Методическая статья

Оценка РНК, содержащей теломерные повторы, из гибридных комплексов ДНК/РНК

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет выделить гибриды ДНК:РНК и их связанные РНК (включая TERRA) в нескольких тканях. Хотя наш подход охватывает часть гибридных взаимодействий, для полной характеристики генома потребуется дополнительное геномное картирование.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК, содержащая теломерные повторы (TERRA), — это длинная некодирующая РНК, транскрибираемая из всех теломер у высших эукариот, и только часть этих молекул образует стабильные гибриды ДНК/РНК на теломерах. Мы разработали подробный молекулярный протокол для выявления и очистки этих гибридных оценок. Этот упрощённый метод позволяет напрямую экстракцию гибридных взаимодействий ДНК/РНК, естественно формирующихся in vivo , и может применяться для обнаружения всех таких областей. Минимизируя процедурные этапы, этот метод обеспечивает высокую эффективность для выделения РНК, прикреплённой к ДНК, оценивая надёжность и воспроизводимость последующей секвенации. Реагент гуанидин изотиоцианата используется для полного лизиса и гомогенизации клеток, сохраняя целостность нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), особенно гибридов ДНК/РНК. Добавление хлороформ инициирует фазовое разделение посредством центрифугирования (три отдельных слоя): нижняя фаза фенол-хлороформ, межфаза и верхняя водная фаза. РНК, высвобождаемая как из ядра, так и из цитоплазмы, сохраняется в водной фазе, тогда как ДНК с высоким молекулярным весом, включая гибридные области ДНК/РНК, ограничивается межфазой. При изопропиловом спирте, за которым следует центрифугирование, извлекаются водная фаза (свободная РНК), межфаза и ДНК, особенно гибриды ДНК/РНК. Для удаления оставшихся следов белков образец инкубируется с помощью протеиназы K. Обработка используется ДНКазой, экстракцией фенол/хлороформа, изопропиловым спиртом и центрифугированием для выделения РНК, гибридизированной в ДНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипция генома приводит к образованию временных гибридных молекул, известных как R-петли, состоящих из трёхцепочечных структур. К таким структурам относятся некодирующие и кодирующие цепи ДНК, при этом некодирующая цепь вытесняется гибридами с комплементарнойРНК-1. Во время транскрипции генома из обеих цепочек ДНК образуется большое количество некодирующих РНК с разной скоростью. Большинство этих РНК служат кратковременными промежуточными, но некоторые играют ключевую роль в регуляторных сетях, управляющих биологией генома, особенно те, что происходят из некодируемых областей, таких как теломеры ицентромеры 1. Распределение гибридов ДНК/РНК в геноме также может отражать транскрипционную активность клеток в любой момент времени.

По мере роста интереса к регуляторным функциям некодирующих РНК возрастает интерес к отслеживанию их транскрипции и распределения по геному, особенно в виде временных гибридов ДНК/РНК. Для решения этой проблемы мы разработали независимый анализ для обнаружения стабильных гибридов ДНК/РНК, применимый к любой биологической клетке или ткани. Этот метод позволяет выделить комплементарные РНК, которые совместно очищаются с ДНК, а затем проводить анализ с помощью ПЦР-осадки или секвенирования.

Исследования на моделях клеточной культуры показали, что во время репликации и транскрипции ДНК могут возникать репликационные стрессы, повреждение ДНК, столкновения репликационных вилок и паузы РНК-полимеразы II из-за топологических, структурных и гибридизационных событий. Эти процессы, особенно размотывание двойной спирали ДНК, вызывают крутильное напряжение, что может привести к образованию аномальных структур, таких как R-петли, во времятранскрипции 1.

Большинство данных R-петли были получены с использованием дрожжей или культивированных раковых клеток, опираясь на ДНК-РНК-гибридно-специфический моноклональный антитело S9.6. Структурные исследования показали, что антиген-связывающий фрагмент (Fab) S9.6 связывается специфически с гибридным РНК-ДНКдуплексом 1 размером 13.. Обнаружение R-петель с помощью антител в основном выявляло гибриды, образующиеся в регионах, богатых гуанином во время транскрипции, где, вероятно, происходит усиленная гибридизация РНК и ДНК. Исследования in vitro с использованием антитела S9.6 показывают, что РНК, содержащие четыре и более последовательных гуанина у 5′-конца, обнаруживаются легче, что коррелирует с увеличением образованияR-петли 1. Различные ферменты, такие как геликазы, топоизомерады, РНаза H1 и РНаза H2, помогают поддерживать баланс R-петли во время транскрипции. Нарушение гомеостаза R-петли связано с повышением геномной нестабильности, способствующей развитию таких заболеваний, как рак и нейродегенеративныезаболевания 2.

Теломеры, ранее считавшиеся транскрипционно незаметными, были обнаружены способностью транскрибировать длинные некодирующие РНК, известные как теломерная РНК, содержащая повторы (TERRA)3. Эти транскрипты происходят из субтеломерных областей и содержат теломерные повторы, играя важную роль в поддержании гомеостазателомер 4. В этой рукописи мы называем «TERRA-гибридную РНК» молекулами РНК, высвобождаемыми из гибридных комплексов ДНК/РНК с помощью обработки ДНКазой I, предположительно включающей последовательности TERRA на основе свойств экстракции и специфичности праймера.

Транскрипция TERRA происходит в направлении центромер в теломер и имеет изменчивую длину — от 100.. до 9 кб, при этом большая часть TERRA извлекается в водной фазе в виде свободной РНК-молекулы. Небольшая часть остаётся прикреплённой к ДНК и связана с ключевыми биологическими процессами, такими как рак и старение 4,5 лет. Уровни TERRA варьируются в зависимости от субтеломерных локусов и регулируются гетерохроматическим состояниемтеломер 6. Исследования клеточной культуры также показывают, что транскрипты TERRA из различных субтеломерных областей имеют гетерогенность по длине. В некоторых исследованиях клеточной культуры, полученной из опухолей, учёные обнаружили, что субтеломерная область 20q является основным источником транскриптов TERRA, и эта область часто метилируется на своих CpG-островках 7,8,9. У мышей субтеломерная область хромосомы 18 является основным местом производства TERRA10,11. Кроме того, PAR-TERRA, являющиеся транскриптами TERRA, происходящими из псевдоаутосомных субтеломерных областей в эмбриональных клетках, показали до 200 раз больше TERRA по сравнению с хромосомами18 11,12.

Транскрипция TERRA контролируется метилированием ДНК и модификациями гистонов, такими как триметилирование H3K9 и H4K20, которые подавляют TERRA, тогда как гистонацетилирование положительно коррелирует с транскрипциейTERRA 6,13,14. TERRA также связывается с экстрателомерными областями, включая межгенные участки и интроны, что указывает на более широкую роль в регуляциигенома 2.

Кроме того, истощение TERRA приводит к нарушению регуляции многих генов, особенно тех, что находятся рядом с местами связывания, что указывает на его роль в эпигенетической регуляции хроматина и экспрессиигенов 2. Накопление TERRA на укороченных теломерах способствует гомологичному рекомбинационному (HR) расширению теломер, способствуя гомеостазу длинытеломер 15,16.

Чтобы разобраться с ролью TERRA и других гибридов ДНК/РНК, мы использовали специально разработанный анализ для выделения молекул РНК, стабильно гибридизированных с ДНК. Кратко времени ядра были выделены и обработаны РНазой без ДНКазы для удаления незащищённой РНК. Гибриды ДНК/РНК затем экстракцировались с помощью селективного ДНКазного расщепления, которое высвобождает РНК, изначально гибридизированную с ДНК. Эта фракция, называемая «ДНК/РНК-гибридно-ассоциированная РНК», впоследствии была проанализирована с помощью RNA-seq и сравнивалась с общей растворимой РНК, полученной стандартной экстракциейфенол-хлороформа 17. Этот подход позволил нам идентифицировать как теломерные, так и нетеломерные участки формирования гибридов РНК-ДНК, а также сравнить транскриптомические профили ДНК-связанных и растворимых РНК-пулов. Ранее считавшийся лишь побочным продуктом транскрипции теломер, TERRA теперь признан своей двойной ролью в поддержании теломер, влияя на активность теломераз и гомологичную рекомбинацию, что имеет решающее значение для гомеостаза длины теломер. Кроме того, достижения в анализах обнаружения позволили более детально понять динамические взаимодействия между РНК и ДНК по всему геному. Эти знания открывают путь для дальнейшего изучения последствий гибридов ДНК/РНК, таких как TERRA, в клеточных процессах и их потенциальных связей с такими заболеваниями, как рак и нейродегенеративные заболевания. Текущие исследования в этой области, несомненно, углубят наше понимание геномной регуляции и её значимости для здоровья и заболеваний.

Метод, используемый для идентификации молекул TERRA и гибридов ДНК/РНК в этом исследовании, является тем же оптимизированным протоколом экстракции гуанидиния-тиоцианата-фенол-хлороформа, описанным здесь. Этот протокол был разработан для обеспечения одновременного выделения гибридов РНК-ДНК/РНК, общей РНК и геномной ДНК в едином рабочем процессе. Стратегически модифицируя классический трёхфазный метод разделения, этот протокол облегчает селективное удержание гибридов ДНК/РНК на межфазе фенола, минимизируя их потерю — внутреннее ограничение традиционных методов экстракции.

Традиционно обнаружение и выделение гибридов ДНК/РНК основывались на иммунопреципитации с помощью моноклонального антитела S9.6, которое специально распознаёт гибридные структуры ДНК/РНК 18,19. Этот подход на основе S9.6, хотя и широко используется, может быть ограничен доступностью антител, стоимостью и потенциальной перекрёстной реактивностью. В отличие от этого, наш протокол предлагает экономичную, независимую от антитела альтернативу, которая легко применима как к клеточным, так и к тканевым образцам.

Для дальнейшего повышения чистоты и структурной целостности изолированной гибридной фракции ДНК/РНК мы включили протеиназную K-опосредованную депротеинизацию, а затем обработку DNase I. Шаг ДНКазы I избирательно переваривает цепь ДНК гибридов ДНК/РНК, тем самым высвобождая гибридизированную РНК для последующего выделения и дальнейшего молекулярногоанализа 20. Такой подход гарантирует, что обнаруженные виды РНК именно те, которые были стабильно гибридизированы с ДНК in vivo. Благодаря модульной конфигурации и масштабируемости наш протокол в целом адаптируется к различным биологическим контекстам, предоставляя исследователям надёжный инструмент для изучения гибридной биологии ДНК/РНК в широком спектре экспериментальных систем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные протоколы с участием животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Эрджиес (номер лицензии 19-07-2019, решение No 19/127). В этом исследовании использовались мыши Balb/c : пять здоровых самок в возрасте 6 недель (25 г) и пять самцов 8 недель (30 г). Мыши ухаживались и лечились в соответствии с Принципами ухода за лабораторными животными (европейские правила). Представленное здесь исследование использовало образцы крови 13 здоровых контрольных участников, полученные в рамках предыдущего исследовательского проекта, который получил этическое одобрение Комитета по человеческой этике Университета Эрджиес (Решение No 17/002). Графическая аннотация этого протокола приведена на рисунке 1. Используйте материалы без РНазы и асептические методы на всех этапах для минимизации деградации РНК.

1. Мышиное разведение

  1. Для определения подходящей дозировки анестетика для эвтаназии взвешивайте каждую мышь и вводите кетамин в дозе 60 мг/кг и ксилазин 10 мг/кг через инъекцию внутрибрюшинного мозга.
  2. После введения анестезии подтвердите полный наркоз по отсутствию рефлектора отмены педали (защемление пальца) и реакции на тактильную стимуляцию. После подтверждения анестезии проводите эвтаназию с помощью вывиха шейки матки.

2. Человеческие образцы

  1. После скрининга выбирают участников в качестве здоровых контрольных групп для исключения хронических заболеваний (таких как диабет, сердечно-сосудистые заболевания, гипертония или рак), острых инфекций, аутоиммунных или воспалительных заболеваний, неврологических или психиатрических заболеваний, а также недавнего применения рецептурныхпрепаратов 17.
  2. Возьмите образцы биопсии кожи из области за коленом (подколенной ямке) каждого добровольца с помощью инструмента для пробивания диаметром 2 мм. Вводите местную анестезию подкожно перед процедурой и проводите все биопсии в стерильных условиях.

3. Экстракция гибридов ДНК/РНК из всех типов клеток

  1. Сбор тканей и лизис
    1. Для каждой экстракции используйте 500 мкл сердечной крови, целый гипоталамо-гипофизный комплекс, всю надпочечницу или взятый образец спермы от одной мыши.
    2. Переместить все собранные образцы в стерильные пробирки объёмом 1,5 мл. Добавьте 500 мкл фенола в каждую трубку. Тщательно возьмите образцы крови из вихря для смешивания.
      1. Для образцов тканей полностью гомогенизируйте с помощью шприца диаметром 2 мм, пока не останется видимых фрагментов.
    3. Поместите трубки на охлаждающий блок для поддержания целостности образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда соблюдайте лабораторные правила безопасности при работе с опасными реагентами, такими как фенол, хлороформ и ацетат аммония.
  2. Фазовое разделение
    1. Добавьте 180 мкл хлороформ в каждую трубку и кратковременно прокрутите вихрь для смешивания. Инкубировать трубки на льду в течение 15 минут для разделения фаз.
    2. Осмотрите образцы — убедитесь, что водная фаза прозрачна. Если фаза мутная, снова втяните в вихрь и вернитесь в лёд ещё на 5 минут.
    3. Центрифуга берёт образцы при 12 000 × г, 4 °C в течение 15 минут.
  3. Осадки РНК
    1. Аккуратно перенесите прозрачную водную фазу в новую стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, установленную на охлаждающий блок.
    2. Добавьте равный объём (1:1) изопропанола в водную фазу, кратковременно прокрутите вихрь для смешивания и инкубируем на льду в течение 15 минут.
    3. Центрифуга при 12 000 × г, 4 °C в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-гранула должна быть видна внизу трубки.
  4. Промывка РНК-гранулы
    1. Аккуратно переверните трубку, чтобы выбросить супернатант, не трогая гранулу.
    2. Добавьте 1,5 мл этанола 70% в пеллет. Аккуратно постукуйте по тюбику 5 секунд, чтобы стирать.
    3. Центрифуга при 7 500 × г, 4 °C в течение 5 минут.
    4. Инвертируйте трубку, чтобы сбросить супернатант. Повторите промывку этанолом два раза (всего три раза).
  5. Очистка РНК
    1. После финальной промывки этанолом переверните трубку и дайте остаткам этанолу высохнуть на воздухе или аккуратно удалите с помощью пипетки.
    2. Добавьте 100 мкл воды без РНазы в РНК-гранулу и аккуратно поднимайте и опускайте трубку, чтобы полностью восстановить РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите образцы РНК на льду или охлаждённой решетке/охлаждающем блоке, чтобы предотвратить разрушение.
  6. Количественная оценка и хранение РНК
    1. Поместите трубку с ресуспензионной РНК на лёд.
    2. Измеряйте концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра. Зафиксируйте поглощение на 260 нм (A260) для определения концентрации РНК. Оцените чистоту, рассчитав соотношения A260/A280 и A260/A230.
    3. Для последующих приложений используйте только образцы РНК с соотношением A260/A280 от 1,9 до 2,1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании типичная концентрация РНК варьировалась от 100 до 180 нг/мкл.
    4. Храните образцы РНК при −80 °C до дальнейшего использования.
  7. Удаление белков и выделение ДНК
    1. После выделения РНК сохраняйте интерфазу этапа экстракции фенолов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим, потому что в межфазе содержится ДНК, которую можно дополнительно обработать для выделения ДНК после добавления и центрифугирования фенолов.
    2. Продолжите экстракцию ДНК, следуя шагам 3.2.1-3.4.1, начиная с интерфазы как исходного материала. Аккуратно перенесите всю интерфазу (содержащую ДНК) от экстракции фенолов в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, хранящуюся на охлаждающей решётке.
    3. Переваривание белка: Добавить в пробирку 0,5 мл буфера лизиса (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 100 мМ EDTA; 0,1% SDS; 400 мкг/мл протеиназы K) в пробирку. Инкубировать на ночь при 56 °C для переваривания белков.
    4. Осаждение ДНК с солью
      1. На следующий день добавьте 100 мкл ацетата аммония 5 м в каждый образец и ненадолго перемешайте. Центрифуга при 1 788 × г в течение 20 минут при комнатной температуре.
      2. Аккуратно перенесите прозрачную водную фазу в новую стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте равный объём изопропанола молекулярно-биологического класса (соотношение 1:1) в водную фазу, перемешайте плавным инверсией и центрифугите при 1 788 × г в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант, не нарушая ДНК-гранулу.
      3. Промыйте ДНК-гранулу 1 мл этанола 70%, затем центрифугите при 1 788 × г в течение 10 минут.
      4. Удалите и выбросьте этаноловый раствор. Дайте ДНК-грануле ненадолго высохнуть на воздухе.
      5. Засохшую ДНК-гранулу суспензировать в 50 мкл воды без нуклеазы.
  8. Удалите свободную нуклеиновую кислоту для очистки ДНК:
    1. Загрузите растворённую ДНК на спин-колонну ДНК. Центрифугуйте при 15 000 × г на 15 секунд и сбросьте поток.
    2. Промыйте колонку дважды 70% этанола, центрифугая каждый раз по 1 минуте при 15 000 × г. После каждой мойки сбрасывайте пролив.
    3. Перенесите спин-колонку в чистую сборную трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте 30 мкл воды без нуклеазы в матрицу столбца, инкубируем при комнатной температуре в течение 5 минут, затем центрифугировать 1 минуту при 15 000 × г для элюирования ДНК.
    4. Поместите элюированную ДНК на лёд. Разделите образец на две пробирки: одну для хранения ДНК при 4 °C, вторую аликвот для последующего экстракции гибридов ДНК/РНК.
  9. Экстракция РНК, прикреплённой к ДНК (гибриды ДНК/РНК)
    1. Обработка DNase
      1. Приготовьте смесь для переваривания ДНКазы, соединив 5 мкл (15 U) DNase I и 75 мкл 10x буфера для переваривания DNase.
      2. Добавьте 80 мкл ДНКазной смеси в высушенную ДНК-гранулу. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 15 минут.
    2. Экстракция фенолхлороформ
      1. Добавьте в образец 300 мкл фенола и инкубируете при комнатной температуре в течение 5 минут.
      2. Добавьте в смесь 180 мкл хлороформ и инкубируем ещё 5 минут при комнатной температуре.
      3. Центрифугу на максимальной скорости (например, 15 000 × г) в течение 10 минут при 4 °C для разделения фаз. Аккуратно перенесите верхнюю водную фазу (содержащую гибриды РНК:ДНК) в новую трубку.
  10. Гибридная изоляция ДНК/РНК
    1. Завершить выделение гибридов ДНК/РНК с этапов 3.3 по 3.5.2.
    2. Добавьте равный объём (1:1) изопропанола в водную фазу, кратковременно прокрутите вихрь для смешивания и инкубируем на льду в течение 15 минут.
    3. Центрифуга при 12 000 × г, 4 °C в течение 15 минут. Ищите РНК-гранулу внизу трубки. Аккуратно переверните трубку, чтобы выбросить супернатант, не трогая гранулу.
    4. Добавьте 1,5 мл этанола 70% в пеллет. Аккуратно постукуйте по тюбику 5 секунд, чтобы стирать. Центрифуга при 7 500 × г, 4 °C в течение 5 минут. Инвертируйте трубку, чтобы сбросить супернатант. Повторите промывку этанолом два раза (всего три раза).
  11. Очистка РНК:
    1. После финальной промывки этанолом переверните трубку и дайте остаткам этанолу высохнуть на воздухе или аккуратно удалите с помощью пипетки.
    2. Добавьте 30 мкл воды без РНазы в гибридную гранулу ДНК/РНК и аккуратно пипетируйте вверх и вниз или перемещайте трубку, чтобы полностью восстановить РНК.
    3. Храните образцы гибридов ДНК/РНК при −80 °C до дальнейшего использования.

4. Синтез кДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте целостность РНК, кДНК и ДНК, используя материалы без РНаз/ДНКазы и храня образцы на льду на протяжении всей процедуры.

  1. Для каждого образца используйте 6 мкл (20 нг РНК; выделено в шаге 3.6.5 для свободной РНК или шаге 3.13.3 для гибридной РНК ДНК/РНК). Перенесите необходимый объём РНК в маркированные ПЦР-трубки.
  2. Подготовьте мастер-микс для синтеза cDNA согласно инструкциям производителя набора. Для каждой реакции убедитесь, что мастер-смесь содержит обратную транскриптазу, dNTP, праймеры, буферы и ингибиторы РНаз. Для каждой реакции комбинируйте 14 мкл мастер-смеси с 6 мкл образца РНК в ПЦР-пробирке (общий объём: 20 мкл на реакцию). Включить хотя бы один контроль без обратной транскриптазы (-RT), подготовив параллельную реакцию без добавления фермента обратной транскриптазы, используя то же количество РНК.
  3. Проведите синтез cDNA в тепловом циклере с использованием температурной программы, указанной в Таблице 1.
  4. Разведите полученную кДНК в 1:5 безнуклеазной водой и храните при −80 °C до проведения qPCR-анализа.

5. Определение уровней экспрессии TERRA с помощью Q-PCR

  1. Приготовьте смесь qPCR с использованием комплекта на основе SYBR Green, следуя инструкциям производителя. Для каждой реакции комбинируйте 1 мкл SYBR Green Master Mix, 0. мкл переднего грунта для TERRA (см. таблицу 2), 0 мкл обратного грунта для TERRA (см. b) и мкл воды без нуклеаз.
  2. В каждую скважину 96-луйной qPCR-пластины подают 16 мкл реакционной смеси.
  3. Добавьте 4 мкл разбавленной кДНК (с шага 4.6) в каждую скважину для итогового объёма реакции 20 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца включайте как минимум две технические и две биологические реплики. Включать контроли без шаблонов (NTC) для проверки на загрязнение и контроли без обратной транскриптазы для обеспечения специфических сигналов, полученных из РНК.
  4. Выполните qPCR с использованием температурной программы, указанной в таблице 3.
  5. Нормализуйте экспрессию TERRA до β-актина (ген, который ведёт хозяйство) с помощью метода 2-ΔΔCt .

6. Определение длины теломер

  1. Подготовьте смесь qPCR для измерения длины теломер 21. Для каждой реакции комбинируют 1 мкл SYBR Green Master Mix, 0. мкл теломерного прямого праймера (см. таблицу 2]), 0. мкл теломерного обратного праймера (см. таблицу 2) и мкл безнуклеазной воды.
  2. В каждую ямку 96-ядочной qPCR-пластины впустите 16 мкл смеси теломерных реакций.
  3. Добавьте 4 мкл геномной ДНК (начиная с шага 3.10.5) в каждую яму, чтобы получить итоговый объём реакции 20 мкл.
  4. Выполнять qPCR в соответствии с соответствующими параметрами программы, указанными производителем (см. таблицу 3).
  5. Параллельно организуйте реакции для однокопийного эталонного гена (36B4) с использованием тех же концентраций и конечного объёма.
  6. Стандартные кривые были получены с использованием последовательных разбавлений синтетического теломерного олигонуклеотида (Таблица 2) для оценки относительной численности и эффективности амплификации. Абсолютная количественная оценка не проводилась. Относительная длина теломер рассчитывается как отношение T/S (число повторяющихся копий теломер к однократному номеру гена) с помощью методаΔCt 21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы количественно оценили и сравнили уровни свободного TERRA, гибридного TERRA ДНК/РНК и длины теломер в нескольких тканях мышей (кровь, сперматозоиды, кожа, гипоталамус, гипофиз, надпочечники), а также в образцах крови и кожи человека, чтобы изучить специфическую динамику тканей и связь с биологией теломер. Свободная TERRA была выделена из водной фазы после экстракции фенолхлороформата (шаги протокола 3.6.1-3.6.5), обо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная сила представленного здесь протокола заключается в поэтапном извлечении и различии свободного гибрида TERRA и ДНК/РНК из сложных образцов тканей. Критически важными этапами является аккуратное разделение водных и межфазных фракций при извлечении фенол-хлороформа, поскольку перекрёстное загрязнение может запутать различие между свободным и гибридным TERRA. Последующее лечение интерфазной фракции ДНКазой I также имеет решающее значение: недостаток пищеварения может сделать ДНК-свя...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Научно-исследовательскому подразделению Университета Эрджиес за поддержку этой работы с грантовыми номерами TYL-2019-9224 и TSA-2022-11929.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл ПЦР-трубок Грейнер671201
Трубки Falcon объёмом 15 млIsolab078.02.001
Шприц объёмом 2 млХаятН/Д
96- Многозарядная пластинаГрейнер50-720-3203
Абсолютный этанолMerck1070172511
Амонний ацетатSigma238074-500G
Набор для синтеза cDNAРош07 912 439 001
ХлороформMerck1024451000
DNAse I Kit ЗимоE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Стеклянная бутылкаIsolabЛБ. IS.061.01.901
Градуированный цилиндрIsolab  015.01.901
Гуанидин изотиоцианат SigmaG9277-100G
ИзопропональныйMerck1096342511
Light Cycler 480 IIРош5015278001
Микроцентрифугные трубки (1,5 мл)Грейнер616201
Микропипетты (10 & micro; L)ГилсонFD10001
Микропипетки (100 & micro; L)ГилсонFD10004
Микропипетки (1000 и микро; L)ГилсонFD10003
Микропипетки (2 и микро; L)ГилсонGFAM00064
НанодропСимадзуC101-E112
Планшет PBSSigmaP4417-50TAB
ПЦР-устройствоSensoquestT3-0140
Базовый вектор PGL3Promega #212936
Наконечники пипетт (10 и микро; L, 200 и микро; L, 1000 и микро; L)Грейнер772352
Пластиковые чашки ПетриГрейнер627102
Протеиназа KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Серологический пипеттГрейнер760107
ВращениеГилсонPMC880
Сибр Грин МастерРош4707516001
ТермомиксерЭппендорф#5355
База ТризмыSigma1503-1KG         
ТризолBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerХайдольф543-12310-00-6
ВихрьХайдольф541-10000-00-1
Колонки Zymo-Spin IЗимоC1003-50

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. F., Wang, G. G. R-loops: formation, function, and relevance to cell stress. Cell Stress. 3, 38-46 (2019).
  2. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  3. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat-containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  4. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  5. Oliva-Rico, D., Herrera, L. A. Regulated expression of the lncRNA TERRA and its impact on telomere biology. Mech Ageing Dev. 167, 16-23 (2017).
  6. Azzalin, C. M., Lingner, J. Telomeres: the silence is broken. Cell Cycle. 7, 1161-1165 (2008).
  7. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Finding a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry: a protective structure for telomere end. Bioorg Med Chem. 22, 4419-4421 (2014).
  9. Montero, J. J., López De Silanes, I., Graña, O., Blasco, M. A. Telomeric RNAs are essential to maintain telomeres. Nat Commun. 7, 1-13 (2016).
  10. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  11. De Silanes, I. L., et al. Identification of TERRA locus unveils a telomere protection role through association to nearly all chromosomes. Nat Commun. 5, 4723(2014).
  12. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  13. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  14. Pfeiffer, V., Lingner, J. TERRA promotes telomere shortening through exonuclease 1-mediated resection of chromosome ends. PLoS Genet. 8, e1002747(2012).
  15. Balk, B., Dees, M., Bender, K., Luke, B. The differential processing of telomeres in response to increased telomeric transcription and RNA-DNA hybrid accumulation. RNA Biol. 11, 95-100 (2014).
  16. Yu, T. Y., Kao, Y. W., Lin, J. J. Telomeric transcripts stimulate telomere recombination to suppress senescence in cells lacking telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3377-3382 (2014).
  17. Mehmetbeyoglu, E., et al. Decrease in RNase HII and accumulation of lncRNAs/DNA hybrids: a causal implication in psoriasis. Biomolecules. 12 (3), 368(2022).
  18. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods. 89, 123-130 (1986).
  19. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit. 26, 376-381 (2013).
  20. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chédin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell. 45, 814-825 (2012).
  21. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online. 13, 1-10 (2011).
  22. Arora, R., Azzalin, C. M. Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938-941 (2015).
  23. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nat Struct Mol Biol. 20, 1199-1206 (2013).
  24. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  25. Luke, B., Lingner, J. TERRA: telomeric repeat-containing RNA. EMBO J. 28, 2503-2510 (2009).
  26. Cañas, J. C., Aguilera, A., Gómez-González, B. Detection of R-loops by in vivo and in vitro cytosine deamination in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2528, 39-53 (2022).
  27. Cerritelli, S. M., Sakhuja, K., Crouch, R. J. RNase H1, the gold standard for R-loop detection. Methods Mol Biol. 2528, 91-114 (2022).
  28. Skourti-Stathaki, K. Detection of R-loop structures by immunofluorescence using the S9.6 monoclonal antibody. Methods Mol Biol. 2528, 21-29 (2022).
  29. Kianmehr, L., et al. Analysis of RNA/DNA hybrid profiles in blood from autistic patients reveals differences in mRNA and non-coding RNA regions. bioRxiv. , (2024).
  30. Yilmaz Sukranli, Z., et al. Experimentally altering microRNA levels in embryos alters adult phenotypes. Sci Rep. 14, 19014(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TERRAK

Похожие статьи