Методическая статья

Изучение индуцированной наночастицами меди запрограммированной гибели клеток у бактерий

DOI:

10.3791/67951

⸱

16 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Biotechnology, College of Medicine, Tzu Chi University, 2Graduate Institute of Microbiology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Department of Biological Sciences, Missouri University of Science and Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наночастицы меди действуют как противомикробные агенты, генерируя активные формы кислорода. Здесь представлены процедуры, демонстрирующие, что наночастицы меди эффективны против трех клинически значимых патогенов и что определенные запрограммированные пути гибели клеток участвуют в этом бактерицидном процессе.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последнее время возросла обеспокоенность по поводу патогенов с множественной лекарственной устойчивостью и неизлечимых инфекций из-за чрезмерного и неправильного использования антибиотиков. Наноматериалы, такие как наночастицы металлов и оксидов металлов, завоевали популярность в биомедицинской области как потенциальные новые стратегии борьбы с патогенами с множественной лекарственной устойчивостью. В этом исследовании изучалось использование наночастиц меди (CuNPs) в качестве бактерицида против трех распространенных внутрибольничных оппортунистических патогенов - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) и Staphylococcus aureus (S. aureus), у которых все чаще развивается лекарственная устойчивость. Представлены подробные протоколы синтеза CuNP двух размеров (20 нм и 60 нм) и оценки их бактерицидной эффективности с помощью колонийных анализов. Механизмы антимикробного действия, лежащего в основе CuNP, были изучены путем оценки изменений в продукции активных форм кислорода. Кроме того, четыре модулятора, которые ингибируют функции белка человека, были применены для изучения потенциального участия путей программируемой клеточной смерти (PCD) в уничтожении бактерий. С помощью этого подхода предполагается потенциальное появление устойчивых к медью штаммов, основанных на исследованиях белков гомеостаза меди, включая медь-зависимые транскрипционные регуляторы. Эти результаты обеспечивают всестороннюю методологию для изучения бактерицидных эффектов CuNP и их потенциальной роли в борьбе с устойчивостью к антибиотикам.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лекарственно-устойчивые бактерии являются серьезной причиной беспокойства в медицине. Их быстрое появление снизило эффективность обычных антибиотиков, что привело к большему количеству клинических осложнений. Они представляют серьезную угрозу для здоровья населения и создают острую потребность в новых противомикробных препаратах. Одним из направлений исследований являются наноматериалы. Наноматериалы обладают уникальными физико-химическими свойствами, которые позволяют им взаимодействовать с микробами таким образом, что это ставит под угрозу их жизнеспособность. Например, наночастицы серебра (AgNPs) вызывают окислительный стресс у бактерий, что приводит к дисфункции белка, разрушению мембран, повреждению ДНК и, в конечном итоге, к гибели клеток. Наночастицы золота (AuNPs), с другой стороны, известны своими противогрибковыми свойствами и могут усиливать бактерицидное действие антибиотиков, выступая в качестве носителей2.

Кроме того, наночастицы меди (CuNP) также привлекли значительное внимание благодаря своему мощному антимикробному эффекту и низкой стоимости производства. Исследования показывают, что CuNP проявляют бактерицидную активность широкого спектра действия за счет нарушения ферментативной активности и образования активных форм кислорода (АФК)3. Положительный заряд CuNP облегчает их проникновение в бактерии, усиливая их клеточное поглощение4. Этот механизм делает CuNP перспективным вариантом для поверхностного покрытия, например, имплантатов, для предотвращения инфекций3. Однако одним из интересных открытий является то, что бактерицидный эффект CuNPs, по-видимому, зависит от размера. Некоторые исследования показали, что меньшие по размеру CuNP проявляют более высокую антибактериальную активность, вероятно, из-за ихпревосходного отношения площади поверхности к объему5.

Образование АФК вызывает обширное повреждение клеток и бактерий, включая перекисное окисление липидов, дисфункцию белков, фрагментацию ДНК и ингибирование глюконеогенеза/гликогенолиза, а также участвует в некрозе или запрограммированной гибели клеток (ПЦД)6,7,8. Недавние исследования показали, что системы PCD существуют у бактерий с режимами действия и эффекторами, аналогичными таковым в эукариотических системах9. Бактериальные сообщества могут индуцировать ПЦД в ответ на стресс, включая окислительный стресс, через систему токсин-антитоксин (ТА)10. Проще говоря, токсин-антитоксинная система состоит из токсинов, которые могут нарушать основные клеточные процессы, и антитоксинов, которые могут образовывать стабильные комплексы с токсинами для ингибирования их токсичности в нормальных условиях роста. Большинство бактерий и архей содержат локусы ТА в своих геномах, часто присутствующие в множественных копиях внехромосомной и хромосомной ДНК. Существует несколько типов систем TA, из которых особый интерес представляет тип II TA (известный как модуль MazE/MazF). В условиях стресса антитоксины разрушаются, что позволяет токсинам подавлять свои клеточные мишени. В E. coli и S. aureus токсин MazF активируется в ответ на стрессовые условия, такие как окислительный стресс, высокая температура и аминокислотное голодание. Следовательно, экспрессия антитоксина MazE снижается, высвобождая токсин MazF10. Исследования показали, что MazF позволяет синтезировать белки, которые позволяют небольшой субпопуляции выживать в неблагоприятных условиях, в то время как большая часть популяции подвергается опосредованной mazEF клеточной смерти. Эта гибель клеток может быть либо АФК-зависимой, когда АФК индуцирует транскрипционное или трансляционное ингибирование, либо АФК-независимой, когда повреждение ДНК запускает пути смерти11.

В этом исследовании изучаются механизмы, с помощью которых CuNP вызывают гибель бактерий. Вместо того, чтобы сосредоточиться исключительно на системе ТА, четыре модулятора PCD, ранее использовавшиеся в нашем исследовании 7,12, были использованы для изучения потенциальных путей PCD у бактерий.

Изучая бактерицидные эффекты CuNP двух разных размеров (20 и 60 нм) в различных концентрациях и используя такие методы, как анализ колоний, обнаружение АФК и модуляторы PCD (SBI, Z-VAD, NSA и Wortmannin), это исследование подчеркивает, что PCD не является исключительным для многоклеточных организмов, но также встречается в бактериальных сообществах в условиях стресса. Предоставляя подробные протоколы, эта работа направлена на то, чтобы позволить исследователям оценить эффективность CuNP и бактерицидные механизмы в их собственных системах. Кроме того, эти результаты углубляют понимание бактериальной ПЦД и поддерживают разработку методов лечения на основе CuNP для борьбы с устойчивыми к антибиотикам бактериями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Получение наночастиц меди

  1. Получение коммерческих нанопорошков меди (25 нм и 60-80 нм) из коммерческого источника.
  2. Используйте 1,0 мМ додецилсульфата натрия (SDS) в качестве диспергатора для двух размеров наночастиц 1 мг/мл.
  3. Диспергируйте наночастицы с помощью ультразвуковой ванны в течение не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем полностью диспергированные наночастицы готовы к использованию в последующих экспериментах.

2. Подготовка бактерий

  1. Получить штамм E. coli (Migula) Castellani and Chalmers 25922 и штамм A. baumannii Bouvet and Grimont из американской коллекции типовых культур. Получите S. aureus в Центре сбора и исследования биоресурсов.
  2. Культивируйте бактерии в бульоне Лурия-Бертани (LB) в аэробных условиях при 37 °C.
  3. Разбавьте бактериальные культуры в среде LB до оптической плотности при длине волны 600 нм (наружный диаметр600) примерно 0,5.

3. Оценка жизнеспособности клеток

  1. Колонийный анализ
    1. Используйте исходные растворы CuNP (1 мг/мл) для приготовления различных концентраций двух размеров CuNPs, включая 0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл.
    2. Приготовленные на шаге 2.3 бактериальные культуры разделить на микроцентрифужные пробирки и центрифугировать при температуре 3300 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Сохраните бактериальные гранулы и добавьте различные концентрации двух размеров CuNPs, соответственно, с помощью щадящего пипетирования.
    4. Обрабатывайте бактериальные гранулы PBS и 70% спиртом в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно.
    5. Инкубируйте все обработанные бактерии при встряхивании при 200 об/мин при 37 °C в течение 24 часов.
    6. После инкубации промойте все обработанные бактерии PBS и распределите их на пластинах из агара LB. Поместите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C на 24 часа.
    7. Подсчитайте численность колонии в каждой группе лечения на следующий день и проведите статистический анализ. Для статистической точности рекомендуется проводить это в трех экземплярах.
  2. Исследование бактерицидного механизма
    1. Подготовьте бактерии, как описано в шаге 3.1.2, и обработайте их либо 5 мкМ SBI-0206965 (SBI) в течение 2 ч, 0,5 мкМ некросульфанида (NSA) в течение 1 ч, 100 нМ вортманнина (Wort) в течение 30 мин или 100 нМ Z-VAD-FMK (Z-VAD) в течение 30 мин.
    2. Совместно обрабатывают бактерии различными концентрациями растворов CuNP двух размеров, как описано на шаге 3.1.1, в присутствии или отсутствии 5 мкМ SBI, 0,5 мкМ NSA, 100 нМ Wort и 100 нМ Z-VAD.
    3. Центрифугируйте бактерии после процедур модуляторами (шаг 3.2.1) и удалите надосадочную жидкость.
    4. Суспендировать бактериальные гранулы в растворах, приготовленных на шаге 3.2.2, и инкубировать их с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C в течение 24 ч.
    5. Обрабатывайте бактерии 70% этанолом и PBS в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Используйте раствор без CuNPs в качестве пустого контроля CuNP (0 мкг/мл; имитация) при одинаковых условиях ингибитора для каждой группы. Инкубируйте все образцы еще 24 часа.
    6. После инкубации добавьте в культуры реагент для жизнеспособности клеток в соотношении объема 1:10. Инкубировать культуры еще 2 ч при встряхивании при 37 °С.
    7. Центрифугируйте культуры (шаг 3.1.2) после 2-часовой инкубации. Перенесите флуоресцентные надосадочные жидкости на 96-луночные планшеты. Измерьте флуоресценцию с использованием длины волны возбуждения 560 нм и длины волны излучения 590 нм с помощью считывателя микропланшетов.
    8. Оставшуюся надосадочную жидкость развести до 10-5 и 10-4 и распределить на агаровые пластины LB для культивирования.
    9. Посчитайте одиночные колонии на следующий день.

4. Обнаружение активных форм кислорода

  1. Подготовьте бактериальные культуры, как описано в шаге 2.3, и разделите их на микроцентрифужные пробирки.
  2. Относитесь к бактериям с различными стрессовыми состояниями как к контрольным группам, индуцирующим АФК (данные не показаны в результатах). Методы лечения описаны в шагах 4.2.1-4.2.4.
    1. Подвергайте бактерии воздействию ультрафиолетового излучения с длиной волны 405 нм в течение 3 часов. Инкубировать бактерии при 45 °C в течение 2 ч.
    2. Далее инкубируйте бактерии при температуре 4 °C в течение 2 ч.
    3. Обрабатывайте бактерии 3%H2O2 в течение 30 минут.
    4. Поддерживайте бактерии при температуре 37 °C в бульоне LB в качестве отрицательного контроля.
  3. Приготовьте различные концентрации CuNPs, как описано на шаге 3.1.1, и обработайте бактерии 20 нм или 60 нм CuNP в концентрациях 1 г/мл, 5 г/мл, 10 г/мл и 100 мкг/мл в течение 24 ч.
  4. Дважды промойте инкубированные бактерии PBS, чтобы удалить оставшиеся наночастицы.
  5. Получить краситель 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (H2DCFDA) в PBS при конечной концентрации 5 мкМ.
  6. Ресуспендируйте бактериальные гранулы в 5 мкМ H2DCFDA и измерьте интенсивность флуоресценции при излучении 520/30 нм с помощью проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность флуоресценции зеленого FL1 коррелирует с уровнем АФК в обработанной культуре. Для статистической точности рекомендуется выполнять это в трех экземплярах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Антимикробная активность двухразмерных CuNP у трех патогенов
Три условно-патогенных микроорганизма (E. coli, S. aureus и A. baumannii) были использованы для проверки бактерицидной активности CuNPs. Бактерии обрабатывали 0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл 20 нм или 60 нм CuNPs, а бактерицидную активность определяли с использованием минимальной бактерицидной концентрации (MBC), полученной из количества колоний. Наши результаты показали положительны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании изучались антимикробные эффекты и механизмы применения CuNP в двух размерах и различных концентрациях против E. coli, S. aureus и A. baumannii. Используя установленные протоколы, было отмечено, что бактерицидные эффекты, вызванные CuNP, включают окислительный стресс и потенциальную активацию PCD. Тем не менее, взаимодействие между гомеостазом металлов и бактериальными реакциями на стресс остается в значительной степени неизученным. В предыду...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов, финансового или иного.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за поддержку со стороны Центра основных средств Университета Цзу Чи, Тайвань.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Acinetobacter baumannii штамм Буве и Гримонта American Type Culture Collection (ATCC), Манассас, Вирджиния, США17978Бактерии для эксперимента по токсосити CuNP
Bio-Rad iMark Microplate ReaderBio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США168-1130Используется для измерения абсорбции в анализах жизнеспособности бактерий.
проникающий в клетки 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетат  (H2DCFDA)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАD6883Используется для обнаружения активных форм кислорода (АФК) в обработанных бактериальных клетках.
Наночастицы меди (CuNPs) 25 нмSigma-Aldrich, Сент>Луис, Миссури, США774081Используются для приготовления стокового раствора CuNP
Наночастицы меди (CuNPs) 60-80 нмSigma-Aldrich, СентЛуис, Миссури, США 774103Используются для приготовления стокового раствора CuNP
(Migula) Castellani and ChalmersAmerican Type Culture Collection (ATCC), Манассас, Вирджиния, США25922Бактерии для эксперимента с токсосити
CuNP Проточный цитометр GalliosBeckman Coulter, Brea, CA, СШАИспользуется для проточного цитометрического анализа в нескольких экспериментах, включая обнаружение активных форм кислорода.
LB агарFocusBio, Мяоли, ТайваньLBA500Используется для культивирования бактерий
Бульон Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, США244620Используется для культивирования бактерий
Некросульфонамид (NSA)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США480073Используется в качестве модулятора для предварительной обработки в исследованиях пути гибели бактерий.
Реагент жизнеспособности клеток PrestoBlueInvitrogen, Карлсбад, Калифорния, СШАP50200Используется для оценки жизнеспособности клеток с помощью флуоресценции.
SBI-0206965 (SBI)BioVision, Милпитас, Калифорния, США9580Используется в качестве модулятора для предварительной обработки в исследованиях пути гибели бактерий.
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАL4509Используется в качестве диспергатора для наночастиц меди для снижения агрегации.
Staphylococcus aureusAmerican Type Culture Collection (ATCC), Манассас, Вирджиния, США
Центр сбора и исследования биоресурсов (BCRC), Синьчжу, Тайвань		13567Бактерии для эксперимента с токсоситией CuNP
Многорежимный микропланшетный ридер Varioskan LUXThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАVLBLATGD2Используется для измерения флуоресценции в анализах жизнеспособности клеток
Wortmannin (Wort)Abcam, MA, СШАab120148Используется в качестве модулятора для предварительной обработки в исследованиях пути гибели бактерий.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАV116Используется в качестве модулятора для предварительной обработки в исследованиях путей гибели бактерий.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anees Ahmad, S., et al. Bactericidal activity of silver nanoparticles: A mechanistic review. Mater Sci Energy Technol. 3, 756-769 (2020).
  2. Zhang, Y., Shareena Dasari, T. P., Deng, H., Yu, H. Antimicrobial activity of gold nanoparticles and ionic gold. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 33 (3), 286-327 (2015).
  3. Solioz, M. Copper and Bacteria: Evolution, Homeostasis and ToxicitySpringerBriefs in Molecular Science. Ch 2, Springer Cham. 11-19 (2018).
  4. Ma, X., Zhou, S., Xu, X., Du, Q. Copper-containing nanoparticles: Mechanism of antimicrobial effect and application in dentistry-a narrative review. Front Surg. 9, 905892(2022).
  5. Draviana, H. T., et al. Size and charge effects of metal nanoclusters on antibacterial mechanisms. J Nanobiotechnology. 21 (1), 428(2023).
  6. Hasanuzzaman, M., et al. Regulation of ROS metabolism in plants under environmental stress: A review of recent experimental evidence. Int J Mol Sci. 21 (22), ijms21228695(2020).
  7. Lai, M. J., et al. Effect of size and concentration of copper nanoparticles on the antimicrobial activity in Escherichia coli through multiple mechanisms. Nanomaterials (Basel). 12 (21), 12213715(2022).
  8. Sai, D. L., Lee, J., Nguyen, D. L., Kim, Y. P. Tailoring photosensitive ROS for advanced photodynamic therapy. Exp Mol Med. 53 (4), 495-504 (2021).
  9. Peeters, S. H., de Jonge, M. I. For the greater good: Programmed cell death in bacterial communities. Microbiol Res. 207, 161-169 (2018).
  10. Allocati, N., Masulli, M., Di Ilio, C., De Laurenzi, V. Die for the community: An overview of programmed cell death in bacteria. Cell Death Dis. 6 (1), e1609(2015).
  11. Kolodkin-Gal, I., Sat, B., Keshet, A., Engelberg-Kulka, H. The communication factor EDF and the toxin-antitoxin module mazEF determine the mode of action of antibiotics. PLoS Biol. 6 (12), e319(2008).
  12. Lai, M. J., Huang, Y. W., Wijaya, J., Liu, B. R. Copper Overview. Fernández, G. D. Ch 4, IntechOpen. (2024).
  13. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  14. Ramos-Zúñiga, J., Bruna, N., Pérez-Donoso, J. M. Toxicity mechanisms of copper nanoparticles and copper surfaces on bacterial cells and viruses. Int J Mol Sci. 24 (13), ijms241310503(2023).
  15. Ihara, M., Shichijo, K., Takeshita, S., Kudo, T. Wortmannin, a specific inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase, induces accumulation of DNA double-strand breaks. J Radiat Res. 61 (2), 171-176 (2020).
  16. Yang, Y. P., et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta Pharmacol Sin. 34 (5), 625-635 (2013).
  17. Li, X., et al. The caspase inhibitor Z-VAD-FMK alleviates endotoxic shock via inducing macrophages necroptosis and promoting MDSCs-mediated inhibition of macrophages activation. Front Immunol. 10, 1824(2019).
  18. Solioz, M. Copper and Bacteria: Evolution, Homeostasis and ToxicitySpringerBriefs in Molecular Science. Chapter 3, Springer. Cham. 21-48 (2018).
  19. Greene, N. P., Koronakis, V. Bacterial metal resistance: Coping with copper without cooperativity. mBio. 12 (3), e0065321(2021).
  20. Butsyk, A., et al. Copper nanoparticle loaded electrospun patches for infected wound treatment: from development to in-vivo application. Polymers (Basel). 16 (19), polym16192733(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coliStaphylococcus aureusAcinetobacter baumannii

Похожие статьи