах волн 488 и 647 нм. Снимки производились с помощью 16-битной цифровой CMOS-камеры, управляемой фирменным программным обеспечением (см. Таблицу материалов). Размер вокселя был установлен на 64,4 мм x 64,4 мм x 200 нм (по осям XYZ ).
  3. Обработка изображений
    1. В дополнительном файле 2 приведена процедура цифровой обработки изображений для сегментации бактерий (раздел SF2.1), измерения ширины клеток (раздел SF2.2), определения EF (раздел SF2.3) и сопоставления изображений для предварительно развернутых и расширенных условий (раздел SF2.4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

PmbExM увеличил биопленку P. mirabilis в 4,3 раза и сохранил морфологию и топологию
Рисунок 3A-D свидетельствует о физическом увеличении биопленочных клеток P. mirabilis и повышенном разрешении, вызванном этим методом. Более того, это наблюдалось не только в тонких биопленочных областях, где клетки организуются в виде монослоев, но и в более толстых областях плотно заселенных 2- или д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важнейшие шаги PmbExM
Как и в случае с любым вариантом ExM, одним из наиболее важных этапов протокола является гомогенизация механических свойств образца. В случае PmbExM это достигается с помощью ряда ферментативных обработок. Недостаточное переваривание может привести к низким ФВ и потенциальному повреждению морфологии и/или топологии биопленки, что приводит к неоптимальному разрешению и ненадежным результатам. И наоборот, чрезмерно агрессивное пищеварение, особенно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии финансовых или личных конфликтов интересов, связанных с данной работой.

Благодарности

Авторы выражают свою благодарность доктору Хуану Эдуардо Родригесу и профессору доктору Ульриху Кубичеку (U-Bonn) за их вклад во внедрение методов расширения в SCIAN-Lab. Эта работа финансировалась проектами ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC GRANT RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) и Regional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α-Амилаза от Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070Расщепление полисахаридов
0,1% (масс./об.) водный раствор поли-L-лизина Sigma-AldrichP8920Иммобилизация образцов для визуализации
12 мм стеклянные покровные стеклаChemglass Life SciencesCLS-1760Компонент камеры гелеобразования
16-битный C13440-20CU камераHamamatsu PhotonicsНедоступноCMOS цифровая камера для получения изображений
24 мм x 50 мм стеклянные покровные стеклаChemglass Life SciencesCLS-1764Манипуляции/обработка образцов
Напечатанная на 3D-принтере камера для визуализацииСобственнаяразработка-Камерадля визуализации
вариант 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил (4-гидрокси-TEMPO)Sigma-Aldrich176141Гелеобразующий раствор
компонент 6-Лунка со стеклянным дном и черными стенкамиCelVisP06-1.5H-NВариант камеры визуализации
Уксусная кислота Sigma-Aldrich818755Ферментный буферный компонент
акриламидSigma-AldrichA4058Компонент раствора мономера
персульфат аммонияSigma-AldrichA3678Желирующий раствор компонент
Axiovert 200 микроскопZeissНет в наличииКонфокальный микроскоп
Хлорид кальцияSigma-AldrichC8106Ферментный буферный компонент
C-Apochromat 63x 1.2 NA водный иммерсионный объективZeissНедоступнообъектив микроскопа
Целлюлаза от Aspergillus nigerSigma-Aldrich 22178Расщепление полисахаридов
Chamlide CMB 35 мм тарельчатая магнитная камера для визуализацииLive Cell InstrumentНедоступноВариант камеры визуализации
ДиметилсульфоксидSigma-Aldrich472301MA-NHS якорный реагент стоковый раствор 
ДинатрийфосфатSigma-AldrichS3264Ферментный буферный компонент
ЭтанолSigma-AldrichE7023Очистка и стерилизация
Этилендиаминтетрауксусная кислотаMerck324503Ферментный буферный компонент
Falcon полистирол 24 луночных планшетаCorning351147Платформа общих процедур
FIJI SoftwareНациональный институт здравоохранения-Программное обеспечение для обработки изображений
ГлицеринSigma-AldrichG7893Ферментный буферный компонент
Гуанидина гидрохлоридThermo Scientific24115Ферментный буферный компонент
Huygens Программное обеспечениеScientific Volume Imaging-Deconvolutionпрограммное обеспечение для восстановления изображений
Соляная кислотаSupelco1.00317Буферный препарат
Kimwipes папиросная бумагаFisher Scientiffic06-666Удаление лишней воды
Лабораторный пинцетЭлектронная микроскопия НаукиM5EОбщие манипуляции/обработка образцов
Люрия Бертани БульонInvitrogen12795-027Биопленочная среда для выращивания
Литиказа из Arthrobacter luteusСигма-Олдрич L4025Расщепление полисахаридов
Хлорид магнияSigma-AldrichD5652Ферментный буферный компонент
Метакриловая кислота N-гидроксисукцинимидиловый эфирSigma-Aldrich730300Якорный реагент
МетанолSigma-Aldrich32213Дегидратация и хранение образца
MicrobeJ --Плагин программного обеспечения для обработки изображений
Предметные стекла для микроскопииChemglass Life SciencesCG-8221Компонент камеры гелеобразования
МононатрийфосфатSigma-AldrichS9638Ферментный буферный компонент
мутанолизин из Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990Пептидогликановое разложение
N, N, N', N'-тетраметилэтилендиаминSigma-AldrichT7024Желирующий раствор
компонент N,N′-метиленбисакриламидSigma-AldrichM1533Компонент раствора мономера
Nunc 40,4 мм стеклянное дно чашки ПетриThermo Fisher12-567-400Опция камеры визуализации
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127Фиксация образца
Фосфатный буферный физиологический растворSigma-Aldrich79383Компонент раствора мономера, промывка, Ферментный буфер
Протеиназа К из Engyodontium albumInvitrogen25530-031Переваривание белка
Proteus mirabilis ATCC 12453Микробиопрепараты0440PПредмет исследования
Маленькая плоская кисть для рисованияМестный хозяйственныймагазин-Манипуляция/обращение с образцами
Ацетат натрияSigma-Aldrich241245Ферментный буферный компонент
Акрилат натрияSigma-Aldrich408220Компонент мономерного раствора
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761Ферментный буферный компонент
ХлориднатрияSigma-AldrichS9888Компонент раствора мономера, Ферментный буферный компонент
Гидроксиднатрия Sigma-Aldrich221465Очистка стекол
Твердотельная лазерная линияOmicronНетв наличии 488, 568 и 647 нм Возбуждающая лазерная линия
SYTO 61 окрашивание нуклеиновых кислотInvitrogenS11343Флуоресцентный краситель
Tris(гидроксиметил)аминометан гидрохлоридSAFC108219Ферментный буферный компонент
Triton X-100Sigma-AldrichX100Пробная пермеабилизация, Ферментный буферный компонент
Volocity 7.0.0 Программное обеспечение для захватаQuorumTechnologies-Microscoy Программное обеспечение контроллера сбора данных
Volocity ViewVox Система вращающихся дисковPerkin-ElmerНедоступноСистема вращающихся дисков для конфокальных микроскоп
Агглютинин зародышей пшеницы – Alexa Fluor 488 флуоресцентный лектин конъюгатInvitrogenW11261Флуоресцентный краситель

Ссылки

  1. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
  2. Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
  3. Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  6. Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
  9. Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
  10. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  11. Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
  12. Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
  13. Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
  14. Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
  15. Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
  16. Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
  17. Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
  18. Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
  19. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

K
Визуализация биопленки Proteus mirabilis со сверхвысоким разрешением с помощью экспансионной микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.