Методическая статья

Модель мочевого пузыря in vitro катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 июня 2025 г.

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описывается in vitro модель катетеризированных мочевыводящих путей, которая может быть использована для изучения как планктонных, так и биопленочных бактериальных клеточных популяций при смоделированных катетер-ассоциированных инфекциях мочевыводящих путей. Эта модель может быть в дальнейшем использована для изучения эффективности противомикробных препаратов, направленных на борьбу с инфекциями мочевыводящих путей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Катетер-ассоциированные инфекции мочевыводящих путей (КАИМП) относятся к числу наиболее распространенных инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Образование биопленки на мочевых катетерах является ключевым аспектом в патогенезе этих инфекций и часто приводит к закупорке катетеров и серьезным осложнениям, таким как пиелонефрит и сепсис. Подходы к моделированию и изучению образования биопленки в этих условиях имеют важное значение как для фундаментального понимания механизмов, лежащих в основе патогенеза CAUTI, так и для разработки и надежной доклинической оценки эффективных терапевтических стратегий для контроля CAUTI и катетерной блокады. В этом протоколе описывается модель катетеризированных мочевыводящих путей in vitro , которая повторяет закрытую дренажную систему катетера, используемую в клинической практике, облегчая изучение CAUTI и образование биопленки катетера в репрезентативных условиях. Кроме того, в этом протоколе подробно описывается применение модели мочевого пузыря in vitro для оценки эффективности антимикробных продуктов для поддержания катетера, включая продукты, доступные в настоящее время в цепочке поставок NHS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мочевые катетеры являются одними из наиболее часто используемых медицинских устройств, с оценочной распространенностью 19% в учреждениях неотложной помощи 1,2,3. Катетеры в первую очередь используются для помощи в управлении диурезом в случаях дисфункции мочевого пузыря и вводятся непосредственно в мочевой пузырь, позволяя моче выводиться из мочевого пузыря через центральный просвет 2,3. Мочевые катетеры могут использоваться либо периодически, когда они периодически вводятся в мочевой пузырь для отвода мочи, либо стационарные катетеры, когда катетеры остаются на месте в мочевом пузыре для непрерывного дренирования мочи 3,4. Несмотря на широкое распространение, мочевые катетеры являются самым большим фактором риска развития инфекций мочевыводящих путей (ИМП), на долю которых, по оценкам, приходится пятая часть инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Действительно, сам катетер часто выступает в качестве начального места микробной колонизации, обеспечивая поверхность для прилипания уропатогенов и дальнейшей колонизации мочевыводящих путей 1,6,7,8. Практически все пациенты, подвергающиеся длительной непрерывной катетеризации (когда катетер остается на месте в течение ≥28 дней), испытывают бактериурию, при этом риск увеличивается на ~5% за каждый день нахождения катетера in situ 2,9,10,11. Соответственно, около 80% ИМП связаны с использованием мочевого катетера6.

Катетер-ассоциированные инфекции мочевыводящих путей (КАИМП) представляют собой значительную нагрузку на службы здравоохранения и часто связаны с более серьезными симптомами верхних отделов мочевыводящих путей (такими как уретрит и пиелонефрит), чем неосложненные ИМП, а также с повышенным риском вторичных инфекций кровотока 1,7,12,13,14. Стандартные методы лечения КАИМП включают антибиотикотерапию, однако эти инфекции часто не поддаются антимикробному лечению в результате развития сложных биопленочных сообществ на поверхности катетера 15,16,17,18,19,20. Действительно, подсчитано, что ~80% CAUTI являются результатом биопленкообразующих патогенов мочевыводящих путей19. Биопленкообразование характеризуется прикреплением бактериальных клеток к поверхностям катетеров и развитием сообществ, встроенных в обширную матрицу внеклеточных полимерных веществ (ЭПС)21,22,23,24. Производство EPS является определяющей чертой биопленочных сообществ и отвечает за многие из возникающих свойств, проявляемых биопленочными клетками, таких как повышенная устойчивость к противомикробным агентам и иммунный клиренс 21,22,24. ЭПС может играть непосредственную роль в этих фенотипах, физически защищая клетки и защищая их от противомикробных препаратов или иммунных эффекторов, а также косвенно, способствуя развитию более широких аспектов биопленочных сообществ, таких как физико-химическое микроокружение биопленки и образование персистентных клеток 23,24,25,26. Кроме того, некоторые уропатогены, в том числе Proteus spp., на долю которых приходится ~11% CAUTIs, обладают мощными ферментами уреазы, позволяющими им гидролизовать мочевину, присутствующую в моче, что приводит к общему увеличению pH мочи 2,27,28,29,30. Это повышение pH сопровождается осаждением кристаллов фосфата кальция и магния, которые могут быть включены в растущую биопленку, что приводит к биоминерализации и образованию плотных кристаллических структур биопленки, способных блокировать катетеры. Эти кристаллические биопленки не только делают лечение проблематичным, но и могут инициировать серьезные осложнения, такие как пиелонефрит и септицемия 2,28,31,32,33,34.

Сложная экологическая ниша в катетеризированных мочевыводящих путях и важная роль образования биопленки при этих инфекциях создают особые проблемы в изучении патогенеза CAUTI. Простые и широко используемые лабораторные модели для изучения и количественного определения образования биопленки, такие как 96-луночные анализы на планшетах, недостаточны для изучения образования биопленки в CATUI, особенно в кристаллических биопленках. Например, такие модели не учитывают ключевые аспекты ниши CAUTI, такие как сложная питательная среда, обеспечиваемая мочой, то, как поверхность катетера влияет на адгезию и последующее производство биопленки, а также непрерывный поток мочевой среды 35,36,37,38,39,40. Кроме того, стандартные анализы, используемые для определения чувствительности уропатогенов к противомикробным препаратам, часто не отражают реальную клиническую восприимчивость. Анализы минимальной ингибирующей концентрации и тесты на микробную суспензию часто используются для определения антимикробной чувствительности патогенов CAUTI, но, как правило, не моделируют важные переменные среды CAUTI, такие как влияние присутствия мочевого катетера и любое последующее образование биопленки на чувствительность к противомикробным препаратам 41,42,43.

В этом исследовании подробно описывается настройка и запуск модели мочевого пузыря in vitro, которая имитирует среду катетеризированных мочевыводящих путей и воспроизводит стандартную катетерную систему закрытого дренажа, используемую в клинической практике, впервые описанную Stickler et al.44 в 1999 году (Рисунок 1). В этой модели используются катетеры Фолея стандартного размера (которые в настоящее время доступны в цепочке поставок NHS) и искусственные мочевые среды (AUM), как ранее было описано Nzakizwanayo et al.45для моделирования CAUTI и образования биопленки. Модель мочевого пузыря in vitro состоит из стеклянной камеры с двойными стенками, которая действует как «мочевой пузырь» и имеет выходное отверстие, через которое катетер Фолея может быть введен в центральную стеклянную камеру. В верхней части центральной стеклянной камеры находится входное отверстие, через которое AUM может подаваться в «мочевой пузырь» с биологически значимой скоростью потока с помощью перистальтического насоса, который будет протекать через катетер через дренажные отверстия в мешок для отходов. Кроме того, внешняя камера подключена к контуру водяной бани, что позволяет поддерживать постоянную температуру моделей. Модель мочевого пузыря in vitro может быть инокулирована через центральную камеру, что позволяет изучать патогены CAUTI в биологически репрезентативной нише. Кроме того, поскольку модели катетеризируются и постоянно снабжаются свежими AUM, можно изучать рост и динамику популяций как планктонных, так и биопленочных клеток.

В прошлых исследованиях модели мочевого пузыря in vitro использовались для нескольких приложений, включая фундаментальное изучение образования биопленки у известных патогенов CAUTI, включая Proteus mirabilis и Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Кроме того, модель in vitro была использована для оценки эффективности продуктов, предназначенных для контроля CAUTI или предотвращения закупорки 50,51,52. В последнее время были использованы модели для определения того, влияют ли адаптации и мутации, связанные с УПП, на формирование биопленки и патогенез CAUTI у P. mirabilis43,46. Модель мочевого пузыря in vitro также использовалась для изучения новых антимикробных методов лечения, направленных на лечение CAUTI, включая недавно разработанные тераностические покрытия катетеров и методы лечения фаговой терапией47,48. Этот протокол включает в себя настройку и запуск моделей мочевого пузыря in vitro, подсчет жизнеспособных планктонных и биопленочных клеток с поверхности модели и мочевого катетера соответственно, а также измерение pH мочи для мониторинга продукции уреазы. Также подробно описаны протоколы оценки противомикробных продуктов, направленных на лечение или профилактику CAUTI, включая растворы для орошения мочевого пузыря и антимикробные лубрикантные гели, которые в настоящее время доступны в цепочке поставок NHS.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое изображение модели мочевого пузыря in vitro показано на рисунке 1. Модели мочевого пузыря in vitro спроектированы таким образом, чтобы быть совместимыми со стандартными катетерами Фолея (размеры, показанные на рисунке 1 , совместимы со стандартными французскими катетерами 14 размера). Стерилизуйте все модели мочевого пузыря in vitro и зажмите все используемые силиконовые трубки в контуре фильтрующего материала перед использованием. Строгое соблюдение асептической техники требуется на протяжении всей настройки моделей in vitro , и рекомендуется собирать модель в стерильных условиях (т.е. в шкафу микробиологической безопасности категории II или в колпаке с ламинарным потоком). Для определения статистической значимости экспериментов на моделировании мочевого пузыря in vitro рекомендуется минимум n = 5 повторений. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление искусственных мочевых сред

ПРИМЕЧАНИЕ: Искусственная среда для мочи (AUM) рекомендуется для использования в моделях мочевого пузыря in vitro из-за больших объемов среды, необходимой для экспериментов, и вариабельности, связанной с образцами мочи человека. Этот протокол подробно описывает подготовку AUM, как описано ранее и оптимизировано для использования в модели мочевого пузыря in vitro Nzakizwanayo et al. (5 л итогового объема) 43,45,46,48,53,54.

  1. Приготовление раствора AUM 1
    1. Взвесьте следующие соединения и добавьте в 1 л боросиликатный флакон, наполненный 850 мл деионизированной воды: 3,25 г гексагидрата хлорида магния (MgCl2,6H 2O), 23 г хлорида натрия (NaCl), 11,5 г безводного сульфата натрия (Na2SO4), 3,25 г цитрата тринатрия (Na3C6H5O7), 0,1 г оксалата натрия (Na2C2O4), 14 г монокалийфосфата (KH2PO4), 8 г хлорида калия (KCl), 5 г хлорида аммония (NH4Cl), 25 г желатина и 5 г триптонного соевого бульона.
  2. Перемешивая раствор AUM, измерьте pH с помощью pH-метра и отрегулируйте его до 5,75 (± 0,02), добавив 3 M NaOH или HCl в зависимости от ситуации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NaOH/HCl для корректировки pH следует добавлять в AUM по каплям, чтобы предотвратить осаждение солей из раствора.
  3. После корректировки pH AUM долейте раствор до конечного объема 1 л деионизированной водой и простерилизуйте в автоклаве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После стерилизации раствор можно хранить до трех месяцев при комнатной температуре (раствор AUM 1 следует выбросить, если наблюдаются осадки или помутнение).
  4. Отдельно готовят раствор АУМ 2, добавив в стерильный стакан объемом 500 мл 125 г мочевины (CH4N2O) и 2,45 г хлорида кальция (CaCl2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление раствора мочевины кальция 2 приводит к эндотермической реакции, поэтому рекомендуется перемешивать раствор AUM 2 и нагревать его до ~ 50 °C на горячей пластине/магнитной мешалке, пока соединения растворяются для предотвращения замерзания.
  5. После того как мочевина и хлорид кальция растворятся, фильтрующий раствор 2 с помощью вакуумного насоса и фильтрующих установок с содержанием нитроцеллюлозы 0,45 мкМ в стерильную стеклянную бутылку объемом 500 мл. После стерилизации раствор 2 стабилен в течение трех месяцев при 4 °C или одного месяца при комнатной температуре
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор AUM 2 следует выбросить, если наблюдаются осадки или помутнение.
  6. В колпаке с ламинарным потоком или микробиологическом шкафу безопасности категории II асептически смешайте растворы AUM 1 и 2 с 3,6 л стерильной деионизированной воды в стерильном стеклянном флаконе с аспиратором объемом 5 л. AUM должен быть бледно-желтого цвета и прозрачным.
  7. С помощью серологической пипетки извлеките 50 мл из общего объема AUM и аликвоту в центрифужную пробирку объемом 50 мл и оставьте для последующего использования.
  8. Закупорьте флакон с аспиратором с помощью резинового накидки или алюминиевой фольги и оставьте при комнатной температуре до тех пор, пока не будут собраны модели in vitro .
  9. Асептически удалите 10 мл AUM из 50 мл аликвоты и оставьте оставшийся раствор для приготовления посевного материала. С помощью рН-метра измерьте рН аликвоты 10 мл AUM, которая должна составлять ~pH 6,1 (±0,2). Подготовленный AUM стабилен при комнатной температуре в течение примерно одного месяца, и его следует выбросить, если выпадут осадки или помутнеет.

2. Настройка модели мочевого пузыря in vitro

  1. Вставьте катетер Фолея в центральную стеклянную камеру модели мочевого пузыря in vitro (схема подробно описана на рисунке 1). Закрепите катетер на месте, надув баллон с помощью прилагаемого шприца со стерильной водой, и прикрепите мешок для отходов к порту катетера.
  2. Подсоедините устройство45 модели мочевого пузыря in vitro к резервуару AUM с помощью соединительной трубки. Подсоедините трубки контура фильтрующего материала к перистальтическому насосу в соответствии с инструкциями производителя, убедившись, что трубка имеет достаточное натяжение без растяжения.
  3. Прикрепите модели камер in vitro к зажимным подставкам и закрепите мешки для мусора на подставках под моделями, чтобы обеспечить проход через модели под действием силы тяжести.
  4. Соедините внешнюю камеру модели мочевого пузыря с циркуляционной водяной баней с помощью силиконовой трубки (рис. 1B). Установите водяную баню на нагрев до 37 °C и включите циркуляционные насосы бака.
    1. Запустите водяные бани в течение 30 минут перед инокуляцией моделей мочевого пузыря in vitro, чтобы убедиться, что температура стабильна на уровне 37 °C, и убедитесь, что водяная баня остается наполненной до соответствующего уровня воды в течение всего эксперимента.
  5. Снимите все зажимы с трубок для фильтрующего материала и настройте перистальтические насосы на работу со скоростью примерно 0,75 мл/мин, чтобы воспроизвести выработку мочи у человека (~1080 мл/день). Фактический расход будет рассчитан во время эксперимента.
  6. Пропустите AUM через модели мочевого пузыря in vitro с помощью перистальтического насоса в течение 30 минут до посева, чтобы убедиться, что поток среды имеет постоянную скорость и что стерильная дренажная система не повреждена.
  7. Перед экспериментом слейте все скопившиеся среды из мешка для мусора. Объем среды можно измерить для расчета точной скорости потока (подробно описано в шаге 4).

3. Посев моделей мочевого пузыря in vitro

  1. Подготовьте в течение ночи культуры для моделей мочевого пузыря in vitro , суспензив полную петлю бактериальных колоний, выращенных на твердом агаре, в 10 мл LB-бульона. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с перемешиванием.
    Модель мочевого пузыря in vitro может быть использована для изучения различных патогенов CAUTI, включая уреаза-положительные штаммы, такие как Proteus mirabilis, и используемые питательные среды могут быть соответствующим образом модифицированы.
  2. Центрифугируйте весь объем ночной культуры при температуре 4500 x g в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл AUM и измерьте поглощение на наружном диаметре595 нм с помощью спектрометра.
  3. Нормализуют ресуспендированные культуры до наружного диаметра595 нм 1,0 и конечного объема 10 мл в AUM, используя следующее уравнение:
    figure-protocol-1
    где A1 – абсорбция при наружном диаметре600 нм посева за ночь, A2 – желаемая абсорбция при наружном диаметре600 нм посева (1,0), V2 – желаемый объем посева за ночь (10 мл) и V1 – требуемый объем культуры за ночь для нормализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мл суспензии с наружным диаметром595 нм 1.0 гарантируют, что модели будут инокулированы примерно10-10 КОЕ большинства штаммов бактерий (валидировано для Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus), реплицирующих установленную инфекцию. Исходный инокулюм может быть модифицирован в зависимости от используемого вида или моделируемой стадии инфекции (т.е. для моделирования инфекции на ранней стадии можно использовать более низкую плотность инокулюма)47.
  4. Стерилизуйте модели мочевых пузырей in vitro с использованием этанола с содержанием этанола 70% и снимите пробку (впускное отверстие для среды), чтобы обеспечить доступ к внутренней камере. Удалите 10 мл AUM из объема внутри модели мочевого пузыря с помощью серологической пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При инокуляции и отборе проб моделей in vitro из центральной камеры убедитесь, что работа проходит быстро и асептично, всегда надевайте соответствующие СИЗ и регулярно обеззараживайте перчатки и поверхности 70% этанолом.
  5. Инокулируйте модели мочевого пузыря in vitro через центральную камеру с использованием всей нормализованной суспензии 10 мл и тщательно перемешайте с помощью серологической пипетки. Удалите 10 мл из центральной камеры моделей мочевого пузыря in vitro с помощью серологической пипетки и добавьте аликвоту в универсал объемом 15 мл для последующих расчетов КОЕ/мл и измерения pH.
  6. Тщательно обеззаражьте внешние поверхности модели мочевого пузыря и обмотки 70% этанолом, а также установите на место пробку. Кратковременно возобновите подачу среды, чтобы убедиться, что уровень неуправляемости в центральной камере достигает отверстия для глаз, прежде чем остановить поток.
  7. Дайте культурам закрепиться в модели мочевого пузыря в течение 1 ч перед включением потока среды с помощью перистальтического насоса со скоростью ~0,75 мл/мин.
  8. Пока посевной материал укореняется, приготовьте разведения из образца, взятого из центральной камеры.
    1. Последовательно разведите 100 мкл образца в 900 мкл стерильного PBS до тех пор, пока образец не разбавится до 10-7. Отсортируйте 10 мкл пятен разведений в трех экземплярах на соответствующих твердых средах и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
    2. После инкубации подсчитайте колонии на каждой пластине разведения и рассчитайте точное количество КОЕ/мл исходного инокулята.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании видов, которые роятся, т.е. Proteus mirabilis, используйте агар Мак-Конки без соли (пептон 20,0 г/л, лактоза 10,0 г/л, желчные соли 5,0 г/л, нейтральный красный 0,075 г/л и агар 12,0 г/л), чтобы убедиться, что отдельные колонии все еще видны для удобства подсчета.
  9. После 1 ч инкубации включите поток среды с помощью перистальтического насоса, чтобы начать работу моделей мочевого пузыря in vitro , отмечая время включения моделей.

4. Расчет скорости потока мочевого пузыря in vitro

  1. После того, как модели in vitro были инокулированы и запущен поток среды, дайте моделям поработать в течение 4 часов. Кратковременно приостановите поток фильтрующего материала и соберите весь объем остаточного AUM из мешка для отходов в мерную колбу через дренажное отверстие. Обратите внимание на собранный объем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока может быть рассчитана на основе объема среды, собранной на шаге 2.7., однако более точные скорости потока могут быть получены путем более длительной работы моделей (т.е. рекомендуется 4 часа), поскольку это снижает вероятность того, что остаточный воздух в трубках контура фильтрующего материала повлияет на расчетный расход.
  2. Возобновите поток фильтрующего материала с помощью перистальтического насоса, убедившись, что дренажное отверстие мешка для отходов закрыто, чтобы поддерживать стерильность дренажной системы.
  3. Чтобы рассчитать фактическую скорость потока в моделях in vitro , используйте следующее уравнение:
    figure-protocol-2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока в диапазоне 0,55-1,0 мл/мин рекомендуется для воспроизведения выработки мочи у человека.
  4. Если расход фильтрующего материала рассчитывается за пределами допустимого диапазона, откажитесь от репликатора и отрегулируйте частоту вращения перистальтического насоса так, чтобы она соответствовала допустимому диапазону.

5. Забор планктонных клеток из модели мочевого пузыря in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Модели мочевого пузыря in vitro должны регулярно отбираться на протяжении всего эксперимента для мониторинга динамики популяции. Все модели должны быть отобраны сразу после инокуляции, в точке активации потока AUM, через 4 ч после инокуляции (когда рассчитана скорость потока) и в точке, где модели прекращаются (либо блокировка, либо заранее определенная конечная точка). При работе моделей в течение >24 ч рекомендуется отбирать пробы каждые 24 ч для контроля КОЕ/мл, а дополнительные пробы могут быть взяты по мере необходимости пользователей.

  1. Обеззаритите пробку модели мочевого пузыря 70% этанолом и снимите ее, чтобы получить доступ к центральной камере.
  2. Избегая наконечника катетера и баллона, аккуратно перемешайте содержимое центральной камеры с помощью серологической пипетки.
  3. С помощью серологической пипетки извлеките из камеры образец объемом 10 мл и переложите его в стерильную пробирку. Немедленно обеззаритите пробку 70% этанолом и замените, завершив стерильный, замкнутый, дренажный контур.
  4. Извлеките 1 мл из образца с помощью пипетки и передайте его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для серийного разведения.
  5. Измерьте pH оставшегося образца с помощью pH-метра, убедившись, что образец тщательно перемешан, а pH-метр откалиброван перед использованием.
  6. Последовательно разбавляйте зарезервированный 1 мл аликвоты из образца и наносите его в соответствующую твердую среду, как описано ранее на шаге 3.8, отбрасывая все разведения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Планктонные образцы, взятые из модели мочевого пузыря, подходят для других анализов, включая приложения в области геномной или молекулярной биологии (необязательно).

6. Отбор биопленочных клеток из модели мочевого пузыря in vitro

  1. Удаление катетера и подготовка его
    ПРИМЕЧАНИЕ: Забор биопленки моделей мочевого пузыря in vitro является анализом конечной точки, требующим деактивации моделей и удаления катетеров для обработки.
    1. Отсоедините мешок для отходов от катета и слейте остатки мочи из модели, спустив баллон. Извлеките катетер из нижней части модели с помощью стерильных щипцов.
    2. Поместите удаленный катетер на стерильную доску и с помощью стерильного скальпеля разрежьте катетер в точках, необходимых для разрезания (показано на рисунке 2).
    3. Убедитесь, что секции катетера разрезаны вдоль, чтобы обнажить просвет; Затем с помощью стерильных щипцов 3 раза опустите секцию катетера в стерильный PBS для удаления неадгезивных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации секций катетера ниже по потоку, т.е. с помощью SEM, оставьте секции 1 см нетронутыми (не разрезайте вдоль) и вместо этого удалите лишнюю влагу из просвета стерильным бумажным полотенцем перед фиксацией.
  2. Разрушение биопленки при подсчете КОЕ/мл
    Примечание: Протоколы, подробно описывающие разрушение биопленочных клеток, могут потребовать дальнейшей оптимизации, если биопленки являются в значительной степени кристаллическими или мукоидными.
    1. Подготовленный участок катетера инкубировать в 0,25% трипсине при 37 °С в течение 30 мин. Используемый объем трипсина должен быть минимально необходимым для покрытия катетера; Например, для разреза катетера длиной 1 см перпендикулярно достаточно 1 мл 0,25% трипсина.
    2. После инкубации раствор, содержащий катетер, обрабатывают ультразвуком в течение 10 минут. Затем секция катетера может быть удалена и выброшена. Чтобы деактивировать трипсин, клеточный раствор следует немедленно развести в стерильном PBS и вывести из него количество КОЕ на соответствующих твердых средах, как описано ранее в шаге 3.8.
  3. Количественное определение биопленки катетера с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом
    1. Добавьте подготовленные секции катетера в лунки в лунку подходящего размера с плоским дном. Используйте соответствующий объем 0,1% кристаллического фиолетового раствора для полного погружения секции катетера и статически инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Убедитесь, что стерильная секция катетера также включена в качестве фонового контроля.
    2. Снимите секции катетера с пластины и переложите на новую пластину. Дважды промойте каждую секцию катетера в дистиллированной воде.
    3. После промывки перенесите секции катетера на новую пластину, и покройте 33% уксусной кислотой. Выдерживать 15 минут при комнатной температуре.
    4. Извлеките секцию катетера из пластины, а затем с помощью считывателя планшетов измерьте внешний диаметр595 нм для каждой реплики, используя лунки, в которых находились стерильные секции катетера в качестве фонового контроля.

7. Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам в модели мочевого пузыря in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство терапевтических средств, направленных на контроль катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей, совместимы со стандартными катетерами Фолея, проверьте совместимость перед началом экспериментов с моделью мочевого пузыря in vitro .

  1. Антимикробные лубрикантные гели
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы смоделировать использование смазывающих веществ при введении катетера, этот этап следует выполнять на этапе 2.1, непосредственно перед введением катетера Фолея. После введения катетера модель должна быть немедленно подсоединена, и шаг 2.6. Его следует исключить, чтобы гель не разбавлялся и не сливался перед инокуляцией. Инокуляция должна быть проведена в тот же день, что и введение катетера. Смазывающие вещества, предназначенные для использования с катетерами, упаковываются в виде индивидуальных, стерильных, одноразовых шприцев объемом 6 мл или 11 мл. Примерно 5 мл смазки достаточно, чтобы заполнить как горловину модели мочевого пузыря, так и покрыть основание модели.
    1. Используя асептическую технику, вставьте конец шприца, содержащего смазывающее средство, в горловину модели мочевого пузыря, и введите 5 мл геля, чтобы заполнить горловину и войти в основание камеры.
    2. Поверните модель так, чтобы основание было равномерно покрыто гелем, затем вставьте в модель катетер Фолея, протолкнув кончик катетера через гель, и закрепите, заполнив баллон как обычно.
    3. Подключите модель к остальной части установки, затем заполните просвет модели мочой до тех пор, пока она не начнет стекать. Как только моча начнет стекать через отверстие для глаз катетера, остановите насос, чтобы предотвратить потерю геля перед посевом.
      1. Инкубируйте модели в течение 30 минут, чтобы моча достигла 37 °C, затем инокулируйте модели, как описано ранее, чтобы обеспечить равномерность времени диффузии гелевых компонентов в объем мочи.
    4. Привите модель, как описано в шаге 3.5, и дайте ей инкубироваться в течение 1 часа перед включением перистальтических насосов. В момент включения насоса возьмите образец планктона объемом 1 мл и отфильтруйте его для определения количества КОЕ, как описано в шаге 3.8.
  2. Решения для орошения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ирригационные растворы часто доступны оптом или в виде отдельных, стерильных, одноразовых «пакетов». Если вы используете индивидуальные решения, перед экспериментом убедитесь, что они совместимы с дренажными портами катетеров, которые будут использоваться. При использовании объемных ирригационных растворов убедитесь, что используются трехпросветные катетеры, а также следуйте инструкциям производителя для определения объема/временных рамок введения продукта.
    1. Перед лечением проведите модели in vitro в течение не менее 4 часов, чтобы убедиться, что у сообществ, связанных с биопленкой, было достаточно времени для формирования. После того, как модели проработают 4 часа, приостановите поток среды и возьмите образец предварительной обработки из внутренней камеры моделей in vitro , как описано в шаге 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете растворы для орошения в больших объемах, перейдите к шагу 7.2.5.
    2. Если вы используете индивидуальный «мешочек» для ирригации, отсоедините мешок для отходов от катетера и используйте колпачок, прилагаемый к мешку, чтобы запечатать пакет для отходов. Немедленно приложите мешочек для ирригационного раствора к катетеру, и с помощью легкого надавливания выдавите изделие в центральный просвет. Нанесите в соответствии с инструкциями производителя (т.е. 15 минут нанесения).
    3. После завершения рекомендованного лечения дайте остаточному раствору стечь из внутренней камеры через отверстие для проушины катетера в мешок для ирригации, затем отсоедините мешочек. Оставшееся содержимое пакета может быть выброшено или использовано для дальнейшего применения.
    4. Простерилизуйте дренажный порт катетера и порт подключения мешка для отходов 70% этанолом и снова соедините их, завершив стерильную закрытую дренажную систему.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете мешочки для полива, перейдите к шагу 7.2.7.
    5. При использовании трехпросветного катетера продезинфицируйте отверстие для ирригации 70% этанолом и немедленно начните орошение стерильным шприцем в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте объем остаточной мочи в мешке для отходов перед орошением, чтобы его можно было учесть при расчете времени засорения или расхода на последующих этапах.
    6. После завершения орошения выбросьте шприц и остатки ирригационного раствора, оставшиеся в мешке для отходов.
    7. Возьмите образец после лечения из центральной камеры модели мочевого пузыря in vitro , как описано в шаге 5, и возобновите поток AUM через перистальтический насос для продолжения эксперимента.

8. Прекращение экспериментов с моделью мочевого пузыря in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Уреаза-положительные организмы, такие как P. mirabilis, могут вызывать закупорку мочевых катетеров путем образования кристаллической биопленки. Таким образом, закупорка может быть использована в качестве биологически значимой конечной точки для моделей мочевого пузыря in vitro и визуально идентифицируется по полной окклюзии отверстий в глазах катетера кристаллическими биопленками и увеличению объема AUM в центральной камере стеклянного «мочевого пузыря» (Рисунок 3).

  1. После того, как модели мочевого пузыря in vitro достигнут заданной конечной точки, которая может быть закупоркой или определенным временем работы, отключите поток AUM с помощью перистальтического насоса и возьмите пробу конечной точки из центральной камеры, как описано на шаге 5.
  2. Выключите поток водяной бани и отсоедините контур среды и трубку контура водяной бани от моделей мочевых пузырей in vitro .
  3. Снимите пробки с моделей мочевого пузыря in vitro и удалите весь объем остаточной мочи с помощью серологической пипетки. Выбросьте загрязненные среды надлежащим образом (например, стерилизуйте автоклавом).
  4. Слейте воду из мешков для мусора и выбросьте остатки среды. Отсоедините пакеты для отходов катетера от порта катетера и выбросьте их.
  5. С помощью шприца медленно сдувайте баллоны с катетером перед удалением катетеров с моделей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании уреазоположительных видов бактерий катетеры могут «прилипнуть» к стеклянным стенкам моделей in vitro . Избегайте приложения большой силы к катетерам и вместо этого перейдите к шагу 8.6.
  6. Замочите модели in vitro в 5% антимикробном очищающем растворе (см. Таблицу материалов) на ночь, затем тщательно промойте водой, чтобы удалить остатки дезинфицирующего средства. Автоклав для стерилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании уреазоположительных соединений добавьте 5% лимонной кислоты в дезинфицирующий раствор, чтобы растворить любую биоминерализацию в центральной камере. Этот кислотный раствор также поможет освободить любые катетеры, которые прилипли к моделям, разрушая кристаллические отложения биопленки.
  7. Отсоедините трубки цепи фильтрующего материала от резервуара AUM и выбросьте остатки среды. Промойте трубки водой, чтобы удалить остатки AUM и автоклава.
  8. Чтобы рассчитать точное время засорения, запишите конечный объем в мешке для мусора и используйте уравнение на шаге 4.4 и ранее рассчитанный расход для определения времени засорения.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешная эксплуатация модели мочевого пузыря in vitro зависит от применения хорошей асептической техники и тщательного наблюдения за мутностью среды на протяжении всего эксперимента (Рисунок 3). До инокуляции стерильный AUM был бледно-желтого цвета и прозрачным в центральной камере модели мочевого пузыря in vitro (рисунок 3A). AUM в резервуаре с фильтрующим материалом должен оставаться прозрачным на протяжении всего эксперимента, так как любые изменения мутности, которые происходят, могут указывать на выпадение солей из раствора или загрязнение среды. Если AUM в резервуаре фильтрующего материала или трубке контура фильтрующего материала мутнеет или показывает резкое изменение цвета, повторы следует отбросить и повторить. После инокуляции отчетливо видно увеличение мутности AUM в центральной камере модели мочевого пузыря in vitro (рисунок 3В). Изменения мутности часто более выражены у уреазоположительных организмов, таких как P. mirabilis, но все еще должны быть заметны после инокуляции у уреазоотрицательных организмов. После запуска потока AUM часто наблюдается снижение мутности AUM по мере вымывания планктонных клеток, что не указывает на отсутствие жизнеспособных клеток в модели. Наблюдение за уровнем среды в центральной камере также может быть использовано для определения времени закупорки при использовании уреазоположительных микроорганизмов (Рисунок 3C). Во время работы моделей отверстие и наконечник катетера должны быть полностью видны, чтобы указывать на надлежащий дренаж в мешки для отходов. После закупорки уровень AUM в центральной камере поднимется над отверстиями и наконечником катетера, что указывает на то, что эксперимент готов к любым показаниям и завершению исследования. Во время экспериментов эффекты давления в контуре среды модели мочевого пузыря in vitro могут привести к тому, что модели будут казаться заблокированными. Если есть подозрение на закупорку, перед окончанием анализа убедитесь, что контур AUM, катетер и трубка мешка для отходов натянуты, так как любые потенциальные пузырьки воздуха или перегибы в трубке могут вызвать «воздушные пробки» и помешать дренажу катетера.

Во время экспериментов с моделью мочевого пузыря in vitro отбор проб планктона может дать ценную информацию о динамике роста в модели, а также о прогрессировании CAUTI. Рост клеток, рН и образование биопленки можно контролировать на протяжении всего эксперимента без необходимости прекращения моделирования (рис. 4). При использовании уреазоположительных организмов расчеты времени закупорки могут быть использованы в качестве меры скорости образования биопленки и использованы для сравнения свойств различных штаммов бактерий (рис. 4). Сравнение штамма P. mirabilis дикого типа и мутанта ЛПС (введение mini-tn5 в waaC) показало увеличение времени блокировки и, таким образом, снижение образования биопленки у мутанта (рис. 4). Уреазоотрицательные организмы обычно не блокируют модели мочевого пузыря in vitro , поэтому рекомендуется определить установленную конечную точку до начала экспериментов. В некоторых случаях уреазоотрицательные микроорганизмы могут привести к закупорке катетера. Например, уреазоотрицательные штаммы Klebsiella pneumoniae могут продуцировать обширные мукоидные биопленки, однако для блокирования дренажа им обычно требуется гораздо больше времени, чем уреазоположительным биопленкам, поэтому все же рекомендуется установить конечную точку.

Измерение pH во время экспериментов с моделью мочевого пузыря также может дать представление о различиях между штаммами, а также о прогрессе CAUTI. Если используются уреазоотрицательные организмы, pH в центральной камере модели мочевого пузыря in vitro должен оставаться в основном стабильным на протяжении всего эксперимента, хотя ожидаются небольшие колебания pH по мере изменения динамики популяции в ходе эксперимента. Инокуляция моделей in vitro уреазоположительными микроорганизмами приводит к значительному увеличению pH с течением времени, при этом самый высокий pH обычно наблюдается во время блокировки, где могут наблюдаться показатели pH до ~8-9 (Рисунок 4B).

Подсчет планктонных КОЕ/мл является важным компонентом моделирования мочевого пузыря in vitro, позволяя операторам оценивать, была ли инокуляция успешной, и контролировать ход экспериментов. Измерение КОЕ/мл в конце эксперимента может выявить любые различия в колонизации мочевого пузыря между различными штаммами бактерий. При сравнении мутантного штамма P. mirabilis mini-Tn5 с диким типом наблюдалось значительное снижение КОЕ/мл в момент закупорки (рис. 4C). Кроме того, подсчет КОЕ из биопленок на поверхности катетера и количественная оценка биомассы биопленки могут дать представление о способности различных патогенов колонизировать катетеризированные мочевыводящие пути. Для определения различий в образовании биопленки между штаммом HI4320 дикого типа P. mirabilis и изолятами, пассажированными в хлоргексидине использовали кристаллические фиолетовые красители (рис. 5). Измерения оптической плотности при длине волны 595 нм показали, что изоляты, пассажированные в хлоргексидине, демонстрируют снижение образования биопленки по сравнению с диким типом и контролем, пассажированными в отсутствие хлоргексидина.

Поскольку целью модели мочевого пузыря in vitro является точное воспроизведение ниши CAUTI, модели также могут быть использованы для изучения эффектов антимикробной терапии, направленной на лечение CAUTI в клинически значимых условиях. Для уреазоположительных организмов сравнение времени закупорки обработанных моделей с необработанными моделями может дать полезную информацию об эффективности лечения. Обработка моделей мочевого пузыря in vitro , инокулированных P. mirabilis 0,02% раствором хлоргексидина для орошения мочевого пузыря, значительно увеличивала время закупорки по сравнению с моделями, которые не лечились или обрабатывали 0,9% физиологическим раствором (рис. 6A). Кроме того, модель мочевого пузыря in vitro может быть использована для изучения бактерицидной активности антимикробных препаратов. Мониторинг изменений КОЕ/мл планктонных и биопленочных клеток после антимикробной обработки может указывать на эффективность лечения. Обработка моделей мочевого пузыря in vitro , инокулированных P. mirabilis , продемонстрировала снижение планктонных КОЕ/мл на >7 log сразу после обработки по сравнению с моделями, не обработанными и орошаемыми физиологическим раствором 0,9% при применении в соответствии с инструкциями производителя (рис. 6B).

figure-results-1
Рисунок 1: Схема основных компонентов модели мочевого пузыря in vitro . (A) Модель мочевого пузыря (закрытая дренажная система): (1) стеклянная камера с двойными стенками, имитирующая мочевой пузырь (2) вход среды, AU подается через перистальтический насос во внутреннюю камеру модели мочевого пузыря (3) вход воды подается через циркуляционную водяную баню во внешнюю камеру (4) выход воды (5) катетер Фолея, вставленный во внутреннюю камеру (6) точка подключения дренажного просвета; Точка подключения мешка для мусора/мешков для ирригации (7) Дренажный мешок для сбора мочи. (B) Схема, изображающая настройку модели мочевого пузыря in vitro и направление потока сред и воды через модель. Искусственная моча хранится в резервуаре для среды (1) при комнатной температуре и подается в модель с помощью перистальтического насоса (2) с постоянной скоростью потока ~ 0,75 мл мин-1 в течение всего эксперимента. Среда поступает в центральную камеру стеклянного сосуда с двойными стенками, представляющего собой мочевой пузырь (3), и вытекает через отверстие в глаз катетера Фолея (4) в дренажный мешок (5), завершая стерильную закрытую дренажную систему. Модель мочевого пузыря in vitro поддерживается при постоянной температуре 37 °C с помощью циркуляционной водяной бани (6), которая протекает через внешнюю камеру стеклянного сосуда с двойными стенками. Пунктирные линии обозначают силиконовые трубки, а стрелки — направление потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Срез мочевых катетеров для обработки биопленочных клеток. Примеры точек на мочевом катетере для вскрытия для количественного определения биопленки после входа. (A) Катетеры сначала разрезаются широтно в области 8 см проксимальнее кончика/глазных отверстий (где наблюдается наибольшее образование биопленки). Срезы размером 1 см удаляют скальпелем, как правило, избегая области, содержащей спущенный баллон катетера, из-за трудностей в воспроизводимости обработки (1-3). (B) После того, как катетеры первоначально разрезаны на части по 1 см, по центральному просвету делается еще один продольный разрез, чтобы обнажить любую присутствующую биопленку для дальнейшего количественного определения биопленки, т.е. подсчета КОЕ/мл окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом. Пунктирными линиями обозначены точки рассечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Этапы эксперимента с моделью мочевого пузыря in vitro . Изображения центральной камеры модели мочевого пузыря in vitro на разных стадиях экспериментов. (A) AUM в центральной камере модели мочевого пузыря in vitro до инокуляции. Среда в центральной камере полностью прозрачна, что указывает на успешную стерилизацию, а кончик катетера и отверстия для глаз видны над линией загрязнения, что указывает на успешное дренирование катетера. (B) Среда в центральной камере модели мочевого пузыря in vitro после инокуляции P. mirabilis (через 4 ч после инокуляции). Об успешном проведении инокуляции свидетельствует повышенное помутнение среды. Видимость кончика катетера и отверстий для глазков указывает на то, что AUM успешно дренируется через катетер, и закупорка не произошла. (C) Пример модели заблокированного мочевого пузыря in vitro . Инокуляция P. mirabilis и последующее образование биопленки и минерализация привели к закупорке глазных отверстий катетера, что препятствует дренажу и приводит к повышению уровня среды в центральной камере над кончиком катетера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Конечные измерения для модели мочевого пузыря in vitro выполняются до момента закупорки. Примеры измерений конечных точек в момент закупорки на модели мочевого пузыря in vitro , инокулированной клиническим штаммом P. mirabilis, RS47 (WT), и мутантным штаммом с ослабленным образованием биопленки, RS47-2 (Mutant). (A) Время блокировки (h) WT и мутантных штаммов P. mirabilis. (B) pH моделей мочевого пузыря in vitro на момент закупорки. (C) КОЕ/мл планктонных клеток в модельной камере мочевого пузыря in vitro в момент закупорки. Все данные представляют собой среднее значение пяти биологических репликатов. Полосы погрешностей показывают стандартную погрешность среднего значения (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Эта цифра была изменена по Clarke et al.46. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Измерения клеток, ассоциированных с биопленкой, из модели мочевого пузыря in vitro . Количественная оценка образования биопленки P. mirabilis , сравнение штамма дикого типа HI4320 с адаптированными популяциями, пассаженными с хлоргексидином (ИБС) или без него, с помощью кристаллического фиолетового окрашивания и измерение оптической плотности (OD) при длине волны 595 нм. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: контроль прохода без воздействия ИБС; 2, 4, 6: HI4320 пассируется в 4 мкг/мл ИБС. Все данные представляют собой среднее значение пяти биологических репликатов. Полосы погрешностей показывают SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Измерения на моделях мочевого пузыря in vitro после антимикробной обработки. Планктонные образцы отбирали у модели мочевого пузыря in vitro , инокулированной P. mirabilis, после орошения 0,02% раствором хлоргексидина противомикробного раствора (100 мл) или 0,9% физиологическим раствором контроля. (A) Время закупорки моделей мочевого пузыря in vitro после орошения. (B) Планктонные КОЕ/мл сразу после орошения. Все данные представляют собой среднее значение пяти биологических репликатов. Полосы погрешностей показывают SEM. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Катетеризированные мочевыводящие пути представляют собой сложную биологическую нишу, которую может быть сложно воспроизвести в лабораторных условиях. Модель мочевого пузыря in vitro была разработана с целью моделирования CAUTI и использует стандартные мочевые катетеры для воспроизведения стерильной, закрытой дренажной системы, используемой в клинической практике. Катетеризированные мочевыводящие пути очень восприимчивы к инфекции, о чем свидетельствует тот факт, что мочевые катетеры являются самым большим фактором риска развития CAUTI 6,55. Соответственно, тщательная асептическая техника имеет решающее значение для успеха моделей мочевого пузыря in vitro. Мутность AUM является явным показателем стерильности, так как загрязненная или просроченная среда со временем становится мутной, что требует утилизации всех реплик. Тщательный асептический метод также следует использовать при посеве и отборе проб модели мочевого пузыря in vitro, так как открытие центральной камеры для добавления приготовленного инокулюма нарушает стерильную, закрытую дренажную систему, что делает модель мочевого пузыря in vitro восприимчивой к загрязнению. Чтобы избежать загрязнения центральной камеры, для отбора проб популяции планктонных клеток можно использовать трехпросветные катетеры (путем перекрытия отработанного просвета и дренирования через дополнительный просвет). Некоторое вымывание ожидается в течение 4 часов, но может потребоваться устранение неполадок, если на данный момент не перечислены жизнеспособные планктонные клетки. Если через 4 ч жизнеспособные клетки не будут подсчитаны, может потребоваться оптимизация плотности посевного материала или используемого состава AUM для лучшей поддержки бактериальной колонизации. Кроме того, вымывание инокулята может указывать на проблему с контуром среды; Изломы внутри трубки могут препятствовать адекватному дренажу, что приведет к накоплению токсичных метаболитов, которые могут препятствовать росту бактерий, в то время как любое остаточное дезинфицирующее средство, используемое для промывки через трубки со средой, может иметь бактерицидный эффект.

В этом протоколе подробно описан препарат AUM, как ранее было описано Nzakizwanayo et al., поскольку ранее он был валидирован для использования в модели мочевого пузыря in vitro с известными патогенами CAUTI, включая Proteus mirabilis и Escherichia coli 43,45,46,48 . Тем не менее, существуют возможности для модификации состава AUM, используемого в протоколе, для отбора с учетом роста других патогенов. Были опубликованы многочисленные разнообразные составы AUM, которые могут быть использованы в среде 28,56,57,58,59,60. Кроме того, AUM в резервуаре среды может быть дополнен питательными веществами или антибиотиками для отбора в зависимости от роста конкретных патогенов. Исторически сложилось так, что модели мочевого пузыря in vitro также поставлялись с объединенной человеческой мочой, однако большие объемы среды, необходимые для запуска воспроизведения модели мочевого пузыря in vitro, могут сделать сбор человеческих образцов нецелесообразным53,54. Кроме того, состав человеческой мочи может сильно различаться в разных образцах пациентов, что влияет на воспроизводимость эксперимента, поскольку различия в концентрации гормонов, солей и белков, а также в статусе гидратации, как было показано, влияют на рост бактерий и образование биопленки 38,39,61,62.

В приведенном выше протоколе подробно описана инокуляция модели мочевого пузыря in vitro с ~10 10 КОЕ/мл, реплицирующейся на поздней стадии CAUTI. Тем не менее, место инокуляции модели мочевого пузыря in vitro может быть изменено в будущих анализах, чтобы лучше воспроизвести более ранние стадии CAUTI, т.е. первоначальную колонизацию мочевого катетера и восхождение в мочевой пузырь. Ручное загрязнение катетеров Фолея известным бактериальным инокулюмом до создания моделей in vitro может дать представление о ранних стадиях CAUTI. Действительно, плотность инокулюма была изменена в предыдущей работе для репликации инфекции на более ранней стадии; например, Nzakizwanayo et al. инокулированные модели мочевого пузыря in vitro с более низким начальным значением КОЕ/мл (ок. 103 КОЕ/мл) для репликации инфекции на более ранней стадии47. Однако стоит отметить, что изменение плотности инокулюма может привести к увеличению времени закупорки и требует дополнительной проверки перед экспериментом.

Кроме того, в то время как в протоколе подробно описана инокуляция модели in vitro монокультурой бактерий, существуют возможности для инокуляции моделей грибковыми патогенами. Прошлые работы показали, что до 8% CAUTI являются результатом инфекции Candida spp., которые способны образовывать биопленки, которые часто не поддаются противогрибковому лечению27,63. Кроме того, модель мочевого пузыря in vitro может быть модифицирована для изучения полимикробных CAUTI. Действительно, было высказано предположение, что до 86% CAUTI являются полимикробными, и эти инфекции часто связаны с более тяжелыми симптомами и более высоким уровнем смертности, чем моновидовые инфекции 27,64,65,69. Модели in vitro могут быть инокулированы несколькими видами для изучения образования полимикробных биопленок и прогрессирования CAUTI, но перед инокуляцией следует провести тщательную валидацию полимикробных сообществ и модификацию плотности инокулята. В предыдущих исследованиях использовалась модель мочевого пузыря in vitro для мониторинга различий в образовании биопленки у одного вида P. mirabilis CAUTI по сравнению с двойным видом CAUTI с E. faecalis, что подчеркивало метаболическое взаимодействие между штаммами, что приводило к усилению образования биопленки по сравнению с инфекцией одного вида70.

Основным преимуществом использования модели мочевого пузыря in vitro для изучения CAUTI является возможность наблюдать за образованием биопленки на поверхности стандартного мочевого катетера. Образование биопленок в CAUTI часто инициируется образованием кондиционирующих пленок на просвете катетера, состоящих из органических компонентов мочи, к которым могут прилипать уропатогены, до пролиферации и образования зрелых биопленок 2,18,71,72,73. Стандартные анализы, используемые для изучения образования биопленки, часто используют стандартные бактериальные питательные среды, а не AUM, и часто основаны на приверженности полистирольным микропланшетам или колышкам, т.е. устройству Калгари; тем не менее, прошлые работы показали, что питательная среда, pH и уровень кислорода в системе, а также физические свойства, такие как текучесть и разница в структуре поверхности (силикон против пластика), могут влиять на образование биопленки 36,37,74,75,76,77,78. Кроме того, культивирование бактерий с обширной уреазной активностью, таких как P. mirabilis в закрытой системе в AUM, может привести к накоплению токсичных метаболитов, что может привестик гибели клеток. В модели мочевого пузыря in vitro это смягчается, так как AUM в центральной камере постоянно заменяется свежей средой через контур среды, что позволяет изучать биопленки CAUTI в более клинически значимых условиях45. Повседневная работа модели мочевого пузыря in vitro и конечная точка, выбранная для моделей, во многом зависят от того, инокулированы ли модели уреазоположительными или отрицательными организмами. Теоретически модели in vitro могут работать бесконечно, если они снабжены достаточным объемом AUM и если стерильность модели поддерживается; Тем не менее, рекомендуется выбирать конечную точку до начала эксперимента, будь то блокировка или произвольное количество дней. Как правило, рекомендуется, чтобы модели in vitro, инокулированные уреазоотрицательными микроорганизмами, проводились в течение ≤7 дней для моделирования клинической среды, поскольку этого обычно достаточно для наблюдения за образованием биопленки у большинства организмов, при этом соблюдая клинические вмешательства, поскольку стандартная передовая практика указывает на то, что катетеры должны быть заменены после видимогоинфицирования. 3,47,48. Несмотря на то, что уреазоположительные организмы, вероятно, продуцируют кристаллические биопленки, существует большая вариабельность уреазоположительных штаммов во времени до закупорки мочевого пузыря in vitro, причем некоторые штаммы Proteus mirabilis вызывают закупорку катетера менее чем за 10 ч, а другим требуется более 30 ч для блокировки39,46. Стандартный уреазный тест может быть использован до проведения экспериментов с моделью мочевого пузыря in vitro, чтобы определить, следует ли запускать модели до закупорки или до заранее определенной конечной точки80.

Возможно, основным ограничением использования модели мочевого пузыря in vitro для изучения образования биопленки является то, что измерения биопленки являются конечным показанием, поскольку они требуют удаления и рассечения мочевого катетера. И наоборот, планктонные образцы могут быть взяты из модели мочевого пузыря in vitro в любой момент эксперимента. Кроме того, после того, как образцы биопленки взяты из моделей мочевого пузыря in vitro, можно использовать многочисленные дополнительные методы для лучшей количественной оценки производства биопленки. В прошлых исследованиях использовалась пламенная фотометрия для количественной оценки количества кальция и магния, присутствующих в кристаллических биопленках, а более сложные красители могут быть использованы для точной идентификации компонентов матрицы EPS уреазоотрицательных биопленок 45,73,81,82,83,84.

В данной работе также описывается применение модели мочевого пузыря in vitro для изучения эффектов терапии, направленной на лечение CAUTI. Модель мочевого пузыря in vitro моделирует важные аспекты ниши CAUTI, такие как использование AUM, а также клинически значимое образование биопленки и повышенная органическая нагрузка, наблюдаемая при CAUTI. Терапевтические средства, такие как антибиотики, могут быть добавлены непосредственно в резервуар AUM для моделирования клинически значимой биодоступности препарата, и в прошлых исследованиях использовались перепрофилированные препараты, такие как тиоридазин и флуоксетин, для демонстрации антибиопленочногоэффекта. Кроме того, для определения антимикробной активности биоцидов часто используются анализы минимальной ингибиторной концентрации и тесты на бактериальную суспензию, хотя существует мало доказательств того, что анализы коррелируют с реальной чувствительностью биоцидов 41,85,86,87,88. Модель мочевого пузыря in vitro выгодна для тестирования биоцидных продуктов, направленных на лечение или профилактику CAUTI, поскольку наличие мочевого катетера и более репрезентативное моделирование ниши CAUTI означают, что такие продукты, как антимикробные лубрикантные гели и ирригационные растворы, могут быть протестированы в соответствии с инструкциями производителя. В прошлых исследованиях также использовалась модель мочевого пузыря in vitro для определения эффективности фаговой терапии, и было продемонстрировано, что лечение фагами может продлить время блокировки модели мочевого пузыря in vitro более чем на 100 ч47. Использование катетера Фолея стандартного размера в модели мочевого пузыря in vitro также означает, что новые катетеры с покрытием могут быть проверены на антимикробную активность. Прошлая работа Slate et al. продемонстрировало, что катетеры, покрытые тераностическим ципрофлоксациновым покрытием, могут увеличить время закупорки P. mirabilis на ~60 ч в модели мочевого пузыря in vitro 48. Это подчеркивает потенциальное применение модели мочевого пузыря in vitro в изучении новых терапевтических средств, направленных на лечение CAUTI, что позволяет более точно оценивать противомикробные препараты в биологически релевантной симулированной нише CAUTI.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-ра Джонатана Нзакизванайо и д-ра Энтони Дж. Работа в Университете Бата финансировалась Советом по медицинским исследованиям GW4 Biomed DTP в качестве студенческой стипендии для V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. также получает финансовую поддержку от Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). Исследования O.E.C. финансировались компанией Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). Рисунок 1 создан с помощью Biorender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
313 Удлинитель головки с быстрой нагрузкойWatson-Marlow313Перистальтический насос - дополнительное удлинитель головки 
323S/D Насос с ручным управлением с регулируемой скоростьюWatson-Marlow323S/DПеристальтический насос
3 л Постельные мешки, стерильные с рычажными кранами Медицина Большого Медведя GDW173
3 мм внутренний диаметр платинового отверждения силиконовая трубкаFisher10111801Малая трубка AUM (подключение трубки насоса к моделям)
Внутренний диаметр 5 мм платиновая силиконовая трубкаFisher10539201Трубка среднего контура AUM (подключение трубки насоса к резервуару AUM)
хлорид аммония (NH4Cl)Fisher11473713
безводный сульфат натрия (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Tapered connector Fisher10712807Используется для соединения трубок разной длины в контуре AUM
Вешалки для сумок кровати Медицина Большого Медведя 10705P
Bochem зажимы для трубки для крана, диаметр 25 ммFisher11805101
хлорид кальция (CaCl2)Fisher10021681
моногидрат лимонной кислоты MerckC1909-500GИспользуется для удаления кристаллической биопленки с моделей после экспериментов 
Fisherbrand  Стеклянные градуированные пипетки класса B Тип 1Fisher11992168Используется для поставки моделей блейдеров in vitro с AUM через сверленный
желатинVWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Аналитическое программное обеспечение, используемое для построения графиков результатов моделирования мочевого пузыря in vitro и статистического анализа.
Настольный pH-метр Hanna HI 2211-02Phillip Harris PP00057414
In vitro модель мочевого пузыря --Оборудованиена заказ, как ранее описано Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 мл смазочный гельmydoctorshop.co.uk40-006Смазочные гели, используемые в разделе 7.1.; доступны другие поставщики.
Kartell Plastilab Неровный конический соединительFisher 11914289Используется для соединения трубок разных диаметров:
агар Мак-Конки без соли (обезвоженный)Fisher10472643Для перечисления одиночных колоний роящихся бактерий, т.е. Proteus mirabilis
хлорид магния гексагидрат (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
монофосфат калия (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y-образный разъемFisher10186070Используется для запуска нескольких цепей AUM от одного резервуара AUM (1-4 модели на бак) 
хлорид калия (KCl)Флакон
Pyrex с боковым гнездом из матового стекла, емкость: 5000 млРезиновые11347884для резервуара AUM
с отверстием, внешний диаметр: 37 мм, красный, диаметр: 37 ммFisher11517612используется в резервуаре AUM и для поставки моделей in vitro с AUM
Размер 14 французский 100 % силиконовый катетер Фолея со стерильным шприцем воды для надувания;Медицина Большого Медведя 4833-0514
Хлорид натрия (NaCl)Fisher10735921
оксалат натрия (Na2C2O4)Fisher10442211
концентрат биоочищения Teknon биоцидный очиститель 5L Fisher12447580Используется для стерилизации моделей цитрата
тринатрия после экспериментов (Na3C6H5O7)Fisher11434993
триптонный соевый бульонFisher10198002
мочевины (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833мешочек для орошения мочевого пузыря физиологическим раствором, используемый в разделе 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil 1,6 мм внутренний диаметр платинового отверждения силиконовая трубкаFisher12406280толстая трубка контура AUM (для использования в перстальтическом насосе)
аспиратора Fisher 10375810 пробки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи