Двуязычный вычислительный рабочий процесс для выявления потенциальных ингибиторов PLK1 в американском жестовом языке и английском

Краткое содержание

Этот двуязычный протокол обеспечивает вычислительный рабочий процесс по поиску лекарств, оценивающий взаимодействия белок-лиганд между полоподобными киназ 1–3 (PLK1–3) и свойствами абсорбции, распределения, метаболизма, экскреции, токсичности и стабильности (ADMET-S) природных молекул из базы данных.

Аннотация

Поло-подобная киназа 1 (PLK1) играет важную роль в фазах S, G2 и M клеточного цикла, а её гиперэкспрессия часто наблюдается при множестве видов рака, включая рак молочной железы, где она способствует геномной нестабильности и нарушению апоптоза. В отличие от традиционных ингибиторов АТФ, которые нацелены на домен киназ, селективное ингибирование домена поло-бокса (PBD) PLK1 предлагает перспективную стратегию для нарушения взаимодействия белков и лиганда, критически важных для митотической прогрессии, тем самым запуская апоптоз в раковых клетках. Однако высокая структурная сходство между PLK1 и его гомологами (PLK2 и PLK3), которые жизненно важны для неврологической функции и стрессового ответа соответственно, требует исключительной селективности для предотвращения внецелевых эффектов. Для решения этой задачи протокол включает двуязычный (американский жестовый язык и английский) вычислительный рабочий процесс, интегрирующий виртуальный скрининг, структурную кластеризацию, стыковку белков и лигандов, прогнозирование аффинности связывания, профилирование ADMET-S и анализ стабильности квантовой механики (QM). Начиная с базы данных натуральных продуктов SuperNatural 3.0, соединения фильтровались по критериям релевантности к раку молочной железы и подобию препаратов, кластеризовались для обеспечения химического разнообразия и оценивались их взаимодействия со структурами PLK1, PLK2 и PLK3-PBD. Хотя виртуальное стыкование и оценки ADMET-S in silico не могут окончательно подтвердить селективность или механизм действия, это исследование формирует проверяемые гипотезы и отдаёт приоритет специализированному набору кандидатов, получаемых из натуральных продуктов, для будущих молекулярно-динамических симуляций, биохимической валидации или экспериментального скрининга.

Введение

Поло-подобные киназ (PLK) — это семейство протеинкиназ, структурно состоящих из N-конца и C-конца, состоящих из одного или двух доменов поло-бокса (PBD)^1,2.  Количество и функциональное разнообразие этих доменов polo-box варьируются у разных членов семейства PLK. PLK1 участвует в фазах S, G2 и M деления клеток. В клеточном цикле PLK1 функционирует как контрольная точка повреждения ДНК в S-фазе и как регулятор конденсации хромосом и созревания центросом в фазе G2. PLK1 также способствует митотическому входу в M-фазу, за которым следуют сборка веретена, вход в анафазу и цитокинез ^3,4. Чрезмерная экспрессия PLK1 приводит к генетической нестабильности из-за аномального образования центросом, что приводит к нарушению клеточных циклов, которые делают клетки неспособными регулировать апоптоз.  Такое избыточное выражение наблюдается при раках лёгких, головы и шеи, пищевода, желудка, колоректального и молочной^{железы 4}. Таким образом, ингибирование PLK1 с помощью средств, нацеленных на ПБД, может вызвать^{апоптоз 5,6}. Этот рабочий процесс направлен на достижение высокой селективности, чтобы избежать ингибирования PLK2 и PLK3, которые имеют решающее значение для неврологической функции и управления генотоксичным^{стрессом 3}.

PLK2 в определённых условиях функционирует как супрессор опухоли, регулируя переход G1/S и способствуя деградации циклина E, чтобы предотвратить неконтролируемое размножение клеток. PLK3 играет сложную роль как в регуляции клеточного цикла, так и в ответе на генотоксический стресс, способствуя поддержанию целостности генома через участие в активации контрольных точек повреждения ДНК и индукции^{апоптоза 7}. Важно, что хотя ингибирование PLK1 стало перспективной терапевтической стратегией для лечения рака, важные роли PLK2 и PLK3 в неврологическом функционировании и стрессовой реакции требуют разработки высокоселективных ингибиторов для минимизации внецелевого эффекта на эти важные^{киназы 3}. Этот биологический контекст и структурные сходства выше 38%³ подчёркивают важность выявления соединений, которые специально нацелены на домен поло-бокса (PBD) PLK1, не мешая защитным функциям PLK2 и PLK3 в нормальной клеточной физиологии.

Известные ингибиторы поло-подобных киназных (PLK), особенно те, что нацелены на PLK1, были широко изучены благодаря их потенциальному терапевтическому применению в лечении рака. Несколько соединений, включая BI 2536, воласертиб (BI 6727), онвансертиб (NMS-1286937) и GSK461364, были разработаны и введены в клинические испытания, часто в качестве ингибиторов^{АТФ-конкурентов 8,9,10}. Другие типы ингибиторов нацелены на ПБД, включая тимохинон (TQ^)11,12,^{полоксин 13,14} и аллопол-А¹⁵. Хотя сообщается, что это многообещающе, в настоящее время нет одобренных специфических для PBD ингибиторов или клинических испытаний на поздних стадиях из-за сложностей, включая неоптимальные свойства ADMET-S и нецелевые^{эффекты 6}. Например, несколько ингибиторов PLK1-PBD, по сообщениям, являются неспецифическими алкилаторами^{белков 16}, что ограничивает их клиническую применимость. Таким образом, улучшение селективности и профилей ADMET-S потенциальных ингибиторов PLK1-PBD остаётся ключевой целью при разработке лекарств.

Цель данного исследования — изучить потенциальные ингибиторы PLK1-PBD с свойствами ADMET-S с использованием виртуального скрининга, фильтрации по структурному сходству, стыковки, расчёта энергии связывания и оценки ADMET-S. PLK2 и PLK3 подвергались тем же протоколам для оценки потенциальной селективности. Хотя существует множество вычислительных конвейеров для обнаружения ингибиторов киназ, немногие интегрируют параллельный скрининг селективности на PLK1–3 PBD с комплексным анализом устойчивости ADMET-S и квантово-механической устойчивости, особенно с использованием библиотек натуральных продуктов. Рабочий процесс основан на устоявшихся парадигмах виртуального скрининга, но адаптирован для образовательной доступности и генерации гипотез на ранних стадиях. Протокол требует только стандартного ноутбука (8 ГБ оперативной памяти), бесплатного академического программного обеспечения и отсутствия опыта программирования, что делает его подходящим для средней школы, бакалавриата и магистратуры, включая курсовые исследования на основе бакалавриата (CURE).

Вычислительный процесс этой работы начинается с подготовки белков, когда структуры PLK1-PBD, PLK2-PBD и PLK3-PBD извлекаются из Белкового банка данных (PDB) или моделируются и обрабатываются для устранения структурных несоответствий. Затем был проведён скрининг базы данных натуральных продуктов, фильтрующий соединения по потенциальным противораковым противораковым препаратам и соблюдению Правила пяти Липински. Последующие этапы включают группировку в 50 репрезентативных структур на основе молекулярного отпечатка и сходства. Эти представители прошли расчёты соединения и аффинности связывания между белками и лигандами, что позволило получить данные о взаимодействии для трёх PLK. Впоследствии свойства ADMET-S оцениваются с помощью трёх различных веб-серверов для прогнозирования фармакокинетики, подобия препарата, токсичности и метаболической стабильности. Расчёты QM использовались для оценки молекулярной стабильности с помощью анализа разрыва HOMO–LUMO по наивысшей занятой молекулярной орбитали (HOMO) и наименьшей свободной молекулярной орбитали. Наконец, данные ADMET-S были проанализированы для фильтрации и ранжирования соединений на основе физико-химических, абсорбционных, распределенных, метаболизмов, экскреционных критериев как потенциальных и селективных ингибиторов PLK1-PBD.

Протокол

Идентификаторы исследовательских ресурсов (RRID) и номера версий всех используемых программных инструментов приведены в Таблице материалов.

1. Таргетная подготовка белка

1. Создайте рабочую директорию для этого проекта, где можно хранить структурные файлы и вычислительные результаты.
2. Посетите Protein Data Bank, чтобы получить идентификатор целевого белка PLK1-PBD (4HCO¹¹), а затем обратиться в отдел химии в HARvard Molecular Mechanics - Graphic User Interface (^{CHARMM-GUI 17,18}) для устранения любых структурных несоответствий.
   1. Посетите CHARMM-GUI и зарегистрируйте академический аккаунт. При регистрации академического аккаунта нажмите на генератор ввода, затем PDB Reader, введите PDB ID 4HCO и нажмите следующий шаг.
   2. На следующей странице убедитесь, что выбран только PROA – белковая цепочка A, и нажмите следующий шаг для следующих двух страниц.
   3. Скачайте step1_pdbreader.pdb в каталог, переименуйте файл в 4hco или preferred, а также используйте текстовый редактор или код для переименования появления гистидина (HSD) в (HIS).
3. Повторите процедуру для PLK2-PBD (идентификатор PDB: 4XB0¹⁹) с помощью CHARMM-GUI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для структур без идентификаторов PDB, таких как PLK3-PBD, используйте структуры с гомологическим моделированием или Alphafold²⁰. Обеспечьте точность последовательностей из Uniprot²¹.

2. Скрининг базы данных натуральных продуктов

1. Посетите базу данных природных продуктов библиотеки SuperNatural 3.0 и выберите^{подстраницу} 22 о заболеваниях.
   1. Выберите рак молочной железы с любыми или отсутствующими ограничениями доверия, так как все результаты должны быть отфильтрованы программно, и нажмите «Найти». Нажмите «Скачать полный файл результатов », чтобы сохранить результаты в предпочтительном каталоге в виде .csv. Затем используйте код для фильтрации для тех, кто имеет пределы доверия 0,900–1,000 (n = 1 193 из 73 406).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, идентификатор Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) для рака молочной железы можно ввести на подразделе²³ путей.
   2. Перейдите на подстраницу FAQ , внизу найдите весь набор данных, доступный для скачивания в виде .csv файла. Скачайте это и используйте скрипт для сопоставления строк Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) из набора данных с идентификаторами SuperNatural для 1 193 молекул и подготовьте список их строк SMILES (smiles.csv).

3. Кластерная выборка

1. Скачайте дистрибутив Anaconda (https://www.anaconda.com/download), содержащий почти все пакеты с открытым исходным кодом, или отдельно скачайте интегрированную среду разработки (IDE), такую как RStudio (RStudio Desktop - Posit) или Jupyter (Jupyter Notebook). Установите RDKit²⁴ — открытый пакет для химической информатики и машинного обучения с использованием Conda.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по установке Conda и созданию её среды можно найти в документации conda 25.9.2.dev31. Для установки и настройки модуля RDKit в среде см. раздел Установка — документация RDKit 2025.03.6.
2. Поместите скрипт «Lipinski.py» в Дополнительный файл 1 в ту же папку, что и «smiles.csv», и запустите его. Скрипт открывает среду Conda, загружает модули, читает файл строк SMILES, применяет фильтр на основе Правила 5 Липинского для оценки биодоступности и поглощения (n = 999 из 1 193) и сохраняет список строк SMILES в виде «all.csv».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите, что «all.csv» сгенерировано и содержит ~999 соединений (отфильтрованное подмножество). Откройте файл, чтобы убедиться, что каждая запись содержит действительную строку SMILES. Python запускается в RStudio после выполнения следующих функций в консоли: библиотека (сетка); Сетчатая форма::use_condaenv(nameofcondaenv)
3. Поместите скрипт "Clustering.py" (Дополнительный файл 1) в ту же папку, что и "all.csv", и запустите его в предпочтительном IDE. Скрипты загружают кластерные модули, читают файл строк SMILES и группируют соединения в 50 кластеров на основе молекулярного отпечатка и сходства Танимото.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 50 репрезентативных структур (rep_struct.csv, в дополнительном файле 1) сохранены в каталоге как список строк SMILES. Сходство Танимото (также известное как индекс Жаккара в химинформатике)²⁵ — это метрика, используемая для количественной оценки структурного сходства между двумя молекулами на основе их молекулярных отпечатков, при этом коэффициент Танимото варьируется от 0 (отсутствие сходства) до 1 (идентичные отпечатки пальцев). Убедитесь, что в "rep_struct.csv" ровно 50 уникальных записей SMILES, представляющих каждый кластер.

4. Расчёт состыковки между белками и лиганды и расчёт аффинности связывания

1. Посетите веб-сервер Blind Docking (CB-Dock2) на базе AutoDock Wine с управляемым обнаружением полости ⁽CB-Dock2).
   1. Перейдите на вкладку стыковки и загрузите белок 4HCO.
   2. Чтобы загрузить лиганд, нажмите на draw ligand и вставьте лиганд из списка строк SMILES (rep_struct.csv, Дополнительный файл 1). Введите адрес электронной почты в следующем поле для удобства сбора архивированных данных, затем нажмите Auto Blind Docking. Повторите это для оставшихся 49 представителей малых молекулярных кластеров, помечая их как lig1, lig2, ..., lig50.
2. Перейдите к результату, отправленному по электронной почте, и скачайте папки zip в подкаталог под названием 4HCO, назвав их в порядке (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
   1. Распакуйте папки и удалите все файлы, кроме protein-ligand, комплексных файлов, заканчивающихся на ".complex.pdb".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, содержит ли каждый каталог лигандов (4hco_lig1–4hco_lig50) соответствующий файл ".complex.pdb".
   2. Откройте примерный файл .complex.pdb с помощью текстового редактора, чтобы аккуратно отметить ID белковой цепочки P и идентификатор лиганда A:UNL, а затем заархивировать папки с помощью утилиты для сжатия файлов.
   3. Посетите веб-сервер PROtein binDing enerGY prediction (PRODIGY) для оценки селективности и аффинности связывания между белками и^{лигандыми 27}.
      1. Нажмите на вкладку PRODIGY-lig (белок-малая молекула), чтобы загрузить заархивированную папку с несколькими комплексами белков-лигандов одновременно (например, 4hco_lig1). Введите белковую цепочку и ID лигандов, завершите проверку капчи и нажмите Отправить Prodigy-Ligand.
      2. После обработки данных нажмите на архивный файл всех выходов (.zip ), чтобы скачать результаты. Повторите предыдущий шаг и собирайте результаты для всех подкаталогов до 4hco_lig50.
   4. Повторяйте все шаги для белков 4XB0 и PLK3 с осторожным следом за номенклатурой файлов (например, 4xb0_lig1 или plk2_lig1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите, что выходные CSV для всех комплексов белков-лиганд загружены и содержат как столбцы данных о остатках ΔG, так и интерфейса.

5. Оценка ADMET-S

1. Посетите платформу ADMETlab3 3.0²⁸.
   1. Нажмите НАЧАТЬ в разделе «ADMET Screening» и введите список УЛЫБОК.
      1. Откройте rep_struct.csv в каталоге, чтобы вставить весь список строк SMILES в текстовое поле и отправить её.
      2. Оцените фармакокинетику и свойства похожих на лекарства с помощью системы оценки с цветом кодирования платформы и скачайте результаты оценки в виде .csv файла для дальнейшего анализа.
      3. Перейдите к инструменту SwissADME²⁹.
2. Вставьте список строк SMILES для всех 50 молекул в поле входа.
   1. Нажмите Run , чтобы вычислить свойства биодоступности и проницаемости, включая проникновение BBB.
   2. Скачайте результат в виде .csv-файла для интеграции с другими результатами ADMET.
3. Скачайте и установите ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation с помощью подхода дерева решений), совместимый с операционной системой пользователя.
   1. Откройте программу через терминал с помощью команды: sh Toxtree.sh
   2. Введите строки SMILES по отдельности в ToxTree, чтобы классифицировать токсичность по правилам Крамера.
   3. Экспортировать результаты в виде .csv-файла для интеграции с другими данными ADMET.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, что выходные CSV ADMETLab3 и SwissADME совпадают с количеством лигандов (n = 50) и что результаты Toxtree классифицируют каждое соединение по правилам Крамера (I–III).
4. После установки ORCA³¹ создайте папку с названием stability в рабочей директории и подпапки для каждой молекулы (например, plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Используйте Avogadro (Avogadro), чтобы построить каждую молекулу из её строки SMILES: перейдите на вкладку Extensions и нажмите Optimize Geometry для оптимизации молекулы. Генерируйте входные файлы ORCA через расширения > ORCA > генерируйте входные данные ORCA и применяйте следующие настройки:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      nprocs 1
      Конец
   2. Измените загруженный файл .sh для каждого лиганда, включив уникальные имена профессий и адрес электронной почты. Затем перенесите каталог «стабильность» в систему высокопроизводительных вычислений (HPC) с помощью следующих команд:
      Тсс xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKDIR ~/4HCO
      scp -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Выполняйте задачи через Simple Linux Utility for Resource Management (менеджер нагрузки SLURM для кластеров HPC) с помощью скрипта цикла:
      для i в {1..50}; do
      CD ~/4hco/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      Готово
   4. После получения писем с подтверждением завершения работы перейдите к папкам лиганда и откройте выходные файлы, чтобы просмотреть данные и отметить значения HOMO и LMO:
      CD ~/4hco/стабильность/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Анализ данных ADMET-S

1. Объедините данные о физико-химических свойствах, полученные из радаров биодоступности и проницаемости SwissADME, в .csv файл.
   1. Сохраните .csv файл из SwissADME и назовите его «Physiochemical.csv».
   2. Поместите скрипт «Physiochemical.py» (дополнительный файл 1) в ту же папку, что и «Physiochemical.csv», и запустите его.
   3. Применяйте следующие критерии: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4–0,5, Fsp3: >0,41, и nHet: 1–15.
2. Получите данные поглощения и распределения из SwissADME.
   1. Снимок и сохранение диаграммы BOILED-Egg³² в SwissADME.
   2. Применяйте следующие критерии: молекулы должны находиться в области «яйца» и действовать как ингибиторы p-гликопротеинов, так как предпочитаются красные точки.
3. Получите данные метаболизма из ADMETlab3.0 субстрата и ингибиторов цитохрома (CYP).
   1. Сохраните .csv файл с ADMETlab3.0 и назовите его «Metabolism.csv».
   2. Отредактируйте .csv файл и оставьте только столбцы CYP-inh и CYP-sub.
   3. Поместите скрипт «Metabolism.R» (Дополнительный файл 1) в ту же папку, что и «Metabolism.csv», и запустите его.
   4. Применяйте следующие критерии: ингибитор CYP p450 и несубстрат как категории 0 предпочтительны.
4. Получите данные о выделении из ADMETlab3.0 для плазменного клиренса и периода полураспада.
   1. Сохраните .csv файл с ADMETlab3.0 и назовите его «Excretion.csv».
   2. Отредактируйте .csv файл и оставьте только столбцы cl-plasma и t0.5.
   3. Поместите скрипт "Excretion.py" (Дополнительный файл 1) в ту же папку, что и "Excretion.csv", и запустите его.
   4. Применяйте следующие критерии: клиренс плазмы: 0,01–5 мл/мин/кг.
   5. nТоксичные данные от Toxtree для класса токсичности и ADMETlab3.0 для количества токсикофоров.
      1. Сохраните .csv из ADMETlab3.0 и назовите её «Toxicity.csv».
      2. Отредактировать .csv файл, оставив только столбец Toxicophore, и добавить новый столбец с классом токсичности каждого лиганда из Toxtree.
      3. Поместите скрипт "Toxicity.py" (Дополнительный файл 1) в ту же папку, что и "Toxicity.csv", и запустите его.
      4. Примените следующий критерий: количество токсикофоров должно быть от 0 до 2.
   6. Получите данные о стабильности из выходных файлов ORCA. ("ОРБИТАЛЬНЫЕ ЭНЕРГИИ", а именно энергетические значения HUMO и LUMO).
      1. Создайте таблицу в Excel, в которой энергии HUMO и LUMO каждого лиганда будут записывать в отдельных столбцах.
      2. Добавьте новый столбец для вычисления запрета (HUMO–LUMO = зазор зоны).
      3. Сохраните таблицу Excel как «Stability.csv».
      4. Поместите скрипт «Stability.py» (дополнительный файл 1) в ту же папку, что и «Stability.csv», и запустите его.
      5. Применяйте следующие критерии: разница забороченного зазора должна составлять от 3,6 до 5 эВ.

Результаты

Протокол файла структуры белка обеспечивает оптимизацию файла для анализа и стыковки на основе структуры. Полученный файл структуры в формате PDB не содержит отсутствующих остатков и водородов, отсутствующих типов атомов и ненужных компонентов, таких как молекулы воды и сокристаллизованные лиганды. На рисунках 1A,B показаны визуальные различия (визуализированные Mol* Viewer³³) в структурах до и после подготовки. Если остаются остаточные проблемы с форматированием (например, нераспознанные названия атомов или неполные остатки), CB-Dock2 обычно выдаёт ошибку при загрузке. После этого можно применить незначительные ручные корректировки, такие как переименование HSD в HIS или удаление нестандартных остатков, перед повторной попыткой стыковки.

На рисунке 2 показаны результаты кластеризации с помощью анализа главных компонентов (PCA) на основе молекулярного отпечатка и сходства Танимото. На рисунке каждый кластер сгруппирован овалом серого оттенка с точками схожего цвета, которые представляют молекулы этих кластеров.  Компоненты PCA 1 и 2 по осям обеспечивают двумерное линейное представление редукции из высокомерных элементов в матрицах Танимото. В этом исследовании сходство Танимото используется на этапе кластерного отбора проб для снижения избыточности и увеличения химического разнообразия среди 999 натуральных продуктов, соответствующих стандарту Липински. Вычисляя парные сходства Танимото с помощью молекулярных отпечатков, набор данных делится на 50 кластеров структурно связанных соединений. Затем из каждого кластера выбирается одна представительная молекула, что гарантирует, что итоговый набор из 50 лигандов захватывает широкое химическое пространство и минимизирует вычислительную избыточность при анализах на следующий этап стыковки и ADMET-S. Эта стратегия повышает эффективность и репрезентативность виртуального скрининга, особенно при работе с крупными библиотеками натуральных продуктов, такими как SuperNatural 3.0. (см. рисунок 2).

Оптимальные позы для каждого комплекса белков-лиганд моделируются с прогнозируемыми сродствами в виде оценок Vina среди пяти поз CurPocket белка PLK1 в CB-Dock2, учитывая силы Ван дер Ваальса и водородные связи.  Пример симуляции лиганда 1 на рисунке 3 показывает лучшую связь со второй позой CurPocket (C2), с самым низким баллом Vina — 7,5 ккал/моль по сравнению с другими четырьмя верхними позами. Молекулярная стыковка с CB-Dock2 осуществляется с помощью системы скорирования, основанной на эмпирических параметрах, и стохастическом алгоритме глобальной оптимизации. CB-Dock2 был тщательно проверен и продемонстрировал превосходные характеристики по сравнению с другими современными инструментами слепого стыковки, что делает его отличным выбором для исследований^{стыковки 26,34}. Сервер достигает успеха примерно 85% при предсказании позы привязки (RMSD <2 Å), превосходя популярные инструменты, включая первую версию CB-Dock, SwissDock, COACH-D и MTiAutoDock³⁴. Эта высокая точность объясняется инновационной интеграцией CB-Dock2 двух взаимодополняющих схем стыковки: структурных и шаблонных подходов.

Рисунок 4 иллюстрирует тепловую карту средних прогнозируемых аффинностей для каждой комбинации белка-лиганда с использованием предсказанных аффинностей веб-сервера PRODIGY.  Более высокие аффинности, характеризующиеся более низкими молярными энергиями (ккал/моль) и более зелёными оттенками тепловой карты, являются благоприятными связывающими аффинностями. В отличие от этого, более низкие аффинности, проявляющиеся более высокими молярными энергиями и более красными оттенками тепловой карты, менее благоприятны. С точки зрения селективности идеально иметь соединения с благоприятными сродствами к целевой белке (PLK1) относительно гомологов (PLK2–3). Например, лиганд 27 является селективным лигандом PLK1-PBD относительно лиганда 45, который демонстрирует схожие аффинности по всем трём белкам. Хотя удары 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 и 49 демонстрируют более высокую аффинность к PLK1-PBD, чем PLK2/3, они химически разнообразны в пространстве двумерных отпечатков пальцев (средняя ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, нет пары ≥ 0,50), что говорит о том, что любая более широкая специфичность, вероятно, обусловлена консервативной геометрией карманов PBD и общими 3D-фармакофорными/интерактивными паттернами, а не идентичностью каркасов. Рекомендации включают сравнение взаимодействия и отпечатков пальцев и фармакофорное картирование для выявления структурных детерминантов распознавания PLK1-PBD.

Результаты оценки физико-химических свойств показаны на радарной диаграмме (рисунок 5). Оцениваемые свойства включают атомные взаимодействия, растворимость и биодоступность. Некоторые соединения выделяются своими более желательными физико-химическими свойствами с приемлемыми диапазонами: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4–0,5, Fsp3 > 0,41 и nHet = 1–15. Эта радарная диаграмма предоставляет всестороннюю, многомерную визуализацию физико-химических свойств 50 представительных лиганд, выявленных в процессе вычислительного скрининга. Она предназначена для оценки того, насколько каждое соединение соответствует заранее определённым критериям «лекарственно-подобных» путём отображения его свойств с установленными нижними и верхними пределами. Диаграмма показывает десять ключевых молекулярных дескрипторов, расположенных вокруг полярной оси, включая pKa кислотный и pKa основной. Затеняемая область между зелёным многоугольником (нижний предел) и синим многоугольником (верхний предел) обозначала идеальный или приемлемый диапазон для каждого свойства на основе порогов, предусмотренных в протоколе. Верхние и нижние пределы pKa кислоты (2–12 и pKa основание (3–10) были определены на основе обзоров^{литературы} 35,36,37, поскольку не существует единого верхнего и нижнего предела pKa при открытии лекарств. Каждая цветная линия представляет одну из 50 лиганд. Форма, образованная соединением точек данных для одного лиганда, показывает её профиль по выбранным десяти свойствам одновременно. Подавляющее большинство из 50 лигандов находится в пределах или очень близко к приемлемой области, определённой зелёным и синим многоугольниками. Это свидетельствует о том, что начальные этапы фильтрации, особенно применение Правила пяти Липинского и кластеризация на основе сходства Танимото, были очень эффективны для обогащения набора данных молекулами с благоприятными свойствами, похожими на лекарства. Рекомендуется отобрать полный диапазон задокументированных значений для всех параметров.

Рисунок 6A–C показывает компоненты данных ADME из ADMETlab3.0 и SwissADME. Начиная с абсорбции и распределения, модель^{BOILED-Egg 38} на рисунке 6A из SwissADME отражает всасывание и распределение препаратов через липофильность и проницаемость, что показано жёлтыми и белыми эллипсами на графике. Он включает субстраты и ингибиторы P-gp, представленные синими и красными точками соответственно, где ингибирование P-gp имеет решающее значение для повышения скорости всасывания. На рисунке 6B тепловая карта метаболизма визуализирует ингибирование и субстрат примерно 7 разновидностей ферментов цитохрома p450 CYP. Желаемый результат для лигандов — служить как не-ингибиторы CYP и несубстраты (зелёные), при этом предпочтительные результаты подтверждают безопасный профиль безопасности лекарств с отсутствием или низким уровнем взаимодействий между лекарством. Рисунок 6C показывает данные о выведении препарата и его периоде полураспада. Выведение можно различать по оптимальному клиренсу плазмы (<5 мл/мин/кг). Период полураспада всех противораковых препаратов зависит от механизма действия, токсичности и цели препарата. Идеальный период полураспада балансирует поддержание концентрации лекарств в терапевтическом окне с минимизацией токсичности и удобным графиком^{дозирования 39,40}.

Показано сочетание двух типов оценки токсичности. На рисунке 7A показано количество токсикофоров, выявленных ADMETlab3.0, для каждого лиганда.  Нет чёткого порога или информации о допустимых диапазонах токсикофоров.  На рисунке 7B применение Toxtree содержит информацию, связанную с классом токсичности (I-III), а также нарушениями и соблюдением правил Крамера. Примерный результат для лиганда 1 показывает результаты токсичности и его код SMILES в верхней полосе, а структура — в нижнем левом окне. Определение токсичности класса в верхнем правом окне указывает на высокую токсичность (Класс III) на основе правил Крамера для лиганда 1, а не других вариантов, таких как Класс II (средняя токсичность) или Класс I (низкая токсичность).  В правом нижнем окне показано письменное обоснование идентификации класса на основе дерева решений по правилу Крамера.

Расчёты колебательной частоты ORCA QM для оптимизированных конструкций рассчитывают орбитальные энергетические значения для определения зонного зазора. Рисунок 8 показывает запрещённый зазор (eV) каждого лиганда, полученный из разницы между HOMO и LUMO. Пороговый диапазон представлен в заштримённой области между 3,6 эВ и 5,0 эВ, где каждая точка в затенённой области удовлетворяет энергетическим уровням, соответствующим более желательной стабильности и реактивности. Обзор всего вычислительного рабочего процесса изложен на рисунке 9, где показаны последовательные этапы от приготовления целевых белков и скрининга базы данных натуральных продуктов до оценки ADMET-S, предназначенных для выявления селективных ингибиторов PLK1-PBD при обеспечении лекарственных свойств и химической стабильности. Эта визуальная дорожная карта подчёркивает модульность, доступность и пригодность протокола для образовательного внедрения.

Таблица 1 приводит протокол в эксплуатацию, преобразуя его из линейной последовательности инструкций в надёжный, ошибочно ориентированный конвейер, подходящий для использования в классах и независимых исследований. Он явно решает воспроизводимость — известную проблему в поиске вычислительных лекарств — путём внедрения критериев валидации в ключевые переходные точки. Например, подтверждение того, что остатки гистидина равномерно маркируются как «HIS» после обработки CHARMM-GUI, предотвращает тихие сбои при следующем стыковке, а проверка целостности SMILES перед кластеризацией позволяет избежать каскадных ошибок при прогнозировании ADMET. В таблице также выделен педагогический дизайн, при этом каждый совет по устранению неполадок можно применить с минимальным вычислительным опытом (например, «открыть .complex.pdb в текстовом редакторе для проверки идентификаторов цепочек»), что соответствует цели рукописи — доступности для глухих, студентов бакалавриата/магистратуры и старшей школы. Кроме того, отмечая этапы, где результаты непропорционально влияют на результаты, такие как оценка селективности с помощью сравнительных оценок PRODIGY, таблица помогает пользователям расставлять приоритеты внимания и ресурсов.

Ключевой сильной стороной этого интегрированного рабочего процесса является его способность выявлять расхождения между дополняющими вычислительными прогнозами, выявляя крайние случаи, подчёркивающие ограничения любого отдельного метода. Например, лиганд 5 для PLK1-PBD показал сильный балл CB-Dock2 Vina (−7,9 ккал/моль) и благоприятную аффинность PRODIGY (ΔG = −9 ккал/моль, рисунок 4), но не смог выполнить несколько фильтров ADMET. Он не соответствовал модели распределения абсорбции BOILED-Egg, показывал менее желательное значение плазменного клиренса (9,3 мл/мин/кг, рисунок 6), что указывало на быструю элиминацию, и был классифицирован как класс Крамера III (высокая токсичность) по версии Toxtree, содержащий пять токсикофоров (рисунок 7A). Напротив, лиганд 33 показал умеренную аффинность PLK1, предсказанную PRODIGY, (−5,4 ккал/моль), но соответствовала всем критериям ADMET, демонстрируя низкую токсичность (класс I), оптимальный LogP (0,7) и благоприятное распределение всасывания и клиренс плазмы. Несмотря на более слабую аффинность, лиганд 33 является более препаратоподобным кандидатом. Этот контраст иллюстрирует фундаментальный принцип в ранних стадиях открытия лекарств: высокая аффинность связывания недостаточно без благоприятной фармакокинетики и безопасности. В то же время такие соединения, как лиганд-5, хотя и имеют низкую эффективность ADMET, всё же могут предоставить ценные идеи для будущей оптимизации с целью повышения безопасности или метаболической стабильности без ущерба для потенции.

Хотя ранние фильтры в этом рабочем процессе предназначены для сортировки и приоритизации, а не для постоянного исключения, дальнейшее оптимизирование 50 кандидатов определяет некоторых из них как «топ-хитов», применяя желаемые ограничения, доступные в инструментах ADMET и литературе. Из 50 проверенных лигандов, оценённых по 114 ADMET-связанным и электронным дескрипторам, 13 соответствовали как минимум 95 желательных критериев свойства. Среди них шесть соединений (10, 13, 14, 32, 43 и 47) продемонстрировали как благоприятные профили ADMET-S, так и более высокую аффинность связывания с PLK1-PBD по сравнению с PLK2/3, поэтому они считаются основными кандидатами ингибиторов (рисунок 10). Сравнительный структурно-функциональный и количественный анализ сходства показал, что выявленные попадания имеют ключевые фармакофорические черты общего с известными ингибиторами PLK1-PBD, что указывает на потенциальную сходимость поведения связывания. Все попадания содержали ароматические или гетероароматические каркасы, которые отражают гидрофобные кольцевые системы TQ, Poloxin и Allopole-A, что позволяет π–π и гидрофобные взаимодействия внутри кармана PBD. Функциональное перекрытие было очевидно благодаря консервативным водородным связям (карбоксильные, амидные и карбонильные группы), аналогичные тем, что опосредуют ключевые полярные контакты в эталонных ингибиторах. Гибкие алифатические и циклические связывающие элементы, присутствующие в нескольких ударах, параллельны конформационной адаптивности аналогов Poloxin, что облегчает ориентацию на существенные остатки связывания. Количественно показатели сходства Танимото (0,36–0,54) подтвердили умеренное структурное сходство между ударами и известными ингибиторами: удары 10, 13 и 14 наиболее похожи на Полоксин, Хит 32 — на TQ, а Хиты 43 и 47 — на Аллопол-А. В совокупности эти результаты показывают явное структурное и функциональное пересечение, что указывает на то, что удары, вероятно, имитируют топологию связывания и паттерны взаимодействия валидированных ингибиторов PLK1-PBD, сохраняя при этом достаточную новизну для дальнейшей оптимизации (см. рисунок 10).

Для оценки устойчивости вычислительного рабочего процесса были проанализированы известные ингибиторы PLK1-PBD (^{Poloxinpan 14} и Allopole-A¹⁵) как положительные контрольные, при этом метформин и имеглимин (два структурно неродственных антидиабетических препарата без зарегистрированной активности PLK1-PBD) были отрицательными контролями в анализах аффинности ADMET-S, докинга и связывания. Положительные контрольные группы демонстрировали аффинность связывания –5,8 и –5,6 ккал/моль соответственно, тогда как отрицательные контроли демонстрировали более слабые аффинности — –5,1 ккал/моль (метформин) и –4,8 ккал/моль (имеглимон), что соответствует отсутствию активности связывания PBD. Интересно, что оценка ADMET-S показала, что отрицательные контроли соответствовали более желательным дескрипторам (88 из 114 свойств), чем положительные (80 из 114), что подтверждало способность рабочего процесса различать фармакокинетическую благоприятность от целенаправленного потенциала связывания. Эти привязки подчёркивают важность поддержания сбалансированной перспективы: соединения не следует преждевременно отбрасывать только на основе неоптимальных прогнозов ADMET, если они демонстрируют сильную целевой аффинность, поскольку такие каркасы всё равно могут стать ценными отправными точками для оптимизации. Напротив, молекулы с отличными фармакокинетическими свойствами, но слабым связыванием, могут служить низкорисковыми шаблонами для аналоговой разработки. Необходима дальнейшая биохимическая и клеточная валидация для подтверждения этих вычислительных наблюдений и уточнения критериев приоритизации.

Рисунок 1: Структурные сравнения между неподготовленной и подготовленной с помощью CHARMM-GUI структуры 4HCO. (A) Структура 4HCO, загруженная напрямую из PDB, выделяющая недостающие остатки. (B) Структура 4HCO по протоколу подготовки CHARMM-GUI. 4HCO (PLK1-PBD, связанный с TQ) был выбран потому, что он является одним из немногих кристаллов PLK1-PBD с органическим лигандом, что делает его напрямую применимым к открытию ингибитора малых молекул на основе структуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Анализ основных компонентов (PCA) 999 природных продуктов, совместимых с Липински, после кластеризации K-mean на основе молекулярного отпечатка и сходства Танимото. Каждая точка представляет соединение, окрашённое назначенным кластером (1–50), а кластеры сгруппированы серыми эллипсами, чтобы подчеркнуть химическое сходство. Плотная кластеризация внутри кластеров и разделение между ними свидетельствуют о том, что кластеризация на основе Танимото успешно снизила структурную избыточность, сохраняя при этом химическое разнообразие по всему набору данных. Это разнообразие гарантирует, что 50 представительных лигандов, выбранных для стыковки, охватывают широкий регион химического пространства, повышая устойчивость и обобщимость результатов виртуального скрининга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Слепое стыковка CB-Dock2 определяет позу связывания лиганда 1 с высокой аффинностью в домене поло-бокса PLK1 (PBD). Отображаемая конформация CurPocket C2 (балл Вина = −7,5 ккал/моль) представляет собой оптимальное положение среди пяти предсказанных сайтов связывания, характеризующееся благоприятными контактами ван-дер-Ваальса и водородной связью с ключевыми остатками PBD (Trp414, His538 и Lys540). Этот результат подтверждает использование структурного слепого стыкованного соединения для обнаружения биологически значимых связывающих карманов при отсутствии кокристаллизированного лиганда, демонстрируя, как рабочий процесс распределяет приоритеты поз с самой сильной прогнозируемой энергией связи для дальнейшего анализа селективности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Тепловая карта предсказанного аффинности веб-сервера PRODIGY по комбинациям белков и лигандов. Тепловая карта напрямую учитывает перекрытие лигандов при привязке к PLK1, PLK2 и PLK3. В то время как некоторые лиганды (включая лиганд 45) демонстрируют сопоставимые сродства связывания по всем трём изоформам PLK, что указывает на низкую селективность, другие (особенно лиганды 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 и 49) демонстрируют сильное предпочтение PLK1 (ΔΔG ≥ 3,0 ккал/моль против PLK2/PLK3), что соответствует цели PBD-селективного ингибирования. Количественно 20 из 50 лигандов демонстрируют почти двукратную селективность для PLK1 как по PLK2, так и по PLK3 на основе предсказанных PRODIGY ΔG значений. Это дифференциальное связывание объясняется тонкими вариациями в карманах связывания PBD, которые фиксирует протокол слепого стыковки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Представление физико-химических свойств в сочетании из ADMETlab3.0 и SwissADME. Параметры: nHD = количество доноров водорода, nHA = количество акцепторов водорода, базовый pKa, кислотный pKa, nStereo = количество стереоцентров, LogP = коэффициент n-октанола/распределения воды, LogD = коэффициент n-октанол/распределения воды при pH=7,4, LogS = водорастворимость, Fsp3 = количество sp3-гибридизированных углеродов/общее количество углеродов, и nHet = количество гетероатомов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Комбинация результатов ADME из ADMETlab3.0 и SwissADME. (A) Диаграмма ВАРЕНЫХ Яиц LogP Уайлдмана-Криппина (WLOGP ) против Топологическая полярная поверхность (TPSA) из SwissADME, отражающая проницаемость арматоэнцефалического барьера (BBB) по абсорбции и распределению в области желтого (желтка), всасывание через желудочно-кишечный тракт (HIA) в белом эллипсе, P-гликопротеиновые субстраты и несубстраты в синих и красных точках соответственно. Молекулы, находящиеся вне «яйца», считаются обладающими плохой абсорбцией и распределением. (B) Тепловая карта метаболизма с различными идентификаторами цитохрома P450 (CYP), включающая стабильность метаболизма человеческой печени (HLM), где красный является ингибиторами/субстратами, а зелёный — неингибиторами/несубстратами, оставляя зелёный как желательный. (C) Экскреция включает параметры, плазменный клиренс и период полураспада. Пунктирная красная линия указывает на желаемый плазменный клиренс (<5 мл/мин/кг), тогда как 5-15 мл/мин/кг и >15 мл/мин/кг — умеренный и высокий клиренс соответственно.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Интегрированное профилирование токсичности выявляет критические риски безопасности среди скрининговых лигандов. (A) Распределение количества токсикофоров по 50 репрезентативным натуральным продуктам, как предсказывает ADMETlab3.0. (B) Результаты токсичности для лиганда 1, указывающие токсичность класса III, выделенные красным цветом, с подробным объяснением соответствующих правил Крамера в текстовом поле ниже. Такой подход двойной оценки (токсикофоры + класс Крамера) позволяет раннее сортировать соединения высокого риска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Энергии запрещённого зазора HOMO–LUMO (в эВ) для 50 репрезентативных лигандов, полученных из натурального продукта, рассчитанных с использованием ORCA на уровне B3LYP/def2-TZVP теории. Затененная область (от 3,6 до 5,0 эВ) обозначает оптимальное окно устойчивости: зазоры ниже 3,6 эВ указывают на высокую химическую реактивность или потенциальную фотодеградацию, тогда как значения выше 5,0 эВ могут указывать на низкую электронную поляризуемость и сниженную адаптивность к связыванию. Лиганды, попадающие в этот диапазон, демонстрируют благоприятный баланс кинетической стабильности и молекулярной чувствительности, что подтверждает их приоритет как потенциальных кандидатов в ингибиторы PLK1-PBD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9: Блок-схема двуязычного вычислительного процесса поиска лекарств. Конвейер начинается с подготовки структур PBD PLK1-PLK3, затем следует скрининг базы данных SuperNatural 3.0, ориентированный на заболевания, и фильтрация по правилу пяти Липинского (молекулярная масса ≤ 500 Da, доноры водородных связей ≤ 5, акцепторы ≤ 10, LogP ≤ 5). Репрезентативные соединения отбираются после кластеризации, а затем оцениваются с помощью белок-лигандного соединения, прогнозирования аффинности связывания и комплексного профилирования ADMET-S, включая абсорбция, распределение, метаболизм, экскрецию, токсичность и оценку стабильности QM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10: Сравнительное структурно-функциональное перекрытие между ведущими кандидатами лигандов и известными ингибиторами PLK1-PBD. На рисунке выделены шесть основных кандидатов-соединений (10, 13, 14, 32, 43 и 47), выявленных в результате комбинированного виртуального скрининга, кластеризации, аффинности связывания и профилирования ADMET-S. Эти лиганды удовлетворяли как минимум 95 из 114 желательных физико-химических и фармакокинетических дескрипторов и демонстрировали более высокие аффинности связывания с PLK1-PBD по сравнению с PLK2/3. Для оценки потенциальной структурной и функциональной конвергенции каждый лиганд сравнивался с известными ингибиторами PLK1-PBD TQ, Poloxin и Allopole-A, на основе общих фармакофорических мотивов и парных коэффициентов сходства Танимото (отпечатки ECFP4). Средние показатели сходства (0,36–0,54) и распространённые функциональные группы, такие как ароматические или гетероароматические кольца, пары донор/акцептор водородной связи и гидрофобные линкеры, указывают на частичное перекрытие связывающих особенностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Этап рабочего процесса	Промежуточный контрольный пункт (как подтвердить успех)	Важный шаг (почему он определяет успех или неудачу)	Распространённые проблемы и рекомендации по устранению неисправностей
1. Подготовка целевых белков	• PDB-файл загружается без ошибок в Mol* View. • В кармане переплёта нет отсутствующих остатков (визуальный осмотр). • Остатки гистидина, помеченные как «HIS» (не HSD/HSE)	Неточная структура белка → ложные связывающие карманы → вводящие в заблуждение стыковочные позы. CHARMM-GUI обеспечивает правильное протонирование, размещение водорода и удаление вод/лигандов.	Проблема: CB-Dock2 отклоняет PDB-файл. Исправление: удалить нестандартные остатки, убедиться, что присутствует только белковая цепь, и стандартизировать имена атомов/остатков с помощью текстового редактора.
2. Фильтрация натуральных продуктов (правило 5 Липински)	• «all.csv» содержит только действительные SMILES (не пустые, химически разбираемые). • Ожидаемые совпадения (например, 999/1 193).	Некорректный SMILES вызывает сбои RDKit, док-серверов и инструментов ADMET. Фильтрация должна сохранять химическую валидность.	Проблема: скрипт не работает во время кластеризации. Исправление: Добавить валидацию SMILES с помощью Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) в Python; Зарегистрируйте и удалите недействительные записи перед продолжением.
3. Кластерная выборка	• 50 уникальных УЛЫБОК в «rep_struct.txt». • График PCA (рис. 2) показывает чёткое разделение кластеров.	Плохая кластеризация → избыточными или неразнообразными представителями → неэффективным скринингом.	Проблема: Все молекулы объединяются в одну группу. Исправление: проверьте тип отпечатков пальцев (например, Morgan/ECFP4), порог Танимото и стандартизацию SMILES. Рассмотрите возможность увеличения количества кластеров, если разнообразие низкое.
4. Стыковка между белками и лигандами (CB-Dock2)	• Каждый лиганд возвращает ≥1 файл ".complex.pdb". • Оценки Вина отрицательны (например, ≤ −5 ккал/моль). • Лиганд расположен в CurPocket (не на поверхности).	Стыковка определяет позу связывания и аффинность. Неправильная поза → ложные прогнозы PRODIGY.	Проблема: Задание проваливается, или лиганд не связан. Исправление: перетянуть лиганд в CB-Dock2 с помощью SMILES; убедитесь, что в имени файла нет специальных символов; Проверьте электронную почту для получения статуса работы. Если всё постоянно, попробуйте SwissDock в качестве резервного варианта.
5. Связывание (PRODIGY)	• PRODIGY возвращает значения ΔG для всех комплексов. • Аффинитеты коррелируют с результатами CB-Dock (Vina) (стабильность тренда).	Оценка селективности зависит от точности ΔG для PLK1 по сравнению с PLK2/PLK3. Неправильные идентификаторы цепей/лиганда → неправильные прогнозы.	Проблема: ошибка «Цепочка не найдена». Исправление: откройте .complex.pdb в текстовом редакторе; подтверждение идентификатора белковой цепи (например, «P») и названия остатка лиганда (например, «UNL»); правильно вводит данные в PRODIGY.
6. Оценка ADMET-S	• Все 50 результатов SMILES возвращаются в SwissADME, ADMETlab3.0 и ToxTree. • В выходных CSV нет строк «N/A» или «Error».	Непоследовательные данные ADMET → ошибочный рейтинг кандидатов. Платформы могут провалиться на каркасах с экзотическими натуральными продуктами.	Проблема: ADMETlab3.0 отклоняет SMILES. Исправление: канонизация УЛЫБОК с помощью RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). Для ToxTree вводите по одной молекуле за раз и проверяйте рендеринг структуры.
7. Квантовая стабильность (ORCA)	• Каждая задача ORCA завершается без «SCF не сходится» или «геометрической ошибки». • Значения HOMO/LUMO присутствуют в выходном (.out) файле.	Заборонный зазор определяет химическую стабильность/реактивность. Неудачные задания = отсутствующие данные для фильтра ключей.	Проблема: Вакансия ORCA вылетает. Исправление: переоптимизировать геометрию в Avogadro; убедитесь, что атомы не повторяются; Увеличить %maxcore или перейти на базис def2-SVP для больших молекул.
8. Интегрированная фильтрация ADMET-S	• Окончательный список лигандов соответствует всем критериям (например, LogP 0–3, заборонный разрыв 3,6–5 эВ, класс Крамера I/II). • ≥1 лиганд демонстрирует селективность PLK1 (ΔΔG ≥ 2 ккал/моль против PLK2/3).	Чрезмерно строгие или непоследовательные пороги исключают жизнеспособные лиды; Слишком мягкие пороги способствуют развитию токсичных/нестабильных соединений.	Проблема: ни один лиганд не проходит все фильтры. Исправление: Ослабьте по одному критерию за раз (например, разрешите LogP ≤ 4 или 3 токсикофора) и документируйте компромиссы. Сравните с известными препаратами для бенчмаркинга.

Таблица 1: Критические контрольные точки контроля качества, точки принятия решений с высокой эффективностью и стратегии устранения неполадок в восьмиступенчатом двуязычном вычислительном рабочем процессе для выявления селективных ингибиторов PLK1-PBD. Каждая строка соответствует основной фазе протокола — от подготовки белка до интегрированной фильтрации ADMET-S и указывает (i) как проверить успешное завершение (промежуточная контрольная точка), (ii) почему этот шаг является ключевым для общего успеха или неудачи (критический шаг), и (iii) практические решения распространённых технических сбоев (рекомендации по устранению неполадок). Эта таблица служит как дорожной картой валидации, так и учебным пособием для студентов и исследователей, внедряющих протокол в академических или ресурсно ограниченных условиях.

Дополнительный файл 1: скрипты на Python. Содержит скрипт на Python для приложения правил Липинского; скрипт Python, используемый для анализа кластеризации; скрипт Python для вычисления физико-химических свойств; скрипт R для анализа метаболизма; скрипт Python для анализа экскреции; скрипт Python для прогнозирования токсичности; скрипт Python для оценки стабильности; и SMILES-цепи из 50 проанализированных соединений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Данное исследование сосредоточено на исследовательском вычислительном рабочем процессе для выявления и оценки потенциальных ингибиторов PLK1-PBD с помощью виртуального скрининга, стыковки и анализа ADMET-S. Конвейер эффективно расставляет приоритеты соединений, исходя из прогнозируемых тенденций связывания и фармакокинетических свойств. В этом протоколе определяется набор возможных ингибиторов PLK1, оцениваются их свойства ADMET и аффинности связывания с белками PLK1–3. Протокол использует подход, ориентированный на заболевание, для выявления 50 молекул из базы данных примерно из 73 400 (рисунок 9). Затем эти 50 молекул подвергались оценке ADMET-S, в ходе которой оценивались их фармакокинетические и фармакодинамические свойства, похожесть на препарат и стабильность. Кроме того, была рассчитана их аффинность связывания с белками PLK1–3 для оценки их ингибирующей силы против PLK1 и селективности. Исходя из результатов, несколько молекул показали более желательные свойства. Последующие исследования по открытию лекарств могут выбрать исключение некоторых молекул и сосредоточиться на несколькох, а также воздержаться от ранней элиминации и использовать эти результаты на поздних этапах разработки препарата для оптимизации свойств ADMET.

Биологическая логика фокусировки на PLK1, PLK2 и PLK3 при исключении PLK4 и PLK5 основана как на структурных, так и на функциональных аспектах. PLK4 и PLK5 исключены из этой работы из-за их характерных структурных и функциональных отличий от PLK1 и ограниченной значимости для терапии рака. PLK1, характеризующийся киназным доменом и поло-бокс-доменом (PBD), играет ключевую роль в регуляции митотических событий, делая его ключевой мишенью для лечения рака⁴¹. В отличие от этого, PLK4 и PLK5 структурно различаются: PLK4 содержит криптический поло-бокс (CPB), а не канонический PBD, и функционирует преимущественно в центриолном дублировании. В то же время PLK5 не имеет функционального киназного домена и экспрессируется почти исключительно в^{мозге 3}. Учитывая их минимальное структурное пересечение с PLK1-PBD и незначительную значимость для митотической дисрегуляции при раке, их включение не могло бы существенно повлиять на селективность ингибиторов PLK1-PBD. Таким образом, стратегия скрининга предлагает биологически релевантную и вычислительно доступную рамку для оценки селективности. Важно, что шесть ведущих кандидатов лигандов (10, 13, 14, 32, 43 и 47) демонстрировали даже более благоприятные энергии связывания и профили ADMET-S, чем известные ингибиторы TQ и Allopole-A, что выделяет их как потенциальные модуляторы PLK1-PBD.

Для поддержки надёжной реализации, особенно студентами или исследователями, впервые знакомыми с вычислительными инструментами для поиска лекарств, в Таблице 1 приведен обзор ключевых контрольных точек (также в разделе Протокол), критические шаги и руководство по устранению неполадок для рабочего процесса. Таблица поддерживает адаптивность; например, если у пользователя нет доступа к HPC, он может отметить, что анализ устойчивости ORCA можно отложить, а если веб-сервер не работает, предлагаются альтернативы, такие как SwissDock. Такая гибкость обеспечивает жизнеспособность рабочего процесса в различных институциональных контекстах, сохраняя научную строгость и укрепляя новизну исследования как инклюзивного, двуязычного и образовательного вклада в ранние стадии открытия лекарств. Хотя весь рабочий процесс спроектирован как интегрированный конвейер, несколько ключевых этапов определяют его успех или неудачу (см. Таблицу 1). Кроме того, в приложенном видео есть синхронизированные английские субтитры и жестовый язык американского жестового языка (ASL), разработанный для обеспечения равного доступа без отвлекающих факторов. Инструкции подписанта временно согласованы с действиями на экране, например, подпись «далее», затем пауза, когда курсор нажимает кнопку «Далее». Во время этапа подготовки 4HCO подписчик использует маркировку пальцами («A» и «B») для выбора цепочки, что точно отражается в записи на экране. В сегменте с показом SuperNatural 3.0 окно подписчика меняет размер и перемещается в верхний правый угол, при этом внимание направляется на иконку «пути», остановившись на паузу, когда курсор следует. Эти дизайнерские решения обеспечивают глухим и слабослышащим зрителям такое же интегрированное руководство в реальном времени, как и слышащие, эффективно воспроизводя очную лабораторную работу под руководством инструктора.

Помимо преимуществ, существует множество способов улучшить рабочий процесс. Во-первых, начальную фильтрацию можно изменить; Вместо методов, ориентированных на болезни и кластерного отбора проб, можно начать с симуляций соединения всех молекул в базе данных натуральных продуктов, чтобы определить, какие соединения лучше всего подходят для связывания белков с лигандом. Кроме того, для точного прогнозирования аффинности связывания необходимы более подробные оценки.  Расчёты аффинности белок-лиганд в PRODIGY с «отсутствием электростатических» включают подбор подсчетов категоризированных типов атомных контактов, участвующих во взаимодействии (углерод-углерод, азот-азот, кислород-кислород и другие атомы) в обученной многолинейной регрессионной модели с четырёхкратной перекрёстной валидацией, и этот метод значительно коррелировал с экспериментальными аффинностями в различных^{случаях 42,43}.  Могут применяться альтернативные подходы, такие как^{FoldX 44}, fastDRH⁴⁵, модели глубокого^{обучения 46} и MD с продвинутым выборкой, при этом ожидается разная степень согласованности предсказаний в зависимости от точности каждого^{метода 47}.

Ещё один аспект — различные программные инструменты, используемые в оценке ADMET-S, генерируют множество метрик, и понимание каждого показателя, используемого для оценки кандидатуры на лекарства, крайне важно. Один из способов обеспечения точности — подвергнуть несколько препаратов на рынке протокола, чтобы определить, как они соответствуют этим пороговым требованиям.  В этом контексте токсичность требует дальнейших исследований, поскольку молекулы не отбрасываются исключительно на основе профилей токсичности из тонких деревьев решений, таких как правила Крамера, поскольку многие доступные лекарства имеют схожие классификации.  Количество токсикофоров также не даёт полной информации о токсичности, даже в сочетании с профилями токсичности.  В этом контексте расширением этого процесса стало бы проведение сравнительных обзоров малых молекулярных образцов с доступными лекарствами для обоснования интерпретаций.  Например, исследователи ссылались на предыдущую литературу, документирующую применение и наблюдения расчётов DFT в современных препаратах от рака молочной железы, таких как^{Tamoxifen 48},^{Letrozole 49} и Cisplatin⁵⁰, при интерпретации стабильности, определяемой расчётами QM значений запрета HOMO–LUMO. Ранее похожие рабочие процессы применялись для выявления потенциальных ингибиторов различных целей заболеваний/^{расстройств 51}. В последнее время Стаффорд и ^др.6 рассмотрели стратегии проектирования ингибиторов PLK1-PBD и терапевтические возможности при раке. Последние исследования выявили ингибиторы двойного таргетинга против PLK1-PBD и PLK4-PB3 с использованием структурно управляемого фармакофорного моделирования, виртуального скрининга, молекулярного стыковки, симуляции молекулярной динамики (MD) и биологической^{оценки 52}. Чжоу и др. также выявили ингибиторы PLK1-PBD из библиотеки морских натуральных продуктов с использованием 3D фармакофора QSAR, ADMET, скакающих каркасов, молекулярного стыкованного соединения и MD⁵³.

В целом, новизна этого исследования четырёхкратна. Во-первых, это двуязычный вычислительный протокол, реализуемый как на американском жестовом языке, так и на английском языках, что способствует доступности и инклюзивности в STEM, особенно для глухих и слабослышащих студентов и исследователей. Такое двуязычное обучение редко встречается в компьютерных исследованиях лекарств и соответствует миссии Университета Галлодет по внедрению справедливого научного образования. Во-вторых, хотя PLK1 остаётся убедительной мишенью для противораковых средств, строгие вычислительные исследования, оценивающие селективность по PLK1, PLK2 и PLK3 с использованием интегрированных структурных, энергетических и ADMET-S критериев, редки. Большинство предыдущих исследований сосредоточены исключительно на ингибировании киназных доменов или не имеют сравнительного селективного профилирования. Эта работа устраняет этот пробел, предоставляя начальный, исследовательский протокол параллельного скрининга против трёх PLK-PBD с фильтрами, которые приоритизируют соединения на основе высокой аффинности PLK1 и минимального внецелевого связывания. В-третьих, рабочий процесс был разработан с учётом эффективности и удобства использования, особенно для образовательных и ограниченных ресурсов условий. Весь процесс от фильтрации базы данных до оценки ADMET-S можно завершить за две недели на стандартном академическом оборудовании (ноутбук с 8 ГБ оперативной памяти), используя бесплатное веб-программное обеспечение (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). Расчёты стыковки и аффинности связывания не требуют времени (~30 секунд на лиганд). Самый трудоёмкий этап — анализ стабильности квантовой механики с помощью ORCA, который можно отложить на более поздние этапы или выполнить на высокопроизводительных вычислительных ресурсах, как показано. Скрипты модульные и требуют лишь базовой командной строки или правки Jupyter Notebook, что обеспечивает бесшовную интеграцию в существующие учебные программы. Время выполнения скромное, фильтрация баз данных и соответствие требованиям Липински занимает протоколы; Кластеризация ~1 000 молекул завершается менее чем за 30 минут на типичном рабочем столе. Все программные инструменты доступны бесплатно для академического использования, кроссплатформенного режима (Windows, macOS, Linux) и не требуют коммерческих лицензий, что значительно снижает барьеры для входа. В-четвёртых, выявленные лиганды демонстрируют многообещающие сродства связывания, соответствующие взаимодействиям в наномолярном диапазоне, а также благоприятную породность препарата, метаболическую стабильность и низкий уровень токсичности. Несколько кандидатов представляют собой прочные, селективные связывающие PLK1-PBD с желательными свойствами ADMET-S, что требует дальнейшей проверки через молекулярно-динамические симуляции или in vitro анализы.

Таким образом, помимо методологической полезности, это исследование иллюстрирует, как доступные, открытые и эффективные вычислительные инструменты могут быть использованы в качестве отправной точки для решения важной биомедицинской задачи, одновременно способствуя инклюзивному научному обучению. По мере того как ингибиторы PLK1-PBD продолжают набирать популярность в онкологии, этот рабочий процесс предоставляет воспроизводимый, образовательный план для ранних стадий открытия лекарств. Его универсальность делает его подходящим для средней школы, бакалавриата и магистратуры, а также обеспечивает отличную основу для CURE, предоставляющих студентам подлинные, практические возможности для исследований. В отличие от конвейеров, основанных исключительно на докинге киназного домена или скрининге одного белка, этот подход одновременно оценивает селективность PBD в PLK1–3, что необходимо учитывая их структурную гомологию >38% и разные биологические роли. Кроме того, объединяя кластеризацию, ADMET-S и стабильность квантовой механики в рамках открытого доступа, риск избыточности и утраты снизился по сравнению с методом виртуального отбора.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ADMETLab3	Симуляции плюс. Inc	V3.0	Свойства ADMET
Alphafold	Погуглите DeepMind & Isomorphic Labs (дочерние компании Alphabet)	V3.0.1	3D-моделирование белков
Анаконда/Конда	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Система управления пакетами с открытым исходным кодом;
CB-Dock2	Лаборатория Ян Цао	V2.0	Белок-лиганд слепое стыковки
ЧАРММ-ГУЙ	Университет Лихай	V3.8	Биомолекулярная манипуляция и симуляция
ДАРВИН на ACCESS	Университет Делавэра	Н/Д	Высокопроизводительные вычисления
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Пакет квантовой химии
Белковый банк данных	Всемирный банк данных о белках	RRID:SCR_006555	База данных белков
RDKit	Открытый исходный код	RRID:SCR_014274	Программирование в химиинформатике
Сверхъестественное 3.0	Институт физиологии и науки — IT (Берлин)	V3.0	Библиотека естественных молекул
SwissADME	Швейцарский институт биоинформатики	RRID:SCR_017865	Свойства ADME
Токстри	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Классификация токсичности