Методическая статья

Быстрая изоляция внеклеточных везикул, полученных из грудного молока человека

805 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67954

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол разработан для ускорения и обеспечения эффективной изоляции внеклеточных везикул из грудного молока человека с высокой чистотой.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (ВВ), наноразмерные частицы размером примерно 20-1000 нм, быстро привлекают внимание благодаря своему терапевтическому потенциалу. В частности, было показано, что внеклеточные везикулы, полученные из грудного молока человека (HBMDEV), обеспечивают защиту в экспериментальных моделях некротизирующего энтероколита, кишечного заболевания, которое в первую очередь поражает недоношенных детей, что приводит к смертности до 50%. Тем не менее, традиционные методы выделения внеклеточных везикул, такие как дифференциальное ультрацентрифугирование, эксклюзионная хроматография и т. д., либо требуют много времени, либо требуют специализированных инструментов, ни один из которых не является практичным в клинических условиях. Следовательно, существует потребность в простом методе изоляции, который позволит быстро реактивно вводить HBMDEV пациентам. Здесь предлагается комбинация центрифугирования грудного молока человека для удаления жира и клеточного мусора в сочетании с быстрой ультрафильтрацией оставшегося обезжиренного молока, что дает высокий выход и функциональные внеклеточные везикулы. Использование этой методики может позволить использовать HBMDEV в качестве практического терапевтического варианта в клинических условиях.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой вездесущие наночастицы размером примерно 20-1000 нм, происходящие либо через эндосомальные пути (когда микровезикулярные тельца сливаются с плазматической мембраной, что способствует высвобождению клеточного груза во внеклеточное пространство), либо через пути плазматической мембраны (т.е. почкование). ВВ содержат клеточный груз хозяина, такой как липиды, белки, нуклеиновые кислоты, различные метаболиты и другое содержимое в зависимости от их источника. Кроме того, ВВ играют важную роль в межклеточной коммуникации, ангиогенезе, подавлении иммунитета, ремоделировании микроокружения опухоли, прогрессировании рака и т.д.1,2,3,4. Примечательно, что грудное молоко (HBM) богато электромобилями и легко доступно кормящим матерям5. В последнее время ВВ, полученные из грудного молока человека (HBMDEV), привлекают внимание в качестве терапевтических векторов для лечения болезней 1,2. Недоношенные новорожденные или новорожденные с низкой массой тела при рождении восприимчивы к нескольким инфекциям, включая некротизирующий энтероколит. Некротизирующий энтероколит, характеризующийся некрозом подвздошной или толстой кишки, варьируется от легкого воспаления кишечника до полисистемной органной недостаточности с коэффициентом младенческой смертности до 50%6. Предварительная обработка ВВ, полученных из грудного молока, достаточна для защиты от воспаления кишечника в экспериментальных моделях НЭК in vitro и in vivo 2,7. Следовательно, использование HBMDEV может быть жизнеспособным вариантом для лечения НЭК в клинических условиях.

Несмотря на терапевтические перспективы HBMDEV, существуют известные ограничения использования современных методов изоляции, заключающиеся в том, что они либо требуют много времени, либо специализированного оборудования, ни одно из которых не является универсально практичным для клинических условий. «Золотой стандарт» изоляции электромобилей включает в себя несколько раундов дифференциального ультрацентрифугирования, которое, хотя и дает удовлетворительный выход электромобилей, может повлиять на их структурную целостностьи функциональность. Кроме того, время ультрацентрифугирования может составлять не менее 2 часов, что является дорогостоящим ресурсом в клинических условиях9. Изоляционные комплекты доказали свою эффективность как экономию времени, так и некоторую экономическую эффективность. Однако изоляция с помощью таких методов также приводит к низкой урожайности и, следовательно, к низкой масштабируемости. Следовательно, существует потребность в методах изоляции HBMDEV, которые экономят время и являются экономически эффективными без ущерба для производительности электромобиля.

Этот протокол направлен на то, чтобы описать пошаговый метод быстрой изоляции электромобилей от HBM с использованием существующих клинически доступных инструментов, одобренных FDA. Для достижения этой цели было использовано стандартное центрифугирование и система расширения фильтра клинического класса, чтобы изолировать электромобили от HBM. Эти везикулы находятся в пределах ожидаемого диапазона размеров, морфология дисплея соответствует известным EV, обогащены маркерами EV и функционально аналогичны EV, выделенным с помощью традиционных методов изоляции ультрацентрифугированием. Таким образом, данный протокол изоляции электромобилей HBM может обеспечить практическую, быструю изоляцию и применение электромобилей, выделенных из HBM, в клинических условиях.

Протокол

Грудное молоко было собрано в региональном отделении интенсивной терапии Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB). Отобранные образцы были собраны после того, как грудное молоко было разморожено для использования пациентом, и пациентка не могла принимать все кормление. Эти корма обычно выбрасываются, но были собраны в исследовательских целях. Образцы были собраны у обезличенных особей и хранились при температуре −80 °C до начала экспериментов. Сборник утвержден протокольным N160203002 года Совета по внутреннему контролю ЗАО. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Выделение внеклеточных везикул (дифференциальное ультрацентрифугирование)

  1. В шкафу биобезопасности разбавьте грудное молоко в соотношении 1:10 в стерильном PBS в конической пробирке объемом 15 мл.
  2. Центрифугируйте грудное молоко при 300 х г в течение 10 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования должно быть 3 отдельных слоя: молочный жир (верхний слой), сыворотка или обезжиренное молоко (средний водный слой), а также клетки и другой мусор (гранулированный внизу). В шкафу биобезопасности отфильтруйте молочный жир и слои сыворотки через фильтр толщиной 70 мкм (для более легкого удаления жира), не беспокоя гранулы. Переведите поток в новую трубу.
  3. Центрифугируйте образец при температуре 2600 x g в течение 10 минут при 4 °C. На этом этапе удаляются остатки молочного жира, клетки и мусор. В шкафу биобезопасности отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 70 мкм. Перенесите надосадочную жидкость в ультрацентрифужную пробирку. Перед ультрацентрифугированием убедитесь, что в пробирке не менее 10 мл жидкости.
  4. Ультрацентрифугирование образца при температуре 20 000 x g в течение 45 мин при 4 °C. После ультрацентрифугирования могут быть три слоя, аналогичные шагу 1.2: молочный жир, сыворотка или обезжиренное молоко, а также клетки и другой мусор. В шкафу биобезопасности отфильтруйте молочный жир и слои сыворотки через фильтр 70 мкм, не повреждая гранулы. Перенесите надосадочную жидкость в коническую трубку объемом 15 мл.
  5. В шкафу биобезопасности шприц отфильтрует грудное молоко с помощью фильтра 0,22 мкм. Перенесите надосадочную жидкость в новую ультрацентрифужную пробирку. Перед ультрацентрифугированием убедитесь, что в пробирке не менее 10 мл жидкости.
  6. Ультрацентрифугирование образца при 110 000 x g в течение 70 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл стерильного PBS.
  7. Повторно ультрацентрифугируйте образец при 110,00 x g в течение 70 мин при 4 °C.
  8. В шкафу биобезопасности повторно суспендируйте гранулу в 150-200 мкл стерильного PBS.

2. Выделение внеклеточных везикул (метод быстрой фильтрации)

  1. В шкафу биобезопасности разбавьте грудное молоко (1:10) в стерильном PBS.
  2. Центрифугируйте грудное молоко при 300 х г в течение 10 минут при 4°C. После центрифугирования должны быть три отдельных слоя: молочный жир (верхний слой), сыворотка или обезжиренное молоко (средний водный слой), а также клетки и другой мусор (гранулированный в нижней части). В шкафу биобезопасности отфильтруйте молочный жир и слои сыворотки через фильтр толщиной 70 мкм (для более легкого удаления жира), не беспокоя гранулы. Переведите поток в новую трубу.
  3. Центрифугируйте образец при температуре 2600 x g в течение 10 минут при 4°C. На этом этапе удаляются остатки молочного жира, клетки и мусор. В шкафу биобезопасности фильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 70 мкм. Перенесите надосадочную жидкость в трубку объемом 15 мл.
  4. В шкафу биобезопасности заправьте 16-дюймовый удлинитель фильтра 0,22 мкм 5,4 мл PBS.
    1. В основную систему наберите 5,4 мл стерильного PBS в шприц и промойте систему до тех пор, пока PBS не закончится с другого конца трубки.
  5. Шприц отфильтрует грудное молоко через 16-дюймовый удлинитель фильтра размером 0,22 мкм. На этом этапе удаляются остатки молочного жира, клетки и мусор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества мусора, присутствующего в образце, может потребоваться более одного комплекта удлинителей фильтра.
  6. Соберите проточный поток в коническую пробирку объемом 15 мл.

3. Анализ трекинга Nanosight

  1. Разведите образец (1:1000) в стерильном PBS. Быстро отфильтрованные образцы можно использовать в неразбавленном виде.
  2. Кратковременно сделайте образец вихрем. Загрузите 1 мл образца в туберкулиновый шприц.
  3. Присоедините шприц к инъекционному аппарату и закрепите шприц.
  4. Установите ТНВД на 50. Включите камеру, чтобы убедиться, что видимых частиц не слишком много или слишком мало. Убедитесь, что поток частиц постоянен, без пропусков и резких скачков потока пробы.
  5. Установите ТНВД на 100. Запустите протокол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение было настроено на чтение один раз в минуту, всего 5 чтений.
  6. Прочтите образец.
  7. Промывайте Nanosight между образцами с помощью PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения размера и концентрации частиц на миллилитр использовалась система анализа отслеживания наночастиц. Средняя концентрация ультрацентрифугированного образца составила 3,30 е+08 +/- 4,08 е+06 частиц/мл, в то время как метод быстрой фильтрации составил 5,50е+08 +/- 1,16е+08 частиц/мл.

4. Негативное окрашивание внеклеточных везикул и просвечивающая электронная микроскопия

Примечание: Образцы с концентрацией экзосом в диапазоне 108 были использованы для проведения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

  1. Медные ЭМ-сетки с тлеющим разрядом/углеродно-пленочным покрытием в течение 25 с при 20 мА с использованием разрядного аппарата.
  2. Загрузите 7 μL раствора для суспензии EV на решетку и инкубируйте в течение 1 минуты.
  3. Пропитайте излишки фильтровальной бумагой ватмана, отводя из-под сетки, чтобы «притянуть» образец к сетке, а не от нее.
  4. Немедленно окрасьте образец 7 мкл отфильтрованного 1% раствора уранилацетата (UA) на поверхность ЭМ-решетки с помощью пипетки.
  5. Через 15 с излишки раствора UA удалялись из сетки путем контакта с краем сетки фильтровальной бумагой. Просмотр пробы немедленно (в течение 24 ч) на ТЭМ при напряжении 80 кВ.

5. Концентрация белка

  1. Ацетон выпадает в осадок 250 мкл очищенных электромобилей (1:4) в течение 1 ч при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 100 мкл очищенных экзосом для метода ультрацентрифугирования.
  2. Центрифугируйте образец при давлении 16 000 x g в течение 30 минут.
  3. Высушите гранулу на воздухе с последующей повторной суспензией в 100 μл буфера RIPA.
  4. Следуйте протоколу набора для анализа белка BCA для определения концентрации белка. Поглощение измеряли на длине волны 562 нм с помощью считывателя микропланшетов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мл грудного молока обычно дает примерно 1,3 мкг/мл белка при ультрацентрифугировании и примерно 0,2-1 мкг/мл белка при быстрой фильтрации.

6. Вестерн-блот

  1. Инкубируйте образец белка объемом 1 с маркером полосы 4 объема, уменьшите буфер для образца и кипятите его в течение 7 минут при температуре 90 °C.
  2. Загрузите и запустите 10 г белка на 10% гель SDS при 70 В в течение 15 минут. После этого увеличьте напряжение до 100 В и поработайте еще 90 минут.
  3. Перенесите гель на нитроцеллюлозную мембрану с помощью полусухого аппарата на 30 минут при напряжении 15 В.
  4. Промойте мембрану 3 раза TBS-0,1% Tween (TBS-T) в течение 10 минут каждый.
  5. Заблокируйте мембрану на 30 минут с помощью раствора Fast Blocking Buffer (разбавленного до 1 раза).
  6. Инкубируйте первичные антитела (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 и CD9-1:1000) в 1x Буферном растворе, на ночь при 4°C на коромысле 10,11,12.
  7. Промойте мембрану три раза по 10 минут каждый с помощью TBS-T.
  8. Добавьте (H+L) HRP-конъюгированное вторичное антитело против мышей в соотношении 1:1000 для всех исследованных белков (Hsp70, CD9 и CD63) в 2% молоко в TBS-T и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре на качалке.
  9. Промойте мембрану три раза по 10 минут каждый с помощью TBS-T.
  10. Проявка с использованием ECL (1:1) и пленки с проявителем.

7. Культивирование клеток ИЭК-6 in vitro

  1. Затравите 1,0 x 106 клеток в колбу Т-25 в 5 мл полной среды RPMI. Дайте клеткам прилипнуть на ночь.
  2. Удалите весь фильтрующий материал и промойте 1-2 мл PBS.
  3. Аспирируйте PBS и добавьте 5 мл полного RPMI без EV.
  4. Добавьте конечную концентрацию400мкМ Н2 О2 на лунку и 10 мкг/мл EV одновременно в ячейки на ночь.
  5. Удалите среду и промойте ячейки 1-2 мл PBS.
  6. Аспирируйте PBS и добавьте 1 мл трипсина.
    1. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37°C на 5 минут.
  7. Деактивируйте трипсин, добавив удвоенный объем полного RPMI. Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 125 x g в течение 5 минут.
  8. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл PBS.
  9. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек.

Результаты

Изоляция электромобилей с помощью ультрацентрифугирования и быстрой изоляции
С догматической точки зрения, выделение EV из HBM включает центрифугирование для удаления молочного жира и других крупных частиц с последующей фильтрацией, несколькими раундами ультрацентрифугирования и повторной суспендированием образца, обогащенного EV, в PBS. Метод быстрой фильтрации использует центрифугирование для удаления молочного жира и клеточного мусора с последующей фильтрацией с помощью фильтра-удлинителя 0,22 мкм с дальнейшим удалением остаточного мусора, в результате чего получается образец, обогащенный EV, сравнимый с традиционным ультрацентрифугированием (Рисунок 1).

Определение характеристик HBMDEV с помощью системы быстрой фильтрации с удлинителем фильтра
Анализ слежения с помощью наноприцела показал сопоставимый размер частиц между ультрацентрифугированными (рис. 2A) и изолированными быстрыми фильтрами HBMDEV (рис. 2B). Оба метода показывают, что изолированные электромобили имеют средний размер около 100 нм. ВВ переносят различный груз (т.е. белки, липиды, микроРНК и т.д.) для секреции от клеток-хозяев к их различным мишеням. Следовательно, первым исследуемым белком-мишенью был белок теплового шока 70 (Hsp70), белок, который, как известно, транспортируется через EVs13. Вестерн-блоттинг показывает, что EV, выделенные с помощью быстрой фильтрации, показали сопоставимую экспрессию Hsp70, что и выделенные с помощью ультрацентрифугирования (рисунок 3A и дополнительный рисунок 1A). Кроме того, ВВ могут быть идентифицированы по поверхностной экспрессии тетраспанинов, таких как CD9 и CD6314. Вестерн-блоттинг показал, что EV, выделенные с помощью быстрой фильтрации, действительно экспрессируют CD9 (рисунок 3B и дополнительный рисунок 2B) и CD63 (рисунок 3C и дополнительный рисунок 3C). Наконец, морфологический анализ HBMDEV с помощью просвечивающей электронной микроскопии выявил сходную морфологию везикул между двумя методами выделения (рис. 4A-D).

Несколько лабораторий показали, что ВВ обладают защитными свойствами, которые способствуют выживанию клеток во время клеточного стресса 2,3,7. Как и в ранее опубликованных отчетах, ВВ, выделенные с помощью метода быстрой фильтрации, способны защищать эпителиальные клетки кишечника (IEC-6) от гибели клеток, вызванной перекисью водорода2 (рис. 5A, B). Эти данные свидетельствуют о том, что выделенные методом быстрой фильтрации HBMDEV не только обладают сравнительными качествами с выделенными методом дифференциального ультрацентрифугирования, но и функционально сходны.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема, показывающая различия между методами ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации выделения ВВ из грудного молока человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ отслеживания Nanosight EV, выделенных из грудного молока человека с использованием ультрацентрифугирования и метода быстрой фильтрации. (A) NTA EV грудного молока человека (разбавленных в 1:1000 в 1x PBS), выделенных с помощью ультрацентрифугирования. Представленные данные представляют собой единое представление 3-4 независимых испытаний. (B) НТА EV грудного молока человека, выделенных с помощью быстрой фильтрации. Представленные данные представляют собой единое представление 3-4 независимых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Вестерн-блоттинг EV, выделенных с помощью ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации. (А) Односекундное воздействие 10 мкг белка теплового шока 70 (Hsp70). «L» обозначает лестницу, «U» — ультрацентрифугирование, а «R» — быструю фильтрацию. Образцы, полученные с помощью быстрой фильтрации, дополнительно концентрировали центрифугированием при 110 000 × г в течение 70 мин, выполненным дважды. Показанное изображение представляет собой одно из четырех независимых испытаний. (B) Двадцать второе воздействие 10 μг CD9. «L» обозначает лестницу, «U» — ультрацентрифугирование, а «R» — быструю фильтрацию. Образцы быстрой фильтрации концентрировали центрифугированием при 110 000 × г в течение 70 мин, выполненных дважды. Показанное изображение представляет собой одно из четырех независимых испытаний. (C) Двадцать второе воздействие 10 μг CD63. «L» обозначает лестницу, «U» — ультрацентрифугирование, а «R» — быструю фильтрацию. Образцы быстрой фильтрации концентрировали центрифугированием при 110 000 × г в течение 70 мин, выполненных дважды. Показанное изображение представляет собой одно из четырех независимых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Анализ ВВ с помощью просвечивающей электронной микроскопии, выделенных с помощью ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации. (A) Электронная микрофотография ВВ, выделенных с помощью ультрацентрифугирования при увеличении 8000×. Масштабная линейка = 800 нм. Показанное изображение представляет собой одно из трех независимых испытаний. (B) Электронная микрофотография EV, выделенных с помощью ультрацентрифугирования при увеличении 20 000×. Масштабная линейка = 200 нм. Показанное изображение представляет собой одно из трех независимых испытаний. (C) Электронная микрофотография электромобилей, выделенных с помощью быстрой фильтрации при увеличении 8 000×. Масштабная линейка = 800 нм. EV концентрировали центрифугированием при 110 000 × г в течение 70 минут, выполненным дважды. Показанное изображение представляет собой одно из трех независимых испытаний. (D) Электронная микрофотография электромобилей, выделенных с помощью быстрой фильтрации при увеличении 20 000×. Масштабная линейка = 200 нм. ВВ концентрировали центрифугированием при 110 000 × г в течение 70 мин, выполненным дважды. Показанное изображение представляет собой одно из трех независимых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Функциональный анализ электромобилей, выделенных с помощью ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации. (A) Клеточная жизнеспособность клеток IEC-6, культивируемых в полной среде RPMI-1640, не содержащей EV. Клетки обрабатывали в течение ночи 400 мкМ, H, 2,O2 и 10 мкг/мл EV одновременно. Представленные данные представляют собой одно из двух независимых испытаний. (B) Количество клеток IEC-6, культивируемых в полной среде RPMI-1640, не содержащей EV. Клетки обрабатывали в течение ночи 400 мкМ, H, 2,O2 и 10 мкг/мл EV одновременно. Представленные данные представляют собой одно из двух независимых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Вестерн-блоттинг Hsp70 в электромобилях, выделенных с помощью ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации. Односекундная экспозиция 10 мкг белка теплового шока 70 (Hsp70). «L» обозначает лестницу, «U» — ультрацентрифугирование, а «R» — быструю фильтрацию. Образцы быстрой фильтрации концентрировали центрифугированием при 110 000 × г в течение 70 мин, выполненных дважды. Каждый образец представляет собой одну биологическую реплику. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Вестерн-блоттинг CD9 в электромобилях, выделенных с помощью ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации. Пятиминутная экспозиция 10 мкг CD9. «L» обозначает лестницу, «U» — ультрацентрифугирование, а «R» — быструю фильтрацию. Образцы быстрой фильтрации концентрировали центрифугированием при давлении 110 000 × г в течение 70 минут, выполненных дважды. Каждый образец представляет собой одну биологическую реплику. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Вестерн-блоттинг CD63 в EV, выделенных с помощью ультрацентрифугирования и быстрой фильтрации. Десятиминутное воздействие 10 мкг CD63. «L» обозначает лестницу, «U» — ультрацентрифугирование, а «R» — быструю фильтрацию. Образцы быстрой фильтрации концентрировали центрифугированием при давлении 110 000 × г в течение 70 минут, выполненных дважды. Каждый образец представляет собой одну биологическую реплику. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Электромобили привлекают внимание, поскольку в литературе предполагается, что они могут регулировать различные воспалительные механизмы и обладают защитными свойствами 2,7. Тем не менее, ограничением практического использования ВВ в клинических условиях является время, необходимое для выделения ВВ и извлечения достаточного выхода 8,15. Здесь был изложен пошаговый протокол для быстрой и эффективной изоляции электромобилей от HBM с помощью одобренной FDA системы фильтрации. Полезность этого метода позволяет вдвое сократить традиционные методы изоляции электромобилей без ущерба для производительности. Таким образом, данный протокол может обеспечить практическое терапевтическое применение ВВ, полученных из грудного молока человека, в клинических условиях, если терапия ВВ будет одобрена в обозримом будущем.

Существующие протоколы изоляции электромобилей продемонстрировали стабильный и эффективный выход электромобилей из исходной жидкости. Тем не менее, традиционные средства изоляции, будь то золотой стандарт, дифференциальное ультрацентрифугирование или использование коммерческих наборов, не лишены своих ограничений. Выделение электромобилей с помощью дифференциального ультрацентрифугирования, хотя и эффективно, занимает много времени благодаря протоколам, включающим совокупное время вращения минимум ~3 часа 2,8,15. Время изоляции в сочетании с протоколами для правильной количественной оценки числа ВВ затруднит их использование в условиях ограниченного времени в клинических условиях. Более того, коммерческие наборы, хотя и эффективны, но стоят дорого. Кроме того, количество образцов, которые могут быть обработаны в одном комплекте, невелико, учитывая высокую стоимость этих наборов 8,15.

Этот протокол предлагает решение этих ограничений, которое экономит время и деньги без ущерба для производительности или чистоты электромобиля. Чтобы этот протокол был эффективным, необходимо выполнить несколько ключевых шагов при его выполнении. Разбавление и первоначальное центрифугирование грудного молока человека необходимы для удаления внеклеточного мусора и молочного жира из образца молока. Удаление этого мусора имеет решающее значение для предотвращения засорения системы удлинения фильтра и, таким образом, предотвращает необходимость использования нескольких фильтров для одного образца. Кроме того, промывка системы расширения фильтра PBS имеет решающее значение, так как она подготавливает фильтр при подготовке к отбору пробы. Грунтование помогает гарантировать, что образец не будет потерян в процессе грунтования. Следует отметить, что в зависимости от содержания образца грудного молока может потребоваться более одного комплекта удлинителей фильтра, независимо от разбавления и центрифугирования образца перед фильтрацией. В этом случае может быть использовано более одного фильтра; Тем не менее, новый набор расширений фильтра должен быть загрунтован перед фильтрацией образца.

Этот протокол эффективен и последовательно изолирует ВВ от грудного молока человека, однако необходимо учитывать несколько ограничений. Перед фильтрацией образца необходимо провести этапы центрифуги (общее время ~20 мин между обоими спинами). Попытки отфильтровать разбавленную пробу без центрифугирования приведут к повторному засорению системы расширения фильтра, потере пробы, а также добавят дополнительное время к протоколу изоляции EV. Более того, проба не была чистой, о чем свидетельствуют анализы НТА и ПЭМ. Попытки использовать образцы, которые не были центрифугированы перед фильтрацией, могут привести к попаданию нежелательных загрязнителей в образец, что может привести к нецелевым эффектам в зависимости от будущего применения изолированных электромобилей в будущем. Кроме того, этот протокол был реализован только в отношении выделения EV из грудного молока человека. Следовательно, эффективность этого протокола в изоляции ВВ от других жидкостей не исследовалась. Учитывая водную природу всех жидкостей организма, не ожидается, что возникнут какие-либо различия в чистоте и выходе EV, если этот протокол будет использоваться для изоляции EV от других источников.

Следует также отметить, что этот протокол эффективен при выделении малых внеклеточных везикул (sEV). По данным NTA, электромобили, полученные от HBM, имели размер ~100 нм, что говорит о том, что более крупных электромобилей в образце не было. Причина в том, что образцы были отфильтрованы с помощью фильтра 0,22 мкм, который в основном используется для выделения экзосом и других более мелких EV, что было основным направлением деятельности лаборатории во время этого исследования. Теоретически использование фильтра с большими размерами пор может позволить изолировать более крупные EV. Однако эти вопросы выходят за рамки настоящего исследования.

ВВ, полученные из грудного молока человека, представляют собой естественный терапевтический источник, который легко доступен для клинического использования. Одним из ограничений для внедрения работы с электромобилями в клинические условия является изоляция электромобилей практическим методом, который потенциально может быть использован любым учреждением. Этот протокол разработан для преодоления этого ограничения и может быть легко применен в условиях больницы и реализован с использованием существующей системы фильтрации больничного класса, одобренной FDA, коммерчески доступной или может быть приобретена по гораздо более низкой цене, чем стандартная ультрацентрифуга. Этот метод является экономически эффективным и позволяет получить богатый электромобилями и чистый образец из системы фильтрации, которая уже используется в клинических условиях.

Раскрытие информации

Автор (авторы) заявил об отсутствии потенциального конфликта интересов в отношении исследования, авторства и/или публикации данной статьи.

Благодарности

Изображения и рисунки были сгенерированы с помощью biorender.com. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано UAB High Resolution Imaging Facility. Эта работа была поддержана NIH/NICHD 5R21HD104481.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(H+L) HRP-сопряжённый антимышиный антимышиБио-Рад1721011
(H+L) HRP-конъюгатный анти-кроликБио-Рад1706515
Фильтр для шприца 0.20Фишербранд09-719C
Сито с 0,70 ммм-ячейкиКорнинг431751
1.5M Tris HCLИзготовлено внутри компании
Трубки объемом 15 млFalcon352096
Набор удлинителя фильтра диаметром 16 дюймовB-BRAUNFE2012F
1M Трис HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
Трубки объёмом 50 млFalcon353070
5-кратный редукционный буфер образцаThermo Scientific39000
АциламидFisher Scientifc BP1410-1
Амфотерицин BGibco15290-018
Камера AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
Анти-АнтиGibco15240-062
Anti-CD63НовусбиоNBP2-32830
Анти-CD9Инвитроген10626D
APSThermo Scientific17874
Набор для анализа белков BCAПирс23227
Трубы БекманаБекман Коултер 344059
BrightStar ECL ChemiluminescentAlkali ScientificXR92
FBS с истощением экзосомовFisher ScientificNC0464480
Быстрый блокирующий буферПирс37575
Сыворотка плода для быкаЖизненные технологии10082147
HSP70ИнвитрогенMA3-006
Человеческий инсулинСигма-ОлдричI9278-5ML
Перекись водородаFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL США Inc
Буфер с маркировкой полосы, уменьшающий буфер выборокThermo Scientific39000
Сухое молокоБиомир30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Мембрана нитроцеллюлозыЖизненные технологии88018
Аппарат разряда PELCO easiGlowТед Пелла
Мини-таблетки с ингибитором протеазыПирсA32955
Буфер RIPAПирс89901
RPMI 1640Fisher Scientifc 11875119
SDSFisher Scientifc BP2436-200
Фляга Т-25Thermo Scientific156367
TBSИзготовлено внутри компании
TEMEDБио-Рад161-0801
Трипсин ЭДТАГибсо25200-056
Tween 20Thermo ScientificJ20605-AP

Ссылки

  1. Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
  2. Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
  3. Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
  4. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
  5. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
  6. Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
  7. Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
  8. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  9. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  10. Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
  11. Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
  12. Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
  13. Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
  14. Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

Перепечатки и разрешения

Теги

Внеклеточные везикулы грудного молокаэкспресс-фильтрацияультрацентрифугированиеизоляция экзосомвестерн-блоттингпросвечивающая электронная микроскопияанализ NanoSightмаркер CD63
Быстрая изоляция внеклеточных везикул, полученных из грудного молока человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.