Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выявление микроглии и периферических инфильтрирующих макрофагов в поврежденном спинном мозге с помощью проточной цитометрии

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67967

⸱

24 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Идентификация микроглии (MG) и периферических инфильтрирующих макрофагов (Mø) в поврежденном спинном мозге затруднена. В этом протоколе проточная цитометрия (FCM) использовалась для идентификации M1-подобного MG, M2-подобного MG, M1-подобного Mø и M2-подобного Mø соответственно. Эта технология также может быть применена к другим заболеваниям центральной нервной системы, чтобы понять роль MG и Mø.

Аннотация

В здоровом спинном мозге периферические инфильтрирующие макрофаги практически не обнаруживаются, а микроглия (МГ) участвует в поддержании стабильности микроокружения спинного мозга путем фагоцитоза, очищения от клеточного мусора и выработки нейротрофических факторов. После травмы спинного мозга (ТСМ) МГ активируются, и клетки периферического иммунитета проникают в поврежденный спинной мозг. Среди этих иммунных клеток ключевую роль в патологическом процессе ТСМ играют активированные MG и периферические инфильтрирующие макрофаги (Mø). Эти клетки можно различать на провоспалительные (М1-подобные) и противовоспалительные (М2-подобные) фенотипы; Тем не менее, различить их сложно из-за сходства морфологии и многих клеточных маркеров. Проточная цитометрия (ТКМ), широко используемый метод в области биомедицины, может одновременно обнаруживать несколько клеточных параметров, таких как размер клетки, размер частиц, поверхность клетки и внутриклеточные маркеры, в одном эксперименте. На протяжении многих лет исследований ФКМ была предпринята попытка идентифицировать MG и Mø в спинном мозге и постоянно оптимизирулась, чтобы в конечном итоге разработать метод стабильного обнаружения. Этот метод позволяет идентифицировать M1/M2-подобные MG и M1/M2-подобные Mø после ТСМ путем детектирования профилей экспрессии CD45, CD11b, CD68, CCR7 и других маркеров. В этом протоколе CD11b+CD45−/низкийCD68+CCR7+, CD11b+CD45−/низкийCD68+CCR7-, CD11b+CD45высокийCD68+CCR7+ и CD11b+CD45высокийCD68+CCR7-клетки могут быть идентифицированы как M1-подобные MG, M2-подобные MG, M1-подобные Mø и M2-подобные Mø соответственно.

Введение

Травма спинного мозга (ТСМ) является результатом повреждения спинного мозга, вызванного различными причинами. ТСМ имеет высокий уровень инвалидности, и в настоящее время нет эффективных вариантов лечения, что делает ее одной из самых серьезных проблем общественного здравоохраненияв мире. Патофизиологический процесс ТСМ сложный, делится на две стадии. Первоначально механическая травма от травмы сразу же вызывает острую клеточную дисфункцию и гибель клеток. Затем вторичное повреждение приводит к дальнейшей клеточной дисфункции и гибели клеток в течение дней, недель или даже месяцев. Было доказано, что в механизмах вторичного повреждения воспаление является ключевым фактором, определяющим тяжесть вторичного повреждения, в конечном итоге определяя гибель клетоки их функциональность. Характерными особенностями воспалительных реакций являются инфильтрация и активация воспалительных клеток в поврежденном спинном мозге, что приводит к увеличению воспалительных клеток и воспалительных факторов, созданию воспалительного микроокружения и в конечном итоге вызывает дисфункцию спинного мозга4.

Микроглия в центральной нервной системе (ЦНС) и периферические инфильтрирующие макрофаги играют решающую роль в воспалительной реакции после повреждения спинного мозга (ТСМ)5,6. Являясь резидентными макрофагами ЦНС, микроглия составляет 5-10% клеток ЦНС и необходима для восстановления ТСМ 7,8. Микроглия может поглощать и удалять клеточный мусор после ТСМ, опосредуя образование заживающих рубцов 9,10. Однако чрезмерная активация микроглии может привести к устойчивой воспалительной реакции и способствовать образованию глиальных рубцов, которые препятствуют регенерации аксонов11. После ТСМ активированная микроглия в основном демонстрирует два фенотипа: М1-подобный и М2-подобный12,13. М1-подобный фенотип является провоспалительным, способствуя синтезу воспалительных факторов, способствующих апоптозу клеток и вторичному повреждению. М1-подобная микроглия также обладает нейротоксическим действием, усугубляя повреждение и апоптоз нейронов14,15. Напротив, М2-подобный фенотип обладает противовоспалительными свойствами и способствует ангиогенезу, ремиелинизации, росту аксонов и восстановлению тканей 16,17. М2-подобная микроглия играет решающую роль в модуляции воспаления и восстановительных процессах.

Периферические макрофаги инфильтрируются в место поражения после ТСМ через поврежденные гемато-спинной мозг барьеры и сосудистую сеть17,18, дополнительно регулируя воспалительную реакцию, фагоцитоз, образование рубцов и регенерацию нервной ткани19,20. Периферические инфильтрирующие макрофаги могут уменьшать воспалительную реакцию после ТСМ, фагоцитозного остатка ткани21, способствовать регенерации нейронов и ремоделированию матрикса. Тем не менее, устойчивая воспалительная реакция, опосредованная периферическими инфильтрирующими макрофагами, может привести к вторичному повреждению, которое наносит ущерб долгосрочному восстановлению22,23. М1-подобные периферические инфильтрирующие макрофаги обладают сильными фагоцитарными и антигенпрезентирующими способностями, способны очищать некротические клетки24. Тем не менее, их чрезмерная секреция провоспалительных цитокинов, активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (РНС) может повредить нейроны и глиальные клетки, что приводит к более тяжелому апоптозу нейронов. И наоборот, М2-подобные периферические инфильтрирующие макрофаги могут ингибировать апоптоз нейронов и смягчать воспалительную реакцию после ТСМ, тем самым способствуя восстановлениюнервной ткани.

Активированная микроглия и периферически инфильтрирующие макрофаги после ТСМ демонстрируют морфологическое и молекулярное сходство экспрессии, что затрудняет их дифференциацию. Проточная цитометрия (ФКМ), широко распространенный метод, используется для анализа экспрессии клеточной поверхности и внутриклеточных молекул, идентификации различных субпопуляций клеток и одновременной оценки нескольких параметров отдельных клеток. Был проведен анализ стабильной ФКМ, чтобы отличить активированную микроглию от периферически инфильтрирующих макрофагов, что облегчает изучение их роли при ТСМ. В этой статье описывается разработанный метод стабильного детектирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике ухода за животными Медицинского университета Бенбу (No 2020-050). Уход за животными осуществлялся в соответствии с правилами, предоставленными Министерством науки и технологий Китая. В общей сложности 18 восьминедельных самок мышей C57/BL6 были получены и использованы в коммерческих целях. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Экспериментальная и животная подготовка

  1. Поместите мышей в вентилируемые клетки перед операцией. Поддерживайте 12-часовой цикл света/темноты и обеспечьте свободный доступ к пище и воде. Поддерживайте температуру окружающей среды в помещении на уровне 20-22 °C и влажность на уровне 30%-70% в течение одной недели акклиматизации.
  2. Стерилизуйте хирургические инструменты для мышей путем автоклавирования и высушите их перед использованием. Подвергните инструменты и операционную комнату для животных ультрафиолетовой стерилизации за полчаса до операции. Сгруппируйте и пометьте мышей в соответствии с принципом случайной группировки. Записывайте и регистрируйте их вес для последующего использования.
  3. Обезболивайте мышей коктейлем из кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) путем внутрибрюшинного введения (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Сбрейте волосы на спине от позвонков Т8 до Т10.

2. Подготовка модели мыши SCI

  1. Продезинфицируйте операционную область с помощью йодного тампона от головы до хвоста с центром на Т9, с последующей дезинфекцией 75% спиртовым тампоном. Сделайте разрез на коже длиной 1 см с центром в Т9. Рассеките фасцию, мышцу и связки вокруг Т9 на 1 см.
    1. Отделите мышцу, прилегающую к остистому отростку Т9, чтобы обнажить Т9. С помощью офтальмологических ножниц раскройте и удалите пластинку между Т9 и Т10, полностью обнажив спинной мозг, расположенный в точке Т9, который составляет примерно 2 мм в диаметре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При подъеме пластинки T9 следите за тем, чтобы ножницы не касались спинного мозга.
  2. Стабилизируйте позвоночник путем зажима остистых отростков Т7 и Т11. Создайте модель умеренной ТСМ с помощью стержня диаметром 1,3 мм и усилием 0,5 Н. Наблюдайте за закручиванием хвоста вверх и подергиванием задней конечности после ТСМ. Для мышей с фиктивной операцией выполняйте только ламинэктомию без ушиба.
  3. Добиться гемостаза в месте разреза. Выполните послойное закрытие с использованием стерильных хирургических швов 5-0. Для мышечного приближения захватите глубокую фасцию щипцами Адсона зубьями и сшите слой панникулюса карнозуса с помощью рассасывающейся мононити 5-0, вводя иглу перпендикулярно 2 мм от края раны для достижения симметричных полноразмерных прикусов (глубиной 2-3 мм) на расстоянии 3 мм друг от друга.
    1. Завяжите квадратные узлы с контролируемым натяжением, чтобы выровнять фасциальные плоскости анатомически. Переместите края кожи с помощью ножниц микрорадужной оболочки, чтобы создать эпидермальную вывертку на 1 мм. Точно выровняйте дерму с помощью часовых щипцов и закрепите простыми прерывистыми 5-0 нерассасывающимися нитями, расположенными на расстоянии 2 мм друг от друга, обеспечивая равномерную коаптацию без подкожных мертвых зон.
    2. Продезинфицируйте линию шва йодными тампонами однонаправленными движениями от центра раны к краям. Аккуратно промокните остатки крови марлей, смоченной в физрастворе, и нанесите тонкий слой тройной мази с антибиотиком вдоль разреза.
  4. После операции поместите мышей в клетку, где поддерживается подходящая температура и влажность. Обеспечьте уход за мочеиспусканием два раза в день (утром и вечером), чтобы помочь мышам до тех пор, пока они не восстановят самостоятельное мочеиспускание.
  5. Ежедневно вводите каждой мыши подкожно по 0,5 мл физиологического раствора и антибиотиков (гентамицин, 2000-2500 ЕД/мышь) для предотвращения инфекции.

3. Выделение ткани спинного мозга у мышей C57/BL6

  1. Обезболите мышей перед операцией (шаг 1.3). После полного обезболивания зафиксируйте их на операционном столе в положении лежа на спине. Мыши, которых оперировали обманом, лечатся аналогичным образом.
  2. Сделайте поперечный разрез в грудной полости, ниже грудины, а также вдоль диафрагмы, чтобы обнажить сердце. Аккуратно стабилизируйте сердце с помощью гемостатиков и введите перфузионную канюлю в апикальный левый желудочек, продвигая его в аорту.
    1. Немедленно перережьте правую ушную раковину и начните перфузию со скоростью 250 мл/ч 10 мл раствора PBS. Перфузия считается успешной, когда жидкость, оттекающая из правой ушной раковины, становится из кроваво-красной в прозрачную и бесцветную, или когда печень переходит из красного в белый27.
  3. Пересеките позвоночник на хвостовом конце мыши, чтобы обнажить позвоночные отверстия. С помощью офтальмологических ножниц осторожно рассекают ткани спинного мозга на 0,5 см выше и ниже места травмы. Поместите изолированную ткань спинного мозга в стерильную чашку для культуры без ферментов, содержащую 5% буфер для окрашивания, и храните ее на льду при температуре 4 °C для последующего использования в центрифугировании с покрытием из поливинилпирролидона (PVP) с коллоидным диоксидом кремния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При рассечении спинного мозга рядом с центром травмы убедитесь в целостности ткани, чтобы избежать разрыва или повреждения спинного мозга в месте травмы. 5% окрашивающий буфер (SB) состоит из 2,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 47,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).

4. Центрифугирование градиента плотности с использованием коллоидного диоксида кремния, покрытого поливинилпирролидоном

  1. Поместите ткань спинного мозга в сетчатый фильтр с ячейками 300 меш и измельчите его с помощью поршня одноразового шприца объемом 5 мл/10 мл. После измельчения отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр 300 меш в центрифужную пробирку объемом 15 мл для центрифугирования (5 мин, 110 x g, комнатная температура).
    1. После центрифугирования добавьте 1 мл раствора для расщепления трипсина в клеточный осадок и инкубируйте его в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C в течение 15 минут. Остановите пищеварение, добавив 1,5 мл фетальной бычьей сыворотки, затем снова центрифугируйте (110 х г, 5 мин, комнатная температура). Ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл 5% красящего буфера (SB).
  2. Последовательно добавьте 4 мл 70% раствора поливинилпирролидона, покрытого коллоидным диоксидом кремния, 4 мл 30% раствора поливинилпирролидона, покрытого коллоидным диоксидом кремния, и 1 мл 5% раствора SB-ресуспендированных клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте смесь (300 x g, 30 мин, 20 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте реагент для разделения поливинилпирролидона, покрытого коллоидным диоксидом кремния, в виде смеси поливинилпирролидона, покрытого коллоидным диоксидом кремния, в соотношении 9:1 и 10× PBS. Разбавьте 70% раствор поливинилпирролидона, покрытого коллоидным диоксидом кремния, 1× PBS и 30% раствор поливинилпирролидона, покрытого коллоидным диоксидом кремния, средой для культивирования клеток DMEM или RPMI 1640.
  3. После центрифугирования клетки образуют слои в центрифужной пробирке (рис. 1). Выбросьте остатки клеток и слои тромбоцитов выше калибровочной отметки 8 мл. Осторожно отасуньте оставшийся раствор (до калибровочной метки 1,5 мл) и выбросьте осадок ниже метки.
    1. Перелейте оставшийся раствор в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 1× PBS, чтобы довести общий объем до 15 мл для центрифугирования (400 x g, 5 мин, 4 °C).
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточный осадок в 5% SB. Переложите раствор в пробирку для проточной цитометрии (FCM) для промывки и центрифугирования (110 x g, 5 мин, 4 °C). Ресуспендируйте клеточный осадок в пробирке FCM с 200 мкл 5% SB.

5. Окрашивание FCM

  1. Разделите 200 мкл клеточной суспензии поровну на две новые пробирки проточной цитометрии. Обозначьте одну пробирку как «Контроль изотипа», а другую — как «Специфическое окрашивание».
  2. Порядок окрашивания
    1. В пробирку «Контроль изотипа» добавьте следующие антитела, соответствующие изотипу: PE-меченый Rat IgG2b kappa, FITC-меченый Rat IgG2b kappa, APC-меченый Rat IgG2b kappa и APC-eFluor 780 меченый Rat IgG2b каппа.
    2. В пробирку "Специфическое окрашивание" добавьте следующую панель флуоресцентных меченых антител в соответствии с рекомендуемыми соотношениями разведения: Крысиный против мыши CD45 APC, Крысиный против мыши CD11b PE, Крысиный против мыши CD68 FITC и Крысиный антимышиный CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Инкубируйте трубки при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 30 минут.
  3. Промойте испачканные клетки дважды, каждый раз добавляя 1 мл SB. Центрифугируйте ячейки (110 x g, 5 мин, 4 °C). Наконец, закрепите клетки 2% параформальдегидом (PFA) для анализа проточной цитометрии.

6. Обнаружение FCM

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к предыдущим отчетам 27,28.

  1. Анализируйте образцы с помощью проточного цитометра с совместимым программным обеспечением (см. Таблицу материалов).
    1. Во-первых, проанализируйте контрольную трубку изотипа, чтобы установить первичный график (FSC по оси x и SSC по оси y). Отрегулируйте напряжение прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC), чтобы расположить популяцию элементов в соответствующем диапазоне.
    2. Настройте два дополнительных графика: один с IgG-APC по оси X и IgG-PE по оси y. Другой с IgG-FITC по оси x и IgG APC-Cy7 (примечание: APC-eFluor 780 был обнаружен в этом канале) по оси y.
    3. Отрегулируйте напряжения флуоресцентных каналов для IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC и IgG APC-Cy7, чтобы расположить популяцию клеток в пределах 103двойной отрицательной области.
  2. После того как напряжения FSC и SSC, а также напряжения флуоресцентных каналов были отрегулированы и оптимизированы с помощью контрольной трубки изотипа, эти настройки должны остаться неизменными. Приступайте к анализу окрашенных антителами экспериментальных пробирок.
    1. Создание основного графика с CD11b-PE по оси x и SSC по оси y. Настройте еще один график с CD68-FITC по оси x и CCR7 APC-Cy7 по оси y. Используя контрольную трубку изотипа в качестве эталона, установите базовые значения и очертите «область» для клеток CD11b+ . На первичном графе задействуйте область клеток CD11b+ и определите ее как «P1 вентиль».
    2. Далее выберите график с CD68-FITC по оси x и CCR7 APC-Cy7 по оси y. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Показать население», затем выберите P1. Это позволит отобразить популяции клеток в группе CD11b+ , которые экспрессируют либо CD68+/CCR7+ , либо CD68+/CCR7-. Соберите 50 000 событий для каждой выборки.
    3. После получения данных при необходимости отрегулируйте компенсацию флуоресценции. Проанализируйте и определите процентное содержание CD11b+ CD68+ CCR7+ (M1-подобных) клеток и CD11b+ CD68+ CCR7- (M2-подобных) клеток. Средний процент положительно помеченных клеток выражается в процентах от общей выборочной совокупности.
  3. Используя хорошо отрегулированные параметры напряжения от управляющей трубки изотипа, приступаем к анализу экспериментальных трубок.
    1. Сначала построим график с CD45-APC и CD11b-PE, а затем два графика с CD68-FITC и CCR7 APC-Cy7. Соберите 50 000 событий для каждого образца и после получения данных отрегулируйте компенсацию флуоресценции.
    2. На графиках псевдоцвета CD45/CD11b проанализируйте «области» для клеток CD11b+ CD45−/low и CD11b+ CD45 high для каждого образца. Затем проанализируйте клетки CD68+ CCR7+ и CD68+ CCR7- в этих двух областях.
    3. Интегрируйте анализы для определения процентного соотношения следующих клеточных популяций: CD11b+ CD45−/низкий CD68+ CCR7+ (М1-подобная микроглия), CD11b+ CD45−/низкий CD68+ CCR7- (М2-подобная микроглия), CD11b+ CD45высокий CD68+ CCR7+ (М1-подобные макрофаги), CD11b+ CD45высокий CD68+ CCR7- (М2-подобные макрофаги).
      Примечание: Средний процент положительно помеченных клеток выражается в процентах от общей выборки.

7. Анализ данных FCM

  1. Запустите программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и перетащите файлы экспериментов по проточной цитометрии в раздел «Все образцы» в интерфейсе. Эксперименты с проточной цитометрией будут отображаться в разделе «Все образцы» в интерфейсе. Начните с анализа контрольной трубки изотипа, чтобы определить порог между положительными и отрицательными флуоресцентными сигналами.
    1. Дважды щелкните по образцу контрольной трубки изотипа , чтобы открыть графическое окно с двумерным точечным графиком. Выберите FSC-A для оси X и SSC-A для оси y. Нажмите на кнопку «Прямоугольные ворота » в верхней части интерфейса и используйте прямоугольник для выбора области после удаления клеточного мусора (рисунок 2A).
    2. Дважды щелкните по выбранной области, чтобы создать новое графическое окно. Выберите FITC для оси x и Гистограмму для оси y. Нажмите кнопку Region Gate в верхней части интерфейса, чтобы установить строб в однопараметрической гистограмме для определения порога между отрицательными и положительными флуоресцентными сигналами. Региональный вентиль определит положительную область (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Область с меньшими значениями FSC представляет собой клеточный мусор.
    3. Для каждого из четырех флуоресцентных антител, использованных в эксперименте, определить порог между отрицательным и положительным сигналами с помощью образца контрольной пробирки изотипа. По оси X последовательно измените флуорохромы на PE, APC и APC-Cy7, сохраняя при этом ось y в качестве гистограммы.
    4. Используйте инструмент region gate на однопараметрической гистограмме, чтобы установить вентили и определить порог между отрицательными и положительными сигналами для каждого из четырех флуоресцентных антител (рис. 2A).
  2. Чтобы проанализировать пропорции М1-подобных и М2-подобных клеток:
    1. Дважды щелкните по образцу экспериментальной трубки , чтобы отобразить двумерную точечную диаграмму. Выберите FSC-A для оси X и SSC-A для оси y. Нажмите на кнопку «Прямоугольные ворота » в верхней части интерфейса и используйте прямоугольник для выбора области после удаления клеточного мусора (рисунок 2B).
    2. Дважды щелкните по выбранной области, чтобы создать новое графическое окно. Выберите CD11b-PE для оси x и SSC-A для оси y. Нажмите кнопку Rectangular Gate в верхней части интерфейса и, используя положительный/отрицательный порог PE, установленный элементом управления изотипом в качестве эталона, определите вентиль CD11b+ (рисунок 2B).
    3. Дважды щелкните по области гейта CD11b+ , чтобы создать новое графическое окно. Выберите CD68-FITC для оси x и CCR7 APC-Cy7 для оси y. Нажмите на кнопку Cross Gate . Используя в качестве эталона положительные/отрицательные пороги FITC и APC-Cy7, установленные контролем изотипа, используйте перекрестный вентиль для категоризации клеток, определяя пропорции CD11b+ CD68+ CCR7+ (M1-подобных) клеток и CD11b+ CD68+ CCR7- (M2-подобных) клеток (рис. 2B).
      Принципы стробирования для анализа пропорций М1-подобных макрофагов (M1-подобных Mø), М2-подобных макрофагов (M2-подобных Mø), М1-подобных микроглий (M1-подобных MG) и М2-подобных микроглий (М2-подобных MG) согласуются с принципами, используемыми для анализа М1-подобных и М2-подобных клеток. Пороги различения положительных и отрицательных сигналов флуоресценции основаны на изотипной контрольной трубке, которая служит эталоном для установки стробов. Процесс работы программного обеспечения проиллюстрирован на рисунке 2B, а профили экспрессии маркеров, используемые для определения пропорций клеток, подробно описаны в разделе репрезентативных результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иммунные клетки из ткани спинного мозга отделяют с помощью коллоидного диоксида кремния, покрытого поливинилпирролидоном методом центрифугирования с градиентом плотности. В процессе центрифугирования клетки распределяются по различным слоям в соответствии с их выталкивающей плотностью, тем самым достигая разделения клеток (Рисунок 1). Сверху вниз распределение следующее: клеточный мусор, мононуклеарный слой, богатый лимфоцитами, а внизу эритроцитарный и гранулоцитарный слой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Успешное создание животной модели ТСМ имеет важное значение. Модель ТСМ была создана путем воздействия на спинной мозг в сегменте Т9 силы 0,5 Н. Успех животной модели был продемонстрирован тем, что хвост мыши скручивался вверх, обе задние конечности испытывали спазмы, а задние конечности были парализованы, что делало невозможным ходьбу мыши после ТСМ (см. шаг 2.3). Послеоперационный уход имеет решающее значение для выживания мыши. Уход за мочеиспусканием осуществляется до тех пор, пока м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

О конфликте интересов заявлено не было.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (No 82072416); и фонд научных и технологических инноваций высокого уровня Первой аффилированной больницы Медицинского колледжа Бенгбу (BYYFY2022TD001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1&раз; ПБС  СоларбиоП1020
в 10 раз; ПБС  СоларбиоП1022
18 восьминедельных самок мышей C57/BL6 Cavens Laboratory Animal Ltd, Чан Чжоу, Китай
APC-eFluor 780-меченый антимышиный CCR7 (IgG2b kappa)Инвитроген47-1971-820,25&мкм; g/тест
APC-eFluor 780-меченый Rat IgG2b kappa  Контроль изотипаИнвитроген47-4321-820,25&мкм; g/тест
Антимышиный CD45 (IgG2b kappa) с маркировкой APCИнвитроген17-0451-820,125μ g/тест
Меченый APC Rat IgG2b kappa  Контроль изотипаИнвитроген17-4031-820,125μ g/тест
DMEMGibco11965092
Фетальная бычья сывороткаЛонсераС711-001
Антимышиный CD68 (IgG2b kappa) с маркировкой FITCИнвитроген  МА5-166760,25&мкм; g/тест
Ratic IgG2b kappa  Контроль изотипаИнвитроген11-4031-820,25&мкм; g/тест
ПараформальдегидБиошарп23319084
PE-меченый антимышиный CD11b Rat (IgG2b kappa)Инвитроген12-0112-810,25&мкм; g/тест
Меченая ПЭ крыса IgG2b kappa  Контроль изотипаИнвитроген12-4031-820,25&мкм; g/тест
Перколл  СоларбиоП8370
Раствор трипсинаБиошарпБЛ526А

Ссылки

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD11bCD68CCR7M1 M2
Выявление микроглии и периферических инфильтрирующих макрофагов в поврежденном спинном мозге с помощью проточной цитометрии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.