Методическая статья

Протокол электропорационной цитометрии для флуоресцентной микроскопии живых клеток с использованием культуры клеток U2 OS

DOI:

10.3791/68005

⸱

13 июня 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электропорация — это использование импульсных электрических полей (ПСВ) для создания переходных пор в клеточных культурах с целью введения молекулярного груза. В последнее время эта методика стала широко использоваться в научных исследованиях и клинических условиях. В этой статье мы опишем методы электропорации с использованием недавно разработанной «Системы электропорационной цитометрии» для выполнения флуоресцентной микроскопии живых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Импульсные электрические поля (ПЭП) имеют широкий спектр применения в медицинских исследованиях и клинических приложениях. Ключевым направлением исследований является электропорация (обратимая или необратимая). Обратимая электропорация использовалась в течение нескольких десятилетий для переноса молекул через клеточные мембраны, такие как плазмидная ДНК, обычно называемая электропереносом генов (GET). С другой стороны, необратимая электропорация стала популярным методом лечения рака, обеспечивая нетоксичную альтернативу путем необратимого разрыва клеток с использованием PEF. Это может сочетаться с различными типами лекарств или реагентов для усиления эффекта, который стал известен как электрохимиотерапия (ЭСТ). Однако, несмотря на широкие успехи в практическом применении, необходимы дальнейшие вспомогательные технологии и исследования для совершенствования существующих методов. Для решения этой проблемы была разработана система электропорационной цитометрии для поддержки экспериментов с живыми клетками PEF с возможностью выполнения долгосрочной флуоресцентной микроскопии. Это было в сочетании со стабильно экспрессирующей клеточной линией FUCCI(CA)5 U2-OS для оценки изменений в клеточном цикле в ответ на воздействие ПЭФ. При этом была достигнута интервальная микроскопия продолжительностью до 30 часов, обеспечивающая изменения активности клеток в режиме реального времени на основе репортера FUCCI(CA)5. В результате, изменения, специфичные для каждой фазы, были количественно оценены для последующего анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Импульсные электрические поля (ПЭП) стали распространенным инструментом для различных применений в биологии и клинической практике1. Их можно в целом разделить на электропорацию (ВП) и электростимуляцию (ЭС). Электропорация имеет две подобласти, известные как обратимая и необратимая электропорация. Обратимая электропорация (РЗ) десятилетиями использовалась в качестве эффективного инструмента для переноса молекулярного груза, такого как плазмидная ДНК, в клетки различных типов, таких как млекопитающие, бактериальные и дрожжевые2. В последнее время необратимая электропорация (IRE) приобрела известность в качестве нетоксичной альтернативысовременным методам лечения рака. Новая подобласть называется абляцией импульсного поля (PFA), которая фокусируется на нетермическом удалении тканей, в частности, для лечения определенных сердечных дисфункций4. В сочетании с лекарственными препаратами и другими реагентами это привело к развитию электрохимиотерапии (ЭСТ). Тем не менее, современное понимание методов лечения ПСВ опережает клиническое применение5. В данной работе мы представляем систему электропорационной цитометрии для исследования электрохимиотерапии. Клеточный цикл представляет собой ключевой показатель жизнеспособности клеток, и изменения могут идентифицировать специфичные для фазы эффекты. Разрабатывая эти инструменты, можно быстрее адаптировать протоколы, обеспечивая более эффективные методы лечения более широкого спектра видов рака.

Наша специализированная электроцитометрическая система (рис. 1) состоит из камеры с алюминиевыми параллельными пластинчатыми электродами и дном из покровного стекла, а также простого генератора импульсов экспоненциального распада. Камера изготовлена из камеры, напечатанной на 3D-принтере, а дно защитного стекла #1.5 прикреплено к медицинскому клею, чувствительному к давлению. Электроды формируются из клейкой алюминиевой пленки, размещенной на встроенных в камеру опорах, обеспечивающих два параллельных электрода на расстоянии 0,4 см друг от друга. Это обычная конфигурация для коммерческих электродов, которая обеспечивает надежную конструкцию, которая может быстро адаптироваться к протоколам тока. Камера может помещаться в защитные кожухи, предназначенные для слайдов размером 25 мм x 55 мм, что также является распространенным форматом предметного стекла, поддерживаемым коммерческими поставщиками микроскопов. Генератор импульсов обеспечивает импульсы экспоненциального затухания до 330 В, что позволяет проводить широкий спектр экспериментов, включая обратимую и необратимую электропорацию.

Для изучения влияния ПСВ на клеточный цикл мы использовали трансгенную клеточную линию остеосаркомы человека (U2 OS), экспрессирующую флуоресцентный индикатор убиквитинации клеточного цикла (CA)5 (FUCCI(CA)5), флуоресцентную конструкцию репортера живого клеточного цикла. Система вводит две флуоресцентные, усеченные формы геминина и Cdt1, которые производятся и перерабатываются с определенной скоростью в течение клеточного цикла. Кроме того, во время эксперимента можно целенаправленно контролировать апоптоз с использованием стабильно экспрессирующей линии FUCCI(CA)5 клеток U2-OS. В течение клеточного цикла репортер предсказуемо работает с каждой фазой, потому что они производятся и деградируют с той же скоростью, что и функциональные версии, естественно экспрессируемые в клетке. Когда происходит апоптоз, этот цикл нарушается, и клеточный цикл быстро прекращается. Как правило, это проявляется визуально в виде застоя флуоресценции в клеточном цикле, за которым следуют драматические морфологические изменения в ядре, которые хорошо видны благодаря локализации репортеров в ядре6. Это позволяет визуально идентифицировать каждую фазу в отдельных клетках с течением времени (рис. 2). Обратимая электропорация приводит к изменению внутриклеточных условий, и для исследования был выбран импульс экспоненциального распада 180 В. Этот импульс был подобран таким образом, чтобы максимально ограничить гибель клеток, обеспечивая при этом электропорацию у большинства населения. Это было определено на основе предыдущих исследований, изучающих оптимальные параметры импульса электропорации для шести клеточных линий млекопитающих. Плотность энергии импульса 180 В была несколько ниже оптимальных параметров трансфекции, что обеспечивало лучшую жизнеспособность клеток при высокой порации7. Влияние импульса изучали в несинхронизированных клетках и синхронизированных по S-фазе клетках с использованием двойного блока тимидина с применением и без применения ПЭФ (рис. 3). Результаты показали снижение средней длины для S и G2 по сравнению с контролем. Это указывало на то, что S-фаза была чувствительна к воздействию ПЭФ, что приводило к более быстрому клеточному циклу. Это продемонстрировало, что система электропорационной цитометрии смогла совместить доставку ПСВ с долгосрочной визуализацией живых клеток для изучения клеточного цикла. Хотя мы использовали эту платформу для наблюдения за клеточным прогрессом в клеточном цикле в ответ на ПСВ, это полезный инструмент для изучения различных применений и условий для ПСВ и клеточных культур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеточной культуры

  1. Готовят стабильную линию с помощью обратимой электропорации со следующими параметрами: 100 мкл ресуспендированных клеток U2 OS (6 × 106 клеток/мл) с 5 мкг плазмидной ДНК в кювете 0,4 см и прямоугольным импульсом 180 В в течение 10 мс.
  2. Напечатайте нестандартную конструкцию камеры с помощью любого подходящего 3D-принтера и биосовместимого пластика, такого как полимолочная кислота (PLA) (см. Дополнительный файл 1). Продезинфицируйте готовую камеру с помощью этанола (70%) и храните в стерильном контейнере перед использованием.
  3. Культивируют клетки U2-OS FUCCI(CA)5 в 10-сантиметровой пластине с 10 мл модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенстрептококка, и инкубируют при 37 °C и 5%CO2.
  4. Когда культура достигнет 80% конфлюенции, аспирируйте среду, промойте клеточную культуру фосфатно-солевым буфером (PBS) и диссоциируйте клетки с помощью 1 мл 0,25% трипсина в течение 1,5 мин.
  5. Нейтрализуйте трипсин путем ресуспендирования клеточной культуры в 5 мл DMEM-High Glucose (содержащей 10% FBS и 1% PenStrep).
  6. Из ресуспендированной клеточной культуры получить образец объемом 100 мкл и поместить его в камеру системы электропорации цитометрии на нижнем стеклянном покровном стекле. После введения образца убедитесь, что камера сливается на 30%. Если перед инкубацией образец оказался чрезмерно сгущенным, отсадите образец и уменьшите объем образца.
  7. Медленно добавьте 4 мл DMEM-High Glucose (содержащего 10% FBS и 1% PenStrep) в дальний конец камеры, не допуская вымывания жидкости из образца.
  8. Поместите стандартное предметное стекло микроскопа в верхнюю часть камеры и инкубируйте камеру при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 24 часов, убедившись, что культура полностью прилипла к дну камеры. При необходимости используйте Hoechst 33342 (1 мкг/мл) для окрашивания ядра клеток для облегчения количественного определения клеток, а также апоптоза. Окрашивание выполняется за 30 минут до начала интервальной микроскопии.

2. Подготовка микроскопа

  1. Во-первых, включите инвертированный флуоресцентный микроскоп с контролем окружающей среды и камерой, что позволит стабилизировать условия перед выполнением электропорации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой инвертированный флуоресцентный микроскоп с системой обработки окружающей среды, который может работать с камерным стеклом размером 25 мм x 55 мм x 16 мм. Первоначально конструкция была разработана для работы с инвертированным микроскопом (см. Таблицу материалов) и соответствующей системой окружающей среды.
    Нагрев сцены может привести к смещению изображения из-за расширения металла.
  2. Пока система окружающей среды достигает оптимальной температуры, подключите цифровой мультиметр к конденсатору импульсного генератора и высоковольтному выключателю с помощью подходящих электрических кабелей. Чтобы следовать этому протоколу, используйте кабели типа «аллигатор», чтобы обеспечить быструю сборку и разборку с камерой электропорации.
  3. Затем выберите 20-кратное увеличение и с помощью программного обеспечения микроскопа убедитесь, что каналы FITC (GFP) и A594 (TexRed/mCherry) (опционально канал DAPI для Hoechst 33342) выбраны в соответствии с двумя флуоресцентными белками в системе FUCCI(CA)5. Используйте низкие настройки экспозиции (обычно <0,05 с), чтобы избежать повреждения фотографий при длительной интервальной съемке.
  4. Оптимизируйте фокусировку и качество изображения, сделав тестовые снимки перед началом интервальной съемки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция должна быть настолько яркой, насколько это необходимо для визуализации цвета.
  5. Запрограммируйте интервальную съемку на съемку 3–6 точек обзора каждые 10 минут в течение 24 часов , чтобы получить большой объем данных о клеточном цикле за интервальную съемку и уменьшить повреждение фотографий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени может варьироваться в зависимости от временных рамок клеточной активности.
  6. Убедитесь, что автофокусировка включена для канала A594 для получения наилучших результатов при отслеживании клеточной культуры во время интервальной съемки.
  7. Оставьте программное обеспечение в режиме ожидания до тех пор, пока не будет выполнена электропорация. После подачи импульса немедленно активируйте интервальную съемку, чтобы обеспечить максимально возможную точность данных.

3. Электропорация

  1. Поместите камеру электропорационной цитометрии в микроскоп с соответствующей климатической камерой. Перед электропорацией оставьте камеру закрытой, а также работающую систему окружающей среды, чтобы не повлиять на клеточный цикл.
  2. Подсоедините цифровой мультиметр к генератору импульсов и подключите генератор импульсов к электродам камеры с помощью кабелей типа «крокодил», открыв климатическую камеру.
  3. Зарядите конденсатор в генераторе импульсов до 180 В и быстро разрядите импульс в камеру до тех пор, пока цифровой мультиметр не покажет 0 Вольт.
  4. Снимите электрические соединения с камерой и как можно быстрее установите на место крышку, чтобы обеспечить надлежащие условия культивирования.
  5. Немедленно активируйте интервальную съемку, как только микроскоп будет установлен на место.

4. Покадровый сбор данных

  1. После завершения интервальной съемки используйте программное обеспечение микроскопа, чтобы сохранить интервальную съемку в виде одного видео на основе изображений, снятых в течение интервальной съемки. Улучшите визуальное качество на этом этапе, чтобы помочь с ручной количественной оценкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выбрать любую частоту кадров; Тем не менее, скорость 6 кадров в секунду обеспечивает умеренную скорость воспроизведения с 1 секундой видео, что приводит к 1 часу реального времени.
  2. После того, как будет подготовлено покадровое видео, отслеживайте фазы ячейки с течением времени, наблюдая за изменениями сигналов FITC и A594

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью системы FUCCI (рис. 2) были получены данные о визуальном клеточном цикле путем измерения продолжительности времени, в течение которого каждый цвет экспрессировался клеткой в результате экспрессии белка и разбиквитинации. Основываясь на результатах несинхронизированных и синхронизированных экспериментов (рис. 3), было очевидно, что воздействие S-фазы ПСВ усиливает клеточный цикл. Об этом свидетельствовало уменьшение средней длины фазы, что свидетельство...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При правильном выполнении данные о фазе клеточного цикла могут быть количественно определены для больших объемов одиночных клеток в течение периодов до 24 часов. Этот протокол позволил получить данные, сопоставимые с данными о клеточном цикле с альтернативными методами, такими как FAC. Это широко используемый метод, при котором клетки становятся флуоресцентно помеченными по мере продвижения по клеточному циклу. После инкубации в течение не менее 24 ч они сортируются по интенсивности флуо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить как лабораторию Гупта, так и членов Rackus Group за их постоянную поддержку в лаборатории и за ее пределами. Грантовое финансирование щедро предоставлено в партнерстве с Mitacs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Камерный слайд (3D-печать / сборка) Н/ДН/Д
Культуральный планшет (10 см)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusН/ДТакже можно использовать альтернативные модели микроскопов. Убедитесь, что сцена и система окружающей среды могут вместить камеру электропорации (55 мм x 
DMEM – СывороткаGibco11965092
глюкозы ТермоФишерA5256701 
3D-принтер i3 MK3SPrusaN/AМожно использовать альтернативные модели принтеров, которые могут использовать файлы STL.
Pen StrepThermoFisher15070063
фосфатный буферный физиологический растворGibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
трипсинSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS Клеточная линияATCCHTB-96
плодов крупного рогатого скота высоким содержанием

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

U2 OSFUCCIS

Похожие статьи