Методическая статья

Упрощённый, без маркировки анализ инфекционной дозы 50% тканевых культур (TCID50) в реальном времени с использованием импеданса для автоматизированного количественного определения вирусного титра

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67956

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Agilent Technologies, Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Приведённый здесь анализ TCID50 использует измерения импеданса в реальном времени без меток и модуль вирусологии системы для объективного мониторинга вирусно-индуцированных цитопатических эффектов (CPE) в реальном времени. Этот упрощённый анализ значительно сокращает время практического использования, поддерживая высокопроизводительные количественные кинетические CPE-измерения и позволяя автоматизированные расчеты TCID50 в реальном времени.

Аннотация

Измерение вирусного титра, то есть концентрации вируса в образце, является фундаментальной процедурой в исследованиях вирусологии. Хотя традиционные методы, такие как анализ налёта и анализ TCID50, необходимы для необходимости, они необходимы, требуют окрашивания или маркировки реагентов, а также часто включают субъективную интерпретацию, особенно когда цитопатические эффекты (CPE) тонко или трудно измеряются с помощью визуализации. Например, анализы TCID50 могут использовать красители жизнеспособности, такие как MTT или MTS, тогда как анализы бляшек используют визуализацию и окрашивание для визуализации вирусных бляшек, что может вводить изменчивость. Кроме того, эти традиционные методы лишь дают статический снимок вирусной инфекционности, ограничивая возможность фиксировать динамические взаимодействия между вирусами и разрешительным клетками. Для преодоления текущих ограничений в измерении вирусного титра был разработан упрощённый анализ TCID50 с использованием импедансной технологии для объективного, неинвазивного и в реальном времени измерения CPE, устранив необходимость в маркировке. В этом исследовании были использованы две модели клеток, пропустивших вирус, для валидации теста импеданс-TCID50: аденовирус с маркировкой GFP (Adv-GFP) в HEK293A клетках и вирус гриппа А (IAV) в клетках MDCK. Рабочий процесс прост и включает засев клеток, инокуляцию вирусов, мониторинг в реальном времени и автоматический анализ TCID50 с помощью программного обеспечения. Во время заражения значения TCID50 автоматически рассчитывались программным обеспечением системы с использованием формулы Рида-Мюнша во всех зафиксированных временных точках. Значения IAV TCID50, полученные с помощью показаний импеданса, были сопоставимы с теми, что получались при традиционном тесте TCID50 на основе кристаллического фиолетового окрашивания. Эти результаты демонстрируют, что квантифицированная оценка вирусов может быть точно и эффективна с помощью измерения импеданса в сочетании с вирусологическим модулем программного обеспечения системы. Новый анализ упрощает традиционные методы, одновременно предоставляя более глубокое понимание вирусной динамики, тем самым поддерживая передовые вирусологические исследования и расширяя потенциальные клинические применения.

Введение

По мере быстрого развития исследований в области вирусологии точная количественная оценка вирусной инфекции остаётся ключевой для понимания механизмов вируса, разработки противовирусных терапий и оценки эффективности вакцин. Одной из самых важных процедур является измерение вирусного титра, то есть концентрации вирусных частиц в образце. Анализ TCID50, который количественно определяет количество частиц инфекционного вируса, необходимых для образования CPE в 50% инокуляционных клеток, является одним из наиболее часто используемых методов определения функционального вирусного титра. Этот широко используемый тест на конечных точках особенно ценен для вирусов, не образующих бляшек, и может служить альтернативой тестубляшек 1.

В целом, анализ TCID50 длится от 2 до 14 дней, в зависимости от вируса и разрешительных клеток. CPE, включая изменения в пролиферации клеток, морфологии и жизнеспособности, оценивается с помощью (1) колориметрического измерения после добавления реагентов, таких как анализ MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида) и MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) с использованием считывателя пластин2, или (2) визуальную оценку морфологических или связанных с культурой изменений с помощью оптических платформ визуализации — например, оценка CPE путём измерения процентнойсовпадения 3, или (3) визуальное обнаружение CPE с помощью кристаллической фиолетовой окрашивания после фиксации вирусно-обработанных колодец формалином или параформальдегидом (PFA). Положительный показатель вирусной инфекции, полученный на основе количества CPE-положительных реплик при каждом разбавлении вируса, лежит в основе расчёта TCID50. Разбавление, при котором 50% культур демонстрируют CPE, статистически рассчитывается с использованием установленных формул4, таких как Reed-Muench, Spearman-Karber и Improved-Karber, и результат сообщается как TCID50 на миллилитр (TCID50/мл).

Традиционные анализы TCID50 и бляшек широко признаны золотым стандартом функциональной вирусной количественной оценки и могут дать бесценные знания. Однако эти анализы часто утомительны, занимают много времени и требуют ручного окрашивания для визуализации CPE, что приводит к низкой пропускной способности, повышенному риску человеческих ошибок и субъективности. Для высокоинфекционных или смертельно опасных вирусов важно минимизировать время воздействия вирусов и уменьшить количество отходов, содержащих вирус, при дополнительных этапах, таких как окрашивание, для повышения биобезопасности. За исключением анализа TCID50 без маркировки, большинство тестов TCID50 и бляшек также являются конечной точкой, что может привести к неоптимальному времени оценки титра и ограничивать возможность наблюдения динамических взаимодействий между вирусами и клетками хозяина. Для преодоления этих ограничений был разработан и установлен упрощённый, без маркировки и в реальном времени анализ TCID50. Хотя концептуально он похож на традиционный тест TCID50, новый метод использует показатели клеточного импеданса, собранные и проанализированные системой RTCA MP, чтобы объективно и непрерывно отслеживать инфекцию на протяжении времени.

Было продемонстрировано и подтверждено, что биосенсоринг на основе импеданса обеспечивает качественное и количественное составное считывание количества клеток, морфологии и силы прикрепления клеточного субстрата без меток и неинвазивнымспособом 5,6. Предыдущие исследования показали, что вирусно-индуцированный CPE можно точно количественно измерить в реальном времени с помощью измерений импедансаRTCA 7,8,9. Вместо отчёта исходных значений импеданса системы используют безединичный параметр, называемый Индекс ячейки (CI), для отражения изменений импеданса, вызванных клеточными событиями. Например, когда клетки прилипают, распространяются и растут на дне колодца, CI увеличивается. Напротив, когда клетки умирают, уменьшаются или отсоединяются, например, во время вирусной инфекции, CI снижается.

Учитывая многообещающие отчеты с использованием импеданса для измерения CPE, это исследование было направлено на демонстрацию, что тест TCID50 на основе импеданса является надёжной и точной альтернативой традиционной количественной оценке вирусов. Модуль вирусологии в программном обеспечении системы позволяет автоматически рассчитывать TCID50 на протяжении всего измерения CPE в реальном времени, упрощая и сокращая процесс анализа, а также предоставляя ценные сведения о кинетике репликации вирусов и их взаимодействии с разрешительным клетками.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Анализ TCID50 на основе импеданса

ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 1 , анализ TCID50 на основе импеданса состоит из четырёх этапов, включая разрешительного посева клеток на пластине биосенсора, подготовку и инокуляцию с помощью разбавления вирусов, измерение CPE в системе и, наконец, анализ данных и расчёт TCID50 с использованием модуля вирусологии программного обеспечения системы.

  1. Подготовка к анализу: возрождение и субкультивирование разрешительных клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап должен быть выполнен за неделю до анализа. Чтобы минимизировать вариации между экспериментами, настоятельно рекомендуется подготовить клеточный банк разрешительных клеток с одинаковым номером пассажа для использования в анализе. Не используйте ячейки старше 15 проходов после покупки у оператора.
    1. Оттаяние криоконсервированных пермиситивных клеток
      1. Теплая клетка для роста в водяной бане при температуре 37 °C не менее 30 минут. Например, для HEK293A была использована модифицированная орлиная среда (DMEM) от Dulbecco, дополненная сывороткой плода (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином.
      2. Разморозить флакон клеток из банка клеток, криоконсервированных для анализов TCID50, мягко покрутив в водяной бане при температуре 37 °C в течение 1-2 минут, пока не появятся несколько ледяных кристаллов; Не погружайте крышку. Протрите флакон 70% этанола и положите его в ламинарный капюшон.
      3. Аккуратно перенесите клетки в новую коническую трубку объёмом 50 мл и добавьте 9 мл нагретой среды для роста.
      4. Центрифугуйте суспензию ячейки при температуре 300 г в течение 4 минут при комнатной температуре.
      5. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте клетки в 15 мл нагретой формы роста. Перенесите их в новую колбу T75.
      6. Выращивать клетки до 80%-90% совпадения в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
    2. Субкультура разрешительных клеток.
      1. Контролируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут 80%-90% совпадения.
      2. Удалите из колбы материал с сывороткой и аккуратно прополосните монослой клетки с помощью физиологического раствора Dulbecco, буферированного фосфатом без Mg- и Ca (DPBS).
      3. Трипсинизуйте клетки, равномерно распределяя 2 мл раствора трипсина/EDTA 0,05% на колбу T75 и оставляя колбу в инкубаторе при температуре 37 °C на 1-3 минуты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не чрезмерно трипсинизируйте клетки, так как это может быть вредно для клеток.
      4. Прекращайте трипсинизацию, добавив 8 мл сывороточной среды, чтобы разбавить исходный объём трипсина как минимум в пять раз. Перенесите 2,5 мл суспензии клетки в новую колбу T75, затем добавьте 8 мл культурной среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования только что разморозившихся разрешительных клеток для анализа TCID50. Вместо этого используйте культивированные клетки с совместимостью 80%-90%. Чтобы снизить межэкспериментальную вариабельность, возрождённые клетки следует поддерживать максимум две недели после оттаивания. Для обеспечения высокой жизнеспособности и пролиферации клеток в течение двухнедельной культуры: (1) менять почву роста не реже двух раз в неделю; (2) субкультура клеток, когда они достигают слияния 80%-90%. Для длительного обслуживания свыше двух недель требуется валидация.
  2. Вирусный титр
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг нужно выполнить в первый день.
    1. Измерение фона плиты биосенсора
      1. Аккуратно перемещайте 50 мкл предварительно подогреного материала в каждую скважину с помощью многоканальной пипетки, используя технику обратного пипетирования, чтобы минимизировать образование пузырьков и обеспечить равномерное распределение объёма.
      2. Поместите тарелку в станцию пластин; откройте программное обеспечение системы и выберите модуль вирусологии перед началом эксперимента. Введите любые соответствующие заметки во вкладку Exp Notes и введите информацию о ячейке, включая имя и номер, на вкладке Cell на вкладке Layout после выбора соответствующих ямак. В качестве альтернативы можно ввести информацию о ячейках после посева.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение фона пластины необходимо провести до добавления ячеек в колодцы пластины. Фоновые показания для всех скважин должны быть в диапазоне от -0,063 до 0,063.
      3. На вкладке «Расписание» нажмите кнопку «Добавить шаг», чтобы добавить Шаг 1, предназначенный для измерения фона пластины. Затем запустите запись, нажав кнопку «Пуск».
      4. Снимите пластину со станции и поставьте её обратно в капот для засева ячеек.
    2. Разрешительная клеточная посадка на 96-ячественную биосенсорную пластину
      1. Трипсинизуйте пропускающие клетки из колбы T75.
      2. Посчитайте ячейки и отрегулируйте суспензию ячеек до нужной концентрации. В этом исследовании концентрация HEK293A составляла 60 000 клеток/мл.
      3. Добавьте 100 мкл ячейки суспензии в каждую яме пластины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная плотность клеток крайне важна. Неоптимальная плотность посева может привести к экспериментальному артефакту. Поэтому плотность посева должна быть оптимизирована перед проведением анализа TCID50.
      4. Оставьте пластину в капюшоне при комнатной температуре на 30 минут после добавления ячеек, чтобы клетки равномерно распределились на дне колодца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Невыполнение этого этапа может привести к значительным колебаниям между скважинами.
      5. Поместите пластину в станцию пластин внутри инкубатора при температуре 37 °C с 5%CO2.
      6. Перейдите на вкладку «Расписание » программы и добавьте Шаг 2 , используя стандартные настройки записи: 100 Sweeps и интервал в 15 минут. Это инициирует мониторинг импеданса/CI каждые 15 минут, что позволяет в реальном времени оценивать прикрепление и пролиферацию клеток как этап контроля качества клетки (QC) перед вакцинацией вируса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: День 2 — Для максимизации воспроизводимости и согласованности анализов в экспериментах крайне важно оценить работу клетки в системе перед переходом к следующему этапу. Поскольку CI отражает прикрепление и рост клеток, значения CI в течение 20-28 часов после посева служат ключевым параметром контроля качества. И значение, и кинетика КИ зависят от конкретной клетки. В этом исследовании для HEK293A клеток, засеянных по 6 000 клеток на скважину и культивируемых в течение 20-28 часов, CI должен превышать 2. Если CI не достигает 2 в течение 20-28 часов после посева, культура HEK293A клеток считается не прошлой контроль качества (QC), и последующий анализ TCID50 не проводится. Этот критерий обеспечивает высокую воспроизводимость экспериментальных результатов.
    3. Подготовка вирусных последовательных разбавлений
      1. Рассчитайте общий объём среды (DMEM + 2% FBS + 1% пенициллина/стрептомицина), необходимого для подготовки разбавлений, и нагрейте её в водяной бане при 37 °C в течение 30 минут. Эта среда будет использована для остальной части эксперимента.
      2. Быстро разморозить флакон с аликотированным вирусным запасом в водяной бане при температуре 37 °C в течение 1-2 минут, пока все кристаллы льда не растают.
      3. Подготовьте 10-кратно серийно разбавленные вирусы, переместив 20 мкл вирусного запаса в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, содержащую 180 мкл предварительно нагретой среды на каждом этапе. Пипеты вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное смешивание среды и вируса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не погружайте кончик пипетки слишком глубоко в вирусный раствор, чтобы предотвратить перенос избытка вирусных частиц за пределы кончика, что может привести к неточным разбавлениям.
      4. Чтобы предотвратить колебания показаний импеданса, вызванные добавлением образцов вируса простуды, уравновесьте разбавления вируса, инкубировав их в инкубаторе при 37 °C с 5%CO2 в течение 20 минут до инокуляции.
    4. Введите информацию о лечении вирусов во вкладке «Макет »
      1. На вкладке Layout в программном обеспечении; выбирайте колодцы для лечения вирусным титром; нажмите на подвкладку Лечение и введите начальное разбавление, например, 0.001 (10-3) в этом эксперименте; введите 10 как «коэффициент разбавления»; выберите направление разбавления, в данном случае слева направо. Разбавление вируса будет автоматически рассчитываться на основе входной конфигурации пластины и отображаться в каждой соответствующей яме.
      2. Далее введите объём вакцинации вируса и нажмите кнопку «Применить », чтобы сохранить всю информацию о лечении. Этот этап необходим для точного расчёта TCID50/мл при анализе данных.
      3. Назначьте скважины, которые не будут обрабатываться вирусами, как отрицательные контроли, выбрав соответствующие скважины и затем поставив галочку Negative Ctrl в разделе «Тип скважины » во вкладке «Лечение ».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные контрольные скважины должны быть выделены и добавлены на страницу макета; пропуск помешает вычислению TCID50.
    5. Инокуляция вирусов
      1. Когда готовы, нажмите кнопку паузы в программном обеспечении, чтобы остановить сбор данных. Снимите пластину со станции и поместите её в ламинарный капюшон.
      2. Аккуратно удаляйте посевную среду из колодцев пластины с помощью многоканальной пипетки.
      3. Аккуратно добавьте 50 мкл вирусного разбавления с помощью многоканальной пипетки к верхней части клеточного монослоя, чтобы избежать нарушения культуры клетки.
      4. Поставьте пластину обратно в станцию и добавьте шаг 3 с настройками записи по умолчанию (100 Sweeps и 15-минутный интервал) на вкладке Schedule , чтобы возобновить импеданс записи каждые 15 минут в течение 2 часов, позволяя вирусу связываться с клетками.
      5. После 2 часов вакцинации вируса приостановите запись и уберите пластину со станции на ламинарный капот.
      6. Медленно добавляйте 150 мкл предварительно нагретой среды в колодцы с помощью многоканальной пипетки, чтобы избежать нарушения монослоя ячейки; Верните тарелку на станцию.
      7. Продолжите шаг 3, нажав на «Начало» на вкладке «Расписание». Сигналы импеданса измеряются непрерывно каждые 15 минут на протяжении всего периода инокуляции.
    6. Расчёт TCID50 во время или после завершения анализа TCID50
      1. На вкладке «Анализ данных » выберите и добавьте все скважины, использованные в анализе, в график графика. Ось y на графике определяется опцией, выбранной в выпадающем меню Y Axis .
      2. Перейдите в раздел Параметры . Выберите TCID50 из выпадающего списка параметров, чтобы начать вычисление TCID50.
      3. Выберите Гистограмму для расчёта TCID50 в определённый момент времени или выберите Time Dependent TCID50 , чтобы сгенерировать временной курс TCID50 за желаемый период во время прививки. TCID50/мл будет рассчитан и отображаться после нажатия кнопки исполнения.

2. Кристаллический фиолетовый анализ TCID50

  1. Пропускающие клетки семян в микропластине на 96 лунок при оптимальной плотности посева, как описано в тесте TCID50 на основе импеданса (шаги 1-2).
  2. Проведите подготовку и инокуляцию вирусного последовательного разбавления согласно тесту TCID50 на основе импеданса.
  3. Фиксация и окрашивание
    1. После завершения анализа аккуратно сбросьте супернатант из каждой ямы и добавьте 100 мкл 4% формальдегида для фиксации ячеек.
    2. Инкубировать при 4 °C в течение 1 часа, затем удалить фиксатор.
    3. Покрасьте фиксированные клетки 0,5% Crystal Violet, приготовленной в PBS. Инкубировать при комнатной температуре 30 минут.
    4. Помой тарелку водопроводной водой, пока фон не очистится. Дайте тарелке полностью высохнуть на воздухе перед тем, как набрать налёт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кристально-фиолетовые отходы считаются опасными как по RCRA, так и по Кодексу правил Калифорнии (CCR 66261.24). Соберите все отработанные растворы кристаллических фиолетовых растворов, загрязнённые материалы (например, бумажные полотенца, перчатки) и промывайте отходы в специально отведённом контейнере для опасных отходов. Утилизируйте отходы через вашего учреждения по охране окружающей среды и безопасности (EH&S) или лицензированного подрядчика по утилизации опасных отходов.
  4. Оценка и расчёт TCID50
    1. Визуально осмотрите каждую скважину на наличие CPE. Положительный колодец показывает частичное или полное разрушение монослоя и более светлое окрашивание. Отрицательная яма сохраняет целый монослой с тёмно-фиолетовыми пятнами.
    2. Посчитайте количество положительных и отрицательных яжек для каждого разбавления.
    3. Ручной расчет TCID50/мл с использованием метода Рида-Мюнха, исходя из объёма инокуляции 150 мкл.

Результаты

Без маркировки, в реальном времени, динамический мониторинг вирусно-опосредованного CPE с использованием импеданса
Чтобы подтвердить, что вирусно-индуцированный CPE можно надёжно и количественно измерять по импедансу, мы впервые зафиксировали изменения клеток HEK293A клеток после заражения Adv-GFP с помощью системы RTCA eSight, которая одновременно измеряет импеданс и фиксирует изображения живых клеток из той же популяции, предоставляя полезную информацию о поведении клеток. HEK293A клетки были засеяны на биосенсорной пластине с 96 лунками при плотности посева 6 000 клеток/скважину в течение 24 часов, а затем инфицировались Adv-GFP при 10-4 IFU/mL. Импеданс и изображение живых клеток были зафиксированы в течение 250 часов после инокуляции (рисунок 2A). Чтобы минимизировать вариабельность, вызванную различиями в засеянности клеток, и выявить относительные изменения после обработки, для отображения коллективных изменений в росте, прикреплении и жизнеспособности клетки со временем использовался Нормированный клеточный индекс (NCI). NCI рассчитывается путем деления CI в заданной точке времени на его CI в точке нормализации (времени до вакцинации). Кинетический след NCI неинфицированного контроля (рисунок 2A, чёрный след) демонстрирует постепенное увеличение в течение первых 48 часов, что указывает на непрерывное размножение клеток. В конце теста следует плато, что указывает на то, что клетки слились и покрыли всю поверхность золотых биосенсоров. В отличие от этого, кинетика NCI в заражённых вирусом скважины опускалась ниже контрольного уровня через 50 часов после прививки и постепенно снижалась, пока не достигла нуля через 100 часов.

Визуализация живых клеток, полученная из той же популяции, визуально подтвердила, что сигнал импеданса надёжно отражает физическое состояние разрешительных клеток по мере их продвижения по всему континууму CPE. Как показано на рисунке 2A, наблюдается обратная корреляция между NCI и экспрессией вирусного GFP в инфицированных HEK293A клетках, наблюдаемой в первые 100 часов до полного лизиса перризирующих клеток. Кроме того, изображения живых клеток (рисунок 2B), записанные в указанные моменты времени, дополнительно демонстрируют дозионный клеточный статус во время вирусной инфекции. Рост клеток сохранялся в первые 48 часов после заражения, в то время как вирусные частицы оставались на низких уровнях внутри клеток. Однако по мере прогрессирования репликации вируса и инфекции начиналась клеточная гибель, о чём свидетельствовало снижение слияния и усиление сигнала GFP в клетках хозяина. Примерно через 100 часов после инокуляции экспрессия вирусного GFP начала снижаться из-за значительной потери жизнеспособных проницательных клеток. Этот интегрированный подход укрепляет надежность обнаружения вирусно-индуцированного CPE по импедансу, создавая прочную основу для анализа TCID50 на основе импеданса.

Автоматический расчет TCID50, полученный на основе показания импеданса
Точное определение положительных скважин CPE имеет решающее значение для надёжного расчёта TCID50. Для оценки того, может ли тест TCID50 на основе импеданса точно и объективно различать положительный и отрицательный CPE при поддержке вирусологического модуля программного обеспечения системы, HEK293A клетки были засеяны в 6 000 клеток/скважину в течение 24 часов до инокуляции и обработаны серией десятикратных разбавлений Adv-GFP с использованием восьми репликат (колодц) для каждого разбавления. Индуцированный Adv-индуцированный CPE записывался в реальном времени в системе RTCA. На рисунке 3A кинетические следы импеданса, представленные как NCI, записывались и автоматически отображались на протяжении всего эксперимента. Снижение NCI после прививки показывает явный дозозависимый CPE, что подтверждается сильной корреляцией между количеством добавленного вируса и скоростью снижения импедансного сигнала. Клетки, подвергшиеся высоким вирусным нагрузкам — от 10-3 до 10-7 разбавления, — демонстрировали резкое и стабильное снижение NCI, что отражает устойчивый и равномерный CPE в репликационных скважинах. В отличие от этого, при разбавлении вируса 10-8 кинетический след с самого начала проявлял значительную вариабельность, что приводило к значительно большим отклонениям стандарта NCI, особенно спустя 100 часов после вакцинации. Когда вирусная нагрузка была дополнительно снижена ниже порога, необходимого для вызова инфекции, в данном случае разбавления 10-10 , НКИ становился неотличимым от отрицательных контрольных факторов. Эти данные показывают, что при разбавлении 10-8 вирус не мог индуцировать CPE во всех повторяющихся скважинах при одинаковой кинетике; 2) это разбавление будет разделительной линией между концентрациями, вызывающими КПЭ во всех повторах, и теми, которые индуцируют КПЭ только в некоторых или ни в каких репликациях; Этот бинарный результат, инфицированный (обозначенный изменением CI, вызванных CPE) или не инфицированный (без изменения CI), служит основой для расчёта TCID50 с использованием статистических методов в системном программном обеспечении. Таким образом, глубокая вариация NCI, наблюдаемая при определённых концентрациях вируса, является ключевым индикатором возникновения частичной инфекции и может быть решающей для экстраполяции, необходимой для расчёта TCID50.

Как и в классическом анализе TCID50, порог положительного CPE должен быть определен, прежде чем встроенное программное обеспечение сможет автоматически идентифицировать CPE-положительные скважины. Поскольку разные вирусы и модели разрешительных клеток могут требовать определённых порогов, программное обеспечение позволяет пользователям настраивать и уточнять эти критерии внутри модуля Вирусология. На основе эмпирических данных был применён стандартный порог для положительного CPE программного обеспечения, определяемый как значение NCI обработанного вирусом колодца, более чем на три стандартных отклонения ниже среднего NCI отрицательных (невакцинированных) контролей, то есть NCI-обработанноговирусом < (NCI-3 X SD) отрицательный ctrl. Отдельные скважины затем оценивались как положительные (+) или отрицательные (-) (рисунок 3B). В этом случае TCID50/мл Adv-GFP был впоследствии рассчитан с использованием формулы Рида-Мюнча, одной из формул, включённых в программное обеспечение. Кроме выбора или определения критериев положительного CPE, для вычисления TCID50 не требовалось никаких ручных действий, так как программное обеспечение полностью автоматизировало процесс.

Динамическое отслеживание TCID50 во время заражения вирусом
Для определения подходящей продолжительности анализа TCID50 значения Adv-GFP TCID50 были извлечены в нужные моменты после заражения, начиная с 30 часов и продолжая с шагами по 30 часов до 240 часов. Был выбран шаг в 30 часов, так как репликация аденовируса, как сообщается, занимает примерно 30 часов10 часов. Значения Adv-GFP TCID50 были нанесены на график как функция времени (рисунок 4). Заметным наблюдением является постепенное увеличение значений TCID50, которое продолжается примерно через 150 часов после вакцинации. За этой точкой формируется плато, указывающее на равновесие, где, вероятно, цитопатические эффекты достигли насыщения. Временно-зависимое увеличение и стабилизация свидетельствуют о типичной кривой репликации вируса. Начальная фаза характеризуется активным распространением вируса, достигая пика, отражающего максимальное цитопатическое воздействие в заданных экспериментальных условиях. Плато TCID50 может отражать биологический потолок, при котором процесс вирусной инфекции задействовал большинство разрешительных клеток, что приводит к значительной гибели клеток и останавливается дальнейшее размножение вируса. Кинетический ход TCID50 предполагает, что анализ можно завершить через шесть-семь дней после прививки для модели аденовируса-HEK293A, поскольку стабильное значение TCID50 составляло 8,9 × 109 TCID50/мл наблюдалось уже в 150 часах.

Количественное определение титра вируса гриппа А с использованием импедансного анализа TCID50
Для изучения возможности расширения импедансного анализа TCID50 на другие модели вируса-хозяина был проведён анализ TCID50 в клетках MDCK, инфицированных IAV. Учитывая незначительные вариации среды, специфичной для IAV, основная процедура анализа оставалась согласованной с установленной для аденовируса. Рисунок 5A показывает NCI клеток MDCK со временем после инокуляции с разбавлениями IAV в диапазоне от 1 x 10-2 до 5 x 10-9. Аналогично результатам, наблюдаемым в клетках HEK293 A, инфицированных ADV, неинфицированные/отрицательные контрольные ямы демонстрировали стабильный и последовательный NCI на всех репликах. Однако вирусно-инфицированные скважины выявили изменение NCI, зависящее от дозы. При низких дозах — 6,4 и 1,3 x 10-7 — наблюдалось значительное стандартное отклонение. Это говорит о том, что при этих разбавлениях концентрация вируса приближалась к TCID50.

CPE-положительные скважины были идентифицированы по тем же критериям и порогу, что и в модели Adv-HEK293A, а именно с трёхкратным стандартным отклонением ниже среднего значения отрицательных контрольных скважин. Значения TCID50 на основе импеданса для IAV также определялись в разные моменты времени после прививки. Рисунок 5B показывает средние значения TCID50 из двух независимых экспериментов. За исключением ранней временной точки на 60 ч, значения TCID50 с 90 по 150 часов после заражения показали хорошую стабильность и стабильность, что указывает на то, что анализ TCID50 на основе импеданса для IAV можно надёжно завершить за четыре дня вместо пяти. Эта согласованность подтверждает устойчивость метода, основанного на импедансе, подтверждая его адаптивность и надёжность к различным вирусным патогенам.

Валидация теста TCID50 на основе импеданса с использованием традиционного метода TCID50
Для подтверждения импедансного TCID50 для измерения концентрации IAV параллельно проводились анализы TCID50 с использованием двух альтернативных методов: без маркировки и кристаллически фиолетового окрашивания. Кратко временно клетки MDCK были подготовлены и засеяны в микротитровые пластины с 96 колодцами. На следующий день клетки были инокулированы серией разбавлений IAV в течение 5 дней. Для анализа TCID50 на основе визуализации живых клеток проводилось каждые 4 часа. Концентрации десяти образцов IAV были оценены в ходе валидационного исследования. Слияние клеток в обработанных вирусами колодцев сравнивалось с отрицательным, неинфицированным колодцем с помощью программного обеспечения системы. Однако анализ визуализации клеток MDCK был особенно сложным, как показано на рисунке 6A. Точная дифференцировка между клетками и пустыми пространствами была сложной из-за плоской морфологии и плохо определённых краёв клеток MDCK, что снижало надежную идентификацию CPE-положительных ямок с помощью анализа, основанного на визуализации. Использование более продвинутого и сложного программного обеспечения для анализа визуализации может повысить точность вычислений TCID50 в такихслучаях 11. В данном случае оценка TCID50 на основе изображений без маркировки оказалась неудачной с использованием существующего программного обеспечения. Для анализа кристаллического фиолетового окрашивания TCID50 клетки фиксировались и окрашивались на пятый день после прививки, как описано в разделе протокола. Рисунок 6B демонстрирует сильную линейную корреляцию между значениями TCID50 на основе импеданса и кристаллического фиолетового окрашивания, с регрессионным уравнением y = 0,9582x и R² = 0,9979. Этот сравнительный анализ подчёркивает надёжность метода измерения вирусного титра на основе импеданса и его пригодность для анализов TCID50.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс анализа TCID50 на основе импеданса. Шаг 1: Разрешительная клеточная посадка на биосенсорную пластину. Разрешительные клетки посейте на тарелке с оптимальной плотностью посева. Затем рост клеток контролируется в системе в рамках процедуры контроля качества клеток (QC). Шаг 2: подготовка и прививка вирусов. Подготовьте последовательно разбавленные вирусные запасы с использованием пользовательского коэффициента разбавления. Удалите пластину из системы и добавьте вирусы в колодцы пластины в ламинарном капюшоне. Шаг 3: Измерение и оценка CPE-положительных скважин с помощью CPE-положительных скважин с помощью программного обеспечения Virology Module. Верните пластину в систему и возобновите запись вирусно-индуцированного CPE в реальном времени. Программное обеспечение автоматически определяет CPE-положительные скважины на основе установленного пользовательским порогом для обнаружения CPE. Шаг 4: расчёт TCID50. С учетом оценки CPE-положительных скважин в реальном времени по сравнению с вирусной инокуляцией, программное обеспечение вирусологического модуля может рассчитывать значения TCID50 в любой момент времени на протяжении всего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Аденовирус-индуцированная ЦПЭ оценивалась как с использованием импедансных, так и визуализационных методов . (A) Динамическое профилирование импеданса (левая ось y) и зелёной флуоресценции (правая ось y) в HEK293A клетках в течение времени после заражения Adv-GFP. Нормализованный клеточный индекс для клеток, инфицированных аденовирусом (инфицированные ADV-инфицированными NCI, красная линия), отрицательные контрольные клетки (NCI NC, чёрная линия) и общая интегрированная интенсивность GFP (инфицированные ADV, зелёная линия) отображаются в зависимости от времени. Общая интегрированная интенсивность GFP отражает экспрессию GFP в пермисивных клетках и служит индикатором вирусной инфекции. Числа (1-6) по индексу нормализованных клеток соответствуют определённым временным точкам во время процесса заражения. Данные представлены как среднее ± SD (N = 8). (B) Последовательные изображения HEK293A клеток до и после заражения аденовирусом-GFP. (1) За исходным изображением (0 ч) следуют снимки через 48 ч (2), 72 часа (3), 96 ч (4), 120 ч (5) и 200 ч (6) после заражения, иллюстрирующие изменения роста клеток, жизнеспособности и флуоресценции аденовируса-GFP со временем. Масштабные полосы = 160 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Дозозависимый CPE аденовируса-GFP в HEK293A клетках, измеряемых импедансом. (A) HEK293A клетки были посеяны в биосенсорную пластину с плотностью 6 000 клеток на колодцу, а через 24 часа были инфицированы серией 10-кратно разбавленных аденовирусных GFP. Данные представлены как среднее ± SD (N = 8). Вставка: Нормализованный клеточный индекс колодцев, инфицированных аденовирусом-GFP при разбавлении 10-8 . Данные о разбавлениях 10-9, 10-11 и 10-12 опущены для ясности. (B) Отдельные колодцы/репликаты при каждом разбавлении вируса оценивались как CPE-положительные (+) или CPE-отрицательные (-). Каждая колонка пластины была обработана разным вирусным разбавлением, при этом градиент разбавления варьировался от самого низкого в столбце 1 до самого высокого в столбце 10. Колонки 11 и 12 были отрицательными контрольными скважинами, без лечения вирусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Временной ход значений TCID50, полученных на основе измерений импеданса CPE в клетках HEK293 после заражения аденовирусом-GFP. TCID50/мл аденовируса-GFP рассчитывался в определённые временные точки с использованием вирусологического модуля из пяти экспериментов. Хотя модуль по вирусологии содержит три формулы расчёта TCID50, для расчёта TCID50 была выбрана формула Рида-Мюнча. Данные представлены как среднее ± SD (N = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Оценка титра вируса гриппа А с использованием импедансного анализа TCID50. (A) Дозозависимый CPE IAV в клетках MDCK, измеряемый с помощью импеданса. Клетки MDCK были засеяны в биосенсорную пластину с объёмом 8 000 клеток на скважину и через 24 часа заражены пятикратным последовательным разбавлением вируса гриппа. Данные представлены как среднее ± SD (N = 8). Данные из разбавления 2.6 × 10⁻⁸ опущены для ясности. (B) Временной ход значений TCID50, полученных на основе измерений импеданса в клетках MDCK, инфицированных IAV. Метод Рида-Мюнха использовался для расчёта TCID50. Данные представлены как среднее ± SD (N = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Корреляция между тестами TCID50 на основе импеданса и кристаллического фиолетового окрашивания. (A) Изображение клеток MDCK, инокуленных IAV. Масштабная полоса = 160 мкм. (B) Сравнение значений TCID50/мл, полученных методами окрашивания на основе импеданса и кристаллической фиолетовой окрашивательной линии, было проведено с использованием десяти образцов IAV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7: Представительные интерфейсы программного обеспечения модуля вирусологии системы. Программное обеспечение упрощает процесс анализа TCID50 на основе импеданса. (1) Планировка пластин для записи дизайна эксперимента; (2) Индекс клеток или нормализованный индекс ячейки автоматически отображался и отображался программным обеспечением во время инокуляции вируса; (3) программное обеспечение обеспечивает гибкость в определении положительных критериев CPE и выборе формулы расчёта TCID50; (4) TCID50/мл можно определить в любой момент времени во время анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

В этом исследовании была продемонстрирована применимость импеданса для определения вирусного титра с помощью моделей аденовируса-HEK293A и гриппа А-вируса MDCK. Другие также подтвердили надёжное и надёжное выявление вирусно-индуцированного ЦПЭ с помощью систем RTCA у широкого спектра вирусов, включая ортопоксвирус12, вирус Западного Нила (WNV) и вирус энцефалита Сент-Луиса (SLEV)13, вирусчикунгунья 14, инфекционный бурсальныйвирус 8, химерную желтую лихорадкуденге 15, вирус гепатитаА 16, SARS-CoV-217 и вирусденге 9.

Запись CPE в реальном времени с помощью импеданса позволяет выявлять специфические для вируса временные падения значения CI в некоторых моделях клеток, допускающих вирусы. Фанг и соавт. впервые показали, что кинетический параметр, характеризующий индуцированный флавивирусом CPE, CIT50 — определяемый как время до снижения импеданса клеток на 50% — обратно пропорционален вирусной инфекционной дозе в определённом диапазоне. Они также показали, что CIT50 пропорционален обратному титру нейтрализующегоантитела 13. С тех пор Шарретье и соавт. из Sanofi Pasteur исследовали этот метод импедансного анализа клеток в реальном времени (RTCA) для определения вирусных инфекционных титров в процессе разработки вакцины против химерной жёлтой лихорадки и денге (CYD) ипроцесса 15. Charretier et al.15 дополнительно подтвердили эту инфекционную дозу 50% (CCID50) с помощью теста CCID50 на основе иммунного окрашивания. Они показали, что метод RTCA на основе импеданса примерно в 5 раз менее трудоёмкий и в 3,5 раза более экономически эффективен, чем стандартный анализ CCID50 в промышленных условиях. В нашем исследовании была продемонстрирована валидация импедансного TCID50 с традиционным анализом Crystal Violet TCID50 для индуцированного IAV CPE. Кроме того, в программном обеспечении RTCA использовался программный модуль вирусологии. CPE-положительные скважины были автоматически идентифицированы на основе пользовательских критериев для CPE-положительных скважин в программном обеспечении; в нашем случае степень CI снижается по сравнению с отрицательными контролями. Затем программное обеспечение рассчитывало TCID50, что позволяло точно определить титр без зависимости от CIT50 и риска выхода пробы за пределы оптимального диапазона. Установление подходящего порога для CPE-положительных скважин крайне важно, так как это напрямую влияет на чувствительность и специфичность анализа. Рекомендуется пользователям определять специфические критерии для вируса, сравнивая изменения Клеточного Индекса с результатами их проверенного традиционного метода. Эти эмпирически выведенные пороги могут быть затем настроены и уточнены в модуле вирусологии программного обеспечения.

Как и в других клеточных анализах, состояние пермисситивных клеток, используемых в тестах TCID50 на основе импеданса, имеет решающее значение для оценки успеха теста и качества результатов. Для обеспечения высокого пролиферации и жизнеспособности клеток рекомендуется использовать свежие клетки с низким проходом. Кроме того, создание банка клеток из пропускающих клеток в одном проходе может повысить воспроизводимость в разных экспериментах. Как показано на рисунке 3A, когда пропустительные клетки находились в оптимальных условиях, они генерировали стабильные и последовательные сигналы импеданса в неинфицированных контролях на протяжении всего анализа. Он предоставил надёжную базовую отчётность для установления порога для CPE-положительных скважин, что позволило точно определить титр вируса. Кроме того, тест TCID50 на основе импеданса уникально способен проводить контроль качества на дозировочных клетках до оценки титра вируса. Характерный кинетический CI-профиль здоровых пропустительных клеток служит надёжным показателем контроля качества, обеспечивая использование только жизнеспособных и последовательных популяций клеток для количественной оценки вирусов, тем самым повышая воспроизводимость и точность анализа.

Для каждого нового вируса также следует проводить оптимизацию и валидацию теста с импедансом и TCID50 перед внедрением. Ключевые факторы, такие как условия клеточной культуры, включая базальную среду и концентрацию FBS, критически важны для получения воспроизводимых данных по клеточному импедансу и повышения чувствительности обнаружения CPE, как было отмечено в предыдущихисследованиях 6,16. В этом отношении технология без маркировки и на основе импеданса в реальном времени доказала свою пользу как простый, эффективный и ценный инструмент для оптимизации условий клеточной культуры во время разработкианализов 16.

Ограничение теста импеданс-TCID50 возникает у вирусов, не вызывающих CPE, поскольку анализ основывается на CPE для генерации изменений показания импеданса, что и лежит в основе расчёта TCID50. В таких случаях может потребоваться выявить альтернативную пермиссивную модель клеток, способную проявлять вирусно-индуцированный ЦПЭ, или применить иммуно-окрашивающий подход, при условии наличия подходящего антитела к конкретному вирусному антигену. Тем не менее, это исследование продемонстрировало способность системы RTCA MP захватывать дозозависимый CPE и эффективно различать инфицированные и неинфицированные клетки с помощью объективного и чувствительного импедансного показания.

Внедрение временно-зависимого анализа TCID50 представляет собой значительный прогресс по сравнению с традиционными измерениями конечных точек. Это упрощает процесс оптимизации анализа TCID50, так как оптимальный момент времени для расчёта и отчёта вирусного титра можно легко получить с помощью одного анализа в реальном времени. Хотя анализы TCID50 без меток на основе визуализации также могут давать значения TCID50 с временным разрешением, их применимость ограничена моделями вирусных клеток, которые демонстрируют CPE, распознаваемый алгоритмами программного обеспечения визуализации, как показано на модели IAV-MDCK (рисунок 6A). Кроме того, использование импеданса без маркировки для обнаружения CPE устраняет сложности использования различных реагентов и многоступенчатых рабочих процессов, которые потенциально увеличивают риски, связанные с человеческими ошибками. Помимо упрощения рабочего процесса, модуль вирусологии в программном обеспечении системы также упрощает анализ. Во-первых, всё начинается с простого расписания экспериментов для автоматической системной записи. После каждого измерения следует спонтанное CPE-положительное оценивание в реальном времени, а затем автоматический расчет TCID50 для простой количественной оценки инфекционных вирусных частиц (рисунок 7). Эта автоматизация значительно сокращает время непосредственного взаимодействия, что является важным улучшением, особенно при работе с высокозаразными вирусами.

Раскрытие информации

Ни одного.

Благодарности

Ни одного.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин 0,53 мМ EDTA  (1x)Корнинг25-052-CI
12 Реагентные резервуары каналаVistaLab Technologies3054-1011
Аденовирус-GFPVector Biolabs 1060
Среда DMEMATCC30-2002
E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Сыворотка плода крупного рогатого скотаAvantor97068-085
Ячейка Hek293AThermo Fisher Scientific   R70507
Раствор пенициллина-стрептомицинаHyCloneSV30010
Физиологический раствор с буфером фосфатов (1 раз)HyCloneSH30256.01
Морская плака агарозаЛонза50101
xCELLigence RTCA система eSightAgilentS2833AA
Система xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

Ссылки

  1. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  2. Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
  3. Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
  4. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  6. Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
  7. Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
  8. Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
  9. Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
  10. Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
  11. Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
  12. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
  13. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  14. Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
  15. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
  16. Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
  17. Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Измерение импедансамониторинг в режиме реального временицитопатический эффектбезмаркерный анализсерийное разведение вирусаавтоматизированный количественный анализ вирусаклетки HEK293Aклетки MDCK
Упрощённый, без маркировки анализ инфекционной дозы 50% тканевых культур (TCID50) в реальном времени с использованием импеданса для автоматизированного количественного определения вирусного титра
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.