Биореакторная сборка для непрерывного культивирования сложных фекальных сообществ

Краткое содержание

В этом протоколе подробно описана сборка мини-биореакторных массивов, которые будут использоваться для непрерывного культивирования сложных фекальных сообществ в анаэробных условиях. Мы также обсуждаем методы сборки, модифицирования и отбора проб реакторов для дальнейшего анализа.

Аннотация

Микробиота, особенно бактерии, реагирует на различные воздействия окружающей среды, такие как микро- и макроэлементы, фармакологические соединения и медиаторы воспаления, которые динамически изменяют состав сообщества и микробный метаболизм. Понимание того, как физиологические условия культивирования влияют на микробные сообщества и разнообразие, а также на их метаболическую способность, внесет важный вклад в изучение их влияния на здоровье и болезни. Здесь мы представляем протокол, адаптированный на основе шаблона, опубликованного Auchtung et al., для создания мини-биореакторов, которые могут культивировать сложные фекальные сообщества, определять бактериальные консорциумы или отдельные штаммы при определенных условиях, включая доступность питательных веществ, температуру, скорость потока, pH и содержание кислорода. В опубликованном протоколе мы описываем процесс создания системы мини-биореактора, включая адаптацию для улучшения ограничений. Мы также обсуждаем создание системы мини-биореактора в анаэробных условиях с использованием среды MEGA (адаптированной из Han et al.), которая является богатой средой, поддерживающей рост различных бактерий. Мы описываем инокуляцию гуманизированных образцов кала мышей из кишечника в систему мини-биореактора с последующим созданием сложных культур сообщества в системе мини-биореактора, которые могут быть выращены в непрерывном потоке с асептическим отбором проб для мониторинга состава сообщества. Эта система может быть адаптирована к изменениям в рационе питания и другим культурным модификациям. Описанные здесь методы позволяют охарактеризовать разнообразные, привередливые фекальные сообщества в динамических условиях или в ответ на возмущение в изоляции от факторов, происходящих от хозяина.

Введение

Микробиота кишечника представляет собой обширную сеть микроорганизмов, включая бактерии, грибы, археи и вирусы, которые содержат огромный генетический и метаболический репертуар, значительно превосходящий по численности человеческий^{хозяин1}. Богатая метаболическая способность микробиома включает метаболиты, образующиеся в результате бактериальной переработки пищевых питательных веществ, метаболиты хозяина, химически модифицированные бактериями, и метаболиты, синтезируемые микробиотой². Микробиота участвует почти во всех биопроцессах хозяина, а также в таких болезненных состояниях, как воспалительные заболевания кишечника, рак, метаболические нарушения и даже неврологические расстройства ^2,3. Анализ вклада микробиоты и микробиоты хозяина имеет важное значение для понимания роли конкретных микроорганизмов или сложных сообществ в здоровье и болезнях. Одним из подходов, который позволяет проводить такое препарирование, является использование микробных биореакторов, которые культивируют разнообразные микробные сообщества в динамических условиях. Существует множество коммерчески доступных биореакторов, которые позволяют выращивать фекальные бактериальные сообщества практически для любых целей, включая крупномасштабное выращивание биопродуктов или точный контроль конкретных питательных факторов для изучения метаболических процессов. Однако эти системы чрезвычайно дорогостоящи и требуют обширной подготовки, а также не позволяют параллельно изучать различные экспериментальные условия. Для упрощенного подхода, который является менее затратным, более адаптируемым и допускает множество параллельных условий, мы представляем здесь протокол создания и использования мини-биореактора в непрерывном потоке, адаптированный из Auchtung et ^al.4.

Полная конфигурация системы мини-биореактора показана на рисунке 1А. В этой мини-биореакторной системе используются массивы из 6 реакторных колодцев, которые полностью независимы друг от друга и установлены в анаэробной камере под перистальтическим потоком для обеспечения непрерывной подачи и удаления среды (рис. 1A). Каждая реакторная решетка расположена на 60-позиционной магнитной перемешивающей пластине, а два 48-кассетных перистальтических насоса удерживают трубки с 2 ступенями для исходной среды и потока отходов (рис. 1A). Анаэробная камера оснащена анаэробным монитором содержания кислорода САМ-12, каталитическим боксом для удаления кислорода с теплопроизводительностью и колонной для удаления сероводорода для поглощения избытка газа от бактериального метаболизма. Каждый реакторный колодец оснащен входом исходной среды, выпускным отверстием для отходов и отверстием для отбора проб, что позволяет проводить инокуляцию или отбор проб из каждой отдельной реакторной скважины (Рисунок 1B).

Как уже было описано, система биореакторов обеспечивает динамический контроль температуры, потребления среды и доступности питательных веществ для поддержки выращивания и поддержания фекальных сообществ. Температура модулируется каталитическим боксом с теплопроизводительностью, что позволяет быстро изменять температуру по всей анаэробной камере. Расход среды регулируется расходом перистальтического насоса, который может быть изменен для изменения оборота среды в реакторах. Оборот средств массовой информации может быть адаптирован к типам сообществ, культивируемых в реакторах, например, адаптирован к медленно растущим или очень быстро растущим целевым штаммам. Наконец, доступность питательных веществ может быть динамически изменена путем добавления компонентов через отдельные отверстия для проб в каждой скважине реактора. Статическими условиями, которые могут быть изменены в начале эксперимента, но которые не имеют динамического контроля в системе, являются тип среды, содержание кислорода и количество одновременных реакторов. Следователи могут выбрать для реализации любые исходные носители, и хотя здесь описан один носитель, было успешно реализовано бесконечное количество других типов исходных носителей. Реакторы могут эксплуатироваться в аэробных или микроаэрофильных условиях (в зависимости от наличия микроаэрофильной камеры). Наконец, в зависимости от экспериментальных потребностей исследователя может быть установлено столько реакторов, сколько необходимо. В то время как реакторы находятся в группах по шесть реакторов в массиве, каждый реактор работает независимо от других, и каждый из них может быть подключен к другому источнику, если это необходимо.

Эта модульная биореакторная система может быть полностью сконфигурирована примерно за 25 000 долларов США (не включая анаэробную камеру или компоненты, специфичные для камеры), при этом единственной немногоразовой частью является трубка, которая может быть заменена менее чем за 100 долларов США за один прогон системы. Система в основном автоматизирована, но требует ежедневной проверки уровня среды, так как бутылки с источником среды необходимо будет менять после опустошения. Кроме того, любой отбор проб должен быть выполнен вручную, а любые динамические условные изменения в системе должны быть инициированы вручную (например, изменение температуры). По сравнению с оригинальным системным протоколом, опубликованным Auchtung et al., было внесено несколько изменений для улучшения общей производительности и^{полезности4}. Во-первых, материал для 3D-печати массива биореактора модифицируется в полупрозрачный прозрачный пластик, подобный ABS, чтобы улучшить структурную целостность системы за счет повторяющихся раундов автоклавирования. Кроме того, вместо трубки из ПТФЭ с наружным диаметром 1/8 дюйма (3,2 мм), E-LFL, внутренний диаметр 2,06 мм, используется трубка длиной 100 футов из-за более прочного материала, который более устойчив к смятию, что может привести к засорению потока в системе. Наконец, дополнительный фитинг с резьбой 1/4-28 мм к адаптерам с зазубренной наружной резьбой используется для уменьшения изменений проскальзывания трубки от бутылок с источником материала. Согласно Han et al., адаптированный рецепт среды MEGA обеспечивает неопределенную, сложную, очень богатую среду, которая позволяет культивировать привередливые анаэробные микроорганизмы⁵. Среду модифицируют для использования альтернативного препарата гистидин-гематинового компонента, так как оригинал больше не доступен на рынке. Гидроксид натрия также используется для определения pH среды до 7,0 или любого желаемого pH. В целом, эта система является бюджетной и удобной для пользователя, оптимизированной и отличной отправной точкой для систем культивирования в непрерывном потоке.

В этом протоколе мы подробно описываем настройку этой системы мини-биореактора, включая материалы, стерилизацию системы и последующее использование для культивирования гуманизированных образцов фекалий мышей из кишечника. Общая цель этого метода заключается в создании адаптируемой и экономически эффективной биореакторной системы, которая может быть использована для культивирования микробных сообществ в контролируемых условиях. Подробная схема рабочего процесса сборки системы мини-биореактора представлена на рисунке 2 и указана на соответствующих этапах протокола. В нашем примере мы инокулируем два реактора одним и тем же образцом фекалий от гуманизированных кишечных мышей и описываем структуру микробного сообщества в непрерывном потоке МЕГА-сред.

Рисунок 1: Принципиальная схема установки мини-биореактора в анаэробной камере. (A) Полный вид завершенной установки мини-биореактора в анаэробной камере. Массив биореакторов на 6 лунок расположен на 60-позиционной магнитной мешалке. Исходная сеть люэр-тройника подключается к исходному фильтрующему материалу с левой стороны через крышку бутылки с двумя отверстиями. Два перистальтических насоса удерживают трубки с 2 ступенями от исходной и сточной сетей слева и справа соответственно. Сеть люэр-тройника для отходов опорожняется в бутылку для отходов с правой стороны. Необходимое оборудование для работы анаэробной камеры, в том числе монитор CAM-12, каталитический бокс с нагревательной мощностью и колонна для удаления сероводорода, расположено внутри камеры вокруг системы решетки. (B) Вид сверху на отверстия для источников, проб и отходов, прикрепленные к одной скважине реактора с средой на соответствующей высоте в реакторе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Принципиальная схема процесса сборки массива мини-биореакторов. (A) Вид сверху вниз на массив мини-биореакторов, показывающий ориентацию отверстий источника, отходов и отбора проб. (B) Вид сбоку на мини-биореактор с изображением, иллюстрирующим этапы 2.3-2.4 протокола. Трубка и фитинг из ПТФЭ 1/8 дюйма (1) прикреплены и вставлены в отверстия для слива и отбора проб. Штуцер (1) без ПТФЭ вставляется в порт источника. (C) Вид сбоку на мини-биореактор, иллюстрирующий этапы 2.5-2.6 протокола. Штуцер (2) прикреплен к исходному и сливному отверстиям. Штуцер (3) прикреплен к порту для отбора проб, а к нему сверху вставлен штуцер (4). (D) Вид сбоку на мини-биореактор, иллюстрирующий этапы 2.9-2.11. Трубка E-LFL 2,06 мм подсоединяется к исходному и сливному отверстиям, а другой конец подключается к фитингам (5), а затем (6). Затем трубка с 2 упорами соответствующего диаметра подключается к фитингу (6). Затем обратное соединение повторяется на конце трубки с 2 ступенями, при этом фитинг (6) соединяется с трубкой с 2 ступенями, а фитинг (5) соединяется с ней. Наконец, трубка E-LFL 2,06 мм будет подключена к фитингу (5) для подключения к сети тройника Люэра. (E) Вид сверху вниз на массив мини-биореакторов, отображающий настройку сети luer tee источника и отходов, описанную в шагах 2.12-2.15. Трубка E-LFL 2,06 мм, заканчивающаяся фитингом (5), используется для подключения каждого реактора к нескольким фитингам (7), последнее отверстие которых соединяется с крышкой на исходной или отработанной бутылке. (F) Вид сбоку на крышку бутылки с двумя отверстиями, описанный в шагах 2.16-2.17. Одно отверстие в крышке соединено с трубкой из ПТФЭ, которая находится внутри бутылки. В это отверстие вставляется фитинг (1), за которым следует фитинг (2), и трубка E-LFL 2,06 мм, соединенная с фитингом (5). Этот фитинг подключается к исходной или отработанной сети Люэра. В отверстие, не подсоединенное к трубке из ПТФЭ, вставляется фитинг (1), за которым следует фитинг (2), а трубка E-LFL 2,06 мм присоединяется к другому фитингу (5). Этот конец закрывается фольгой во время стерилизации в автоклаве для последующего подключения к стерильному шприцевому фильтру емкостью 0,22 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

Образцы фекалий, использованные в этом исследовании, были получены в ходе экспериментов, одобренных Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Флориды (UF) и проведены в учреждениях по уходу за животными UF (протокол IACUC #IACUC202300000005). Вкратце, смешанный пол стерильного безмикробного дикого типа (GF WT; C57BL/6) мышей (разводимых и содержащихся в изоляторах подразделением UF Animal Care Services Sterm-free Division) переводили из изоляторов для разведения и помещали в систему биоисключения ISOcage P для проведения микробных манипуляций. Равные колониеобразующие единицы (КОЕ) из фекалий донора человека были объединены для зондирования мышам. Через две недели после инокуляции у этих мышей были асептически собраны образцы кала для хранения и последующего использования в этом протоколе.

ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор и подготовка образцов кала, описанные здесь, предназначены только для примера правильной процедуры, так как в зависимости от типа собираемых образцов (человек, мышь, другое животное) и хранения этих образцов, эта процедура может сильно различаться. Люди должны обратиться к соответствующей литературе для разработки протокола сбора и сохранения образцов кала на основе потребностей конкретного исследователя.

1. Типовая подготовка образцов кала к хранению при температуре -80 °C

1. Выберите анаэробную среду для сохранения жизнеспособности (здесь мы использовали Кэри Блэра). Аликвот 1 мл консервационной среды в стерильные, завинчивающиеся крышки 2 мл пробирки в шкафу биобезопасности, а затем переложите в анаэробную камеру.
2. Перед взятием образцов кала убедитесь, что все материалы (автоклавные шпатели, стерильный физиологический раствор и криогенные флаконы с завинчивающейся крышкой, содержащие консервационную среду) предварительно отредуцированы в течение 24 часов в анаэробной камере.
3. Асептический сбор образцов кала у мышей с помощью стерильных пробирок с защелкивающимися крышками в шкафу биобезопасности с использованием автоклавных стаканчиков для сбора кала и щипцов. Сразу после сбора заморозьте пробирки в жидком азоте.
4. Немедленно перенесите образцы в анаэробную камеру вместе с переносными весами для взвешивания. Предварительно взвесьте каждую трубку. Для образцов фекалий мышей отдельные фекальные гранулы могут быть аликвотированы в каждой пробирке. Если вы используете человеческие образцы, используйте стерильные шпатели, чтобы перемешать каждый образец и разделить его поровну на криогенные флаконы. После повторного взвешивания каждой пробирки добавьте в каждую пробирку среду в соотношении 1:10 (масса: масса) для оптимальной сохранности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора образцов кала рекомендуется немедленное анаэробное консервирование. Образцы, не сохранившиеся сразу, могут иметь сниженную жизнеспособность, изменения состава и т.д. по сравнению со свежезаконсервированными образцами ^6,7,8. Консервационные среды Кэри Блэра сохраняют жизнеспособность бактериальных сообществ, подавляя дальнейший рост, и могут храниться при температуре -80 °C. Что касается расчетного соотношения консервационных сред и фекалий, то, несмотря на то, что сырой вес образца кала сильно варьируется, это наилучшая доступная оценка.
5. Маркировать, укупоривать, извлекать флаконы из анаэробной камеры, замораживать жидким азотом и хранить при температуре -80 °C до года и более.

2. Строительство 6-скважинного реакторного массива

1. Используйте файл САПР (Дополнительный файл 1) для 3D-печати 6-скважинного реактора. Этот файл можно отправить в любую компанию, занимающуюся 3D-печатью, для производства. Используйте ABS-подобный полупрозрачный прозрачный пластик в качестве материала для печати, чтобы обеспечить визуализацию через реакторы, а также быть устойчивым к повторяющимся циклам автоклавирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы ввели в эксплуатацию 6-скважинные реакторные массивы, изготовленные из полупрозрачного прозрачного пластика, подобного ABs, методом стереолитографии. Мы рекомендуем наклонять массив (т. е. печатать деталь на 3D-принтере под углом 30–45%) во время производства, что снижает неточности размеров. В результате этой коррекции по диагонали поперек массива будут видны линии слоев, но это не повлияет на производительность реакторов.
2. С помощью нарезного инструмента 25-28 мм введите винтовую резьбу в каждое отверстие реакторной решетки.
3. Отрежьте полоски 12, 25 мм от трубки из ПТФЭ 1/8 дюйма и вставьте по одному концу каждого сегмента трубки в отверстие с резьбой винта фитинга с наружной резьбой от люэра до резьбы 25-28. Надежно вкрутите фитинги в предназначенные для этого отверстия решетки для сливов и образцов (рис. 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бритвенное лезвие можно использовать для легкого бритья концов трубки в конусообразную конусообразную конфигурацию, чтобы трубка лучше подходила для вставки.
4. Вставьте микромешалку в каждую лунку реактора, а затем вкрутите фитинг с наружной резьбой 1/4-28 в исходные отверстия каждой лунки реактора (Рисунок 2B).
5. Вкрутите фитинги переходника для шланга с внутренней резьбой luer x 1/8 дюйма в фитинги с резьбой 1/4-28 для отходов и источника для каждой скважины реактора (Рисунок 2C).
6. Вкрутите фитинги переходника для шланга с внутренней резьбой luer x 3/32 дюйма в фитинги с резьбой 1/4-28 для отверстия для образца. Наденьте резиновую перегородку на переходники для шланга 3/32 дюйма и загните верхнюю часть (Рисунок 2C).
7. Отрежьте два комплекта трубок E-LFL, 2,06 мм следующей длины для отвода отходов и трубопровода источника: 14 см, 15,25 см, 16,5 см, 17,75 см, 19 см и 20,25 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цветная этикеточная лента, обернутая вокруг средней части, может использоваться для идентификации трубки каждой длины.
8. Прикрепите трубку E-LFL 2,06 мм к фитингам с переходником для шланга с внутренней резьбой 1/8 дюйма для соединения источника и слива (Рисунок 2D). Используйте горячую воду, чтобы сделать трубку более податливой. Это позволит трубке легко прилегать к адаптерам.
9. Прикрепите наружный луэр со стопорным кольцом x 1/8-дюймовый переходник для шланга с шипом к другому концу трубки. Вкрутите в него адаптер для шланга с внутренней резьбой luer x 1/16 дюйма (Рисунок 2D).
10. Подсоедините трубку соответствующего размера с 2 ступенями к соответствующим соединениям слива и источника. На сливных линиях используются трубки с внутренним диаметром 1,14 мм, а на исходных линиях используются трубки с внутренним диаметром 1,02 мм. На другом конце трубки с 2 ступенями прикрепите еще один фитинг с внутренней резьбой люэр x 1/16 дюйма (Рисунок 2D).
11. Отрежьте 20,5 см кусочков E-LFL, трубку 2,06 мм, и вставьте наружный луэр с фиксирующим кольцом x 1/8 дюйма переходные фитинги для шланга с шипом на оба конца каждой трубки. Прикрепите один конец трубки длиной 5 см с помощью люэра с наружной резьбой и стопорным кольцом x 1/8 дюйма адаптера для шланга 1/8 дюйма к незанятому фитингу с внутренней резьбой luer x 1/16 дюйма в конце каждого участка трубки с 2 ступенями. Повторите этот процесс для оставшихся 19 трубок (Рисунок 2D).
12. Подсоедините трубку E-LFL, диаметром 2,06 мм к источникам скважин реактора 1 и 2, используя противоположные концы тройника с внутренней резьбой. Прикрепите один из отрезков трубки длиной 5 см с наружной резьбой и стопорным кольцом x 1/8 дюйма переходными фитингами на каждом конце к среднему выходу тройника, ведущему ко второму соединению тройника (Рисунок 2E).
13. Подсоедините трубку источника E-LFL, диаметром 2,06 мм для третьего реактора, к противоположной стороне второго тройника. На одном конце должна быть прикреплена еще одна трубка длиной 5 см с наружным люэром со стопорным кольцом х адаптер 1/8 дюйма, а на другом конце должна быть прикреплена внутренняя трубка луэра с фиксирующим кольцом х адаптер 1/8 дюйма. Следуйте той же схеме для реакторов 4, 5 и 6 (рисунок 2E).
14. Отрежьте кусок трубки E-LFL диаметром 2,06 мм диаметром 25 см, прикрепив к одному концу трубки фитинг люэра с наружной резьбой и фиксатором для шланга размером 1/8 дюйма, который будет прикреплен к последнему оставшемуся тройнику с внутренней резьбой, а с другого конца прикрепите фитинг с переходником для шланга с внутренней резьбой luer x 1/8 дюйма. Закройте этот конец алюминиевой фольгой (рисунок 2E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время операции важно сохранять открытые концы стерильными, поэтому мы рекомендуем держать их закрытыми фольгой во время автоклавирования и закреплять на месте лентой.
15. Подготовьте линии отходов, повторив ту же процедуру, что и исходные линии, описанные в шагах 2.12-2.14 (рисунок 2E).
16. Чтобы собрать бутылку для сбора отходов, неплотно закрепите крышку с двумя отверстиями на бутылке объемом 2 л. Вставьте фитинги с наружной резьбой 1/4-28 в оба отверстия колпачка. Прикрепите гнездовой луэр с переходниками для шланга 1/8 дюйма к фитингу с наружной резьбой, который не соединяется с предварительно прикрепленной трубкой из ПТФЭ в колпачке (рис. 2F).
17. Далее отрежьте кусок трубки E-LFL диаметром 2,06 мм диаметром 5 см и подсоедините его к переходнику для шланга на бутылке. Прикрепите наружный люэр со стопорным кольцом x адаптер для шланга 1/8 дюйма к другому концу трубки диаметром 5 см и накройте его фольгой (эта трубка служит вентиляционным отверстием; после автоклавирования будет добавлен шприцевой фильтр 0,22 мкм для предотвращения загрязнения; Рисунок 2F).
18. Накройте всю крышку алюминиевой фольгой. Автоклавируйте реакторы и контейнер для отходов при температуре 121 °C и минимальной давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 45 минут, используя программу медленного выпуска, обычно устанавливаемую для жидкостей. После того как реакторы остынут, затяните фитинги и уплотнения из алюминиевой фольги и поместите их в анаэробную камеру на 48 часов перед использованием.

3. Медиа подготовка МЕГА

1. Подготовьте все складские растворы в соответствии с Дополнительной таблицей 1, Дополнительной таблицей 2, Дополнительной таблицей 3, Дополнительной таблицей 4, Дополнительной таблицей 5, Дополнительной таблицей 6, Дополнительной таблицей 7, Дополнительной таблицей 8.
2. В стеклянную бутылку объемом 2 л добавьте все сухие ингредиенты из Дополнительной таблицы 9, затем 1640 мл сверхчистой воды, а затем остальные жидкие ингредиенты из Дополнительной таблицы 10 . Добавьте мешалку и полностью растворите на среднем огне (90 °C) на тарелке для перемешивания. Среда будет бледно-голубого или фиолетового цвета и не будет полностью прозрачной, но не будет иметь явных нерастворенных комков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавирование глюкозы и других сахаров в присутствии пептидов может привести к модификации и снижению доступного сахара в средах. При желании все сахарные растворы могут быть стерильно отфильтрованы и добавлены с компонентами, указанными в дополнительной таблице 10, как описано в шаге 3.7.
3. После полного смешивания отрегулируйте pH фильтрующего материала до 7,0, добавив 10 Н гидроксида натрия (NaOH), точно измеряя, сколько объема добавляется. После измерения pH добавьте 14,4 мл воды за вычетом объема добавленного гидроксида натрия, чтобы довести объем ровно до 2 л.
4. Подготовьте крышку для бутылки с двумя отверстиями, вставив наружную резьбу 1/4-28 мм в оба отверстия.
5. В отверстии крышки, не прикрепленной предварительно к трубке из ПТФЭ, отрежьте кусок трубки C-flex длиной 5 см и подсоедините его к штуцеру шланга диаметром 1/8 дюйма фитинга с внутренней резьбой. На другом конце трубки диаметром 5 см вставьте еще один люэр с наружной резьбой со стопорным кольцом и переходником для шланга 1/8 дюйма, а затем накройте фольгой (она также будет подключена к шприцевому фильтру 0,22 μM).
6. Накройте всю крышку алюминиевой фольгой и закрутите сверху бутылку MEGA объемом 2 л. Автоклав при 121 °C и минимальном давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 45 минут, используя программу медленного выпуска жидкостей.
7. Извлеките материал из автоклава и дайте ему остыть, помешивая, до теплого состояния. Добавьте компоненты, указанные в дополнительном столе 10 , в 2-литровую бутылку для фильтрующего материала в шкафу для биологической безопасности, закройте крышку, а затем переместите на перемешивающую пластину для гомогенизации. После того как среда остынет, затяните фитинги и уплотнения из алюминиевой фольги и поместите их в анаэробную камеру на 48 часов перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать исходный насос со скоростью 16 μл/мин (0,94 мл/ч) в течение 16 часов. Для достижения такого расхода в 6-луночном реакторе используется примерно 0,135 л среды в день. Мы также рекомендуем запускать отработанный насос со скоростью 40 μл/мин, чтобы предотвратить образование засорения в отработанных трубках. Следите за трубками и потоком, обращая внимание на то, что поток отходов может быть увеличен по мере необходимости, если засорение все же произойдет. Скорость потока как исходных, так и сточных вод может быть изменена, но исследователи должны тщательно следить за составом и темпами роста их сообщества, поскольку они также могут меняться при более быстром или более медленном потоке. Чтобы запустить 6-луночный реактор в течение одной недели, мы рекомендуем внести не менее 2 литров фильтрующего материала (он будет потреблять чуть больше 1 литра).

4. Установка массива в анаэробной камере

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сборкой необходимо очистить внутреннюю часть капюшона и перчатки капюшона 3% перекисью водорода с последующей тройной промывкой деионизированной водой, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения поверхности. Если соединения выполняются быстро после снятия пленки и не происходит прямого контакта с внутренней частью фитингов и анаэробными перчатками камеры, вероятность загрязнения минимальна

1. Выровняйте решетку над магнитной мешалкой в анаэробной камере. Убедитесь, что массив выровнен правильно, установив контроллер мешалки на максимальную скорость (1600 об/мин) и наблюдая за вращением мешалок.
2. Установите трубки с 2 ступенями для источника и стока в зажимы на соответствующих перистальтических насосах. Если вы делаете это менее чем за 24 часа до предполагаемого использования, зафиксируйте зажимы на месте. В противном случае оставьте его свободным до использования, чтобы уменьшить износ трубки.
3. Снимите колпачок фольги на фитингах переходника шланга с внутренней резьбой люэра x 1/8 дюйма на трубопроводах источника и слива и вкрутите в наружный люэр на 1/4-28 угрожающие фитинги, ввинченные в колпачки (убедитесь, что это отверстие соединено с внутренней трубкой из ПТФЭ).
4. Снимите крышки из фольги и прикрепите шприцевой фильтр длиной 0,22 мкм к вентиляционной линии 5 см исходной бутылки и к вентиляционной линии бутылки для отходов.
5. Начните подачу с умеренной скоростью (1 мл/мин на исходном насосе и 2 мл/мин на отработанном насосе), чтобы начать заполнение реакторов. Убедитесь, что трубка отводящего трубопровода в каждой скважине реактора находится ниже, чем трубка источника, что предотвратит переполнение или опорожнение каждой скважины.
6. Когда реакторы начнут заполняться, убедитесь, что все они достигают одинакового объема и что среда поступает в линию отходов. С учетом описанных здесь измерений рабочий объем каждого реактора составляет 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо отдельные реакторы не заполнены, затяните все ослабленные фитинги и осмотрите трубопроводы источника на наличие проблем, заменив их на подготовленные дополнительные компоненты, если это необходимо. Если проблема не устранена, замените исходную бутылку, если таковая имеется. Если уровень среды поднимается выше внутренней линии отходов в реакторах, убедитесь, что трубка из ПТФЭ внутри отверстия для отходов реактора все еще на месте.
7. После заполнения каждого реактора отрегулируйте настройки насоса до расхода 16 μл/мин, а затем выключите насосы.
8. Дайте среде остаться в реакторах и бутылках с отходами на ночь перед инокуляцией. Это позволяет проводить дальнейшую анаэробную подготовку среды (в общей сложности ~72 часа) и позволяет пользователю подтвердить стерильность системы.
9. Чтобы подтвердить стерильность системы перед посевом фекальной пробы, пробоотбор проб из каждого реактора и исходной среды проводится непосредственно после первоначального заполнения (этап 4.7) и повторно после этапа 4.8. Следуйте процедуре асептического отбора проб из реакторов, описанной в шаге 6.
   1. Убедитесь, что оптическая плотность измерения всех образцов такая же, как и для исходной среды; Если наблюдается повышенная оптическая плотность, возникает подозрение на загрязнение, и все среды и система должны быть разобраны, очищены и собраны заново.

5. Посев кала

1. Поместите стерильные наконечники для пипеток широкого диаметра, стерильный физиологический раствор, конические пробирки объемом 50 мл, стерильные серологические пипетки объемом 25 мл, шприцы объемом 5 мл и иглы 16-го калибра в анаэробную камеру для кондиционирования в анаэробной среде в течение не менее 24 часов.
2. Рассчитайте количество фекального материала, необходимое для инокуляции нужного количества реакторов. Для каждой реакторной скважины требуется 3,8 мл надосадочной жидкости в 25% м/в фекальной суспензии. Для шести реакторных скважин в общей сложности 22,8 мл 25% м/в фекальной суспензии должно обеспечить достаточное количество надосадочной жидкости для инокуляции, для чего потребуется 5,7 г твердых фекальных масс.
3. Перенесите сохраненные образцы кала в криогенных флаконах в анаэробную камеру и дайте им оттаять в течение 15 минут.
4. С помощью наконечника для дозатора с широким отверстием переведите фекальный материал из криогенных флаконов в коническую пробирку объемом 50 мл, плотно запечатайте и центрифугируйте при давлении 200 x g в течение 5 минут, чтобы частицы осели.
5. Перенесите обратно в анаэробную камеру и удалите надосадочную жидкость. С помощью автоклавного лабораторного шпателя перенесите каловые вещества в новую коническую пробирку объемом 50 мл, достигнув общей массы 5,7 г. Добавьте в пробирку 17,1 мл анаэробного стерильного физиологического раствора и плотно закройте.
6. Извлеките конические пробирки из камеры, гомогенизируйте вихрем в течение 5 минут, затем центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут для осаждения твердых частиц.
7. Простерилизуйте перегородки в верхней части каждого реактора с помощью 10% отбеливающей салфетки в течение не менее 2 минут, пока образцы помещаются в центрифугу.
8. Возвращают образцы в анаэробную камеру и с помощью стерильных серологических пипеток переносят надосадочную жидкость в новые конические пробирки объемом 50 мл.
9. Загрузите 3,8 мл надосадочной жидкости для каловой суспензии в шесть отдельных шприцев по 5 мл с иглами 16 G 1,5 дюйма.
10. Снимите салфетку, введите иглу через перегородку и медленно введите каловую суспензию в реактор.
11. Дайте фекальным сообществам утвердиться в каждом реакторе в течение примерно 16-18 ч перед началом потока в реактор. Установите магнитную мешалку на максимальную скорость с момента впрыска каловой суспензии (1600 об/мин).

6. Асептический отбор проб из реакторных скважин

1. Проколите обертку на шести стерильных шприцах объемом 1 мл и шести стерильных иглах 22G 3 дюйма и поместите их в анаэробную камеру для дегазации на 24 часа.
2. Непосредственно перед отбором проб стерилизуйте перегородки в верхней части каждого реактора с помощью 10% отбеливающей салфетки в течение не менее 2 минут.
3. Снимите отбеливатель, протрите лабораторией и сразу же приложите иглу к шприцу и вставьте иглу в центр перегородок первого реакторного колодца.
4. Вытяните 1 мл образца, извлеките иглу из перегородки и перенесите образец из шприца в пробирку с маркировкой объемом 1,7 мл для последующего использования. Резиновые перегородки снова запечатываются после удаления иглы. Используйте новую иглу и шприц для каждой скважины реактора, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
5. Если надосадочная жидкость желательна, извлеките пробирки из анаэробной камеры и центрифугируйте при давлении 20 000 x g в течение 1 минуты для гранулирования бактериальных клеток.
6. Перенесите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,7 мл с отдельной маркировкой и храните при температуре -80 °C.

7. Демонтаж и очистка системы мини-биореактора

1. Отсоедините исходную бутылку от исходного люэровского тройника и увеличьте расход (1 мл/мин на исходном насосе и 2 мл/мин на отработанном насосе), чтобы начать опорожнение трубки. Дайте трубке полностью опорожниться. Выключите пластину для перемешивания.
2. Когда трубка опустеет, отсоедините бутылку для отходов от тройника для отходов. Затем поместите реакторный узел в шлюз анаэробной камеры и извлеките его из камеры.
3. Отсоедините все сегменты трубок E-LFL 2,06 мм и трубок из ПТФЭ и утилизируйте их. Отсоедините все фитинги и поместите их в 10% раствор отбеливателя.
4. Извлеките мини-перемешиватели из каждой лунки массива и поместите их в раствор отбеливателя. Переверните реакторную решетку, чтобы опорожнить среду в отдельный 10% раствор отбеливателя для дезинфекции. Затем погрузите пустой массив в свежий раствор отбеливателя.
5. Дайте всем фитингам и реакторной решетке замочиться в 10% растворе отбеливателя на 30 минут (длительное замачивание приведет к обесцвечиванию).
6. Промойте фитинги и реакторную решетку деионизированной водой, затем погрузите на ночь в раствор ферментного моющего средства в соответствии с инструкциями производителя.
7. Трижды промойте фитинги и реакторную решетку деионизированной водой, затем дайте полностью высохнуть на воздухе в течение не менее 3 дней. После высыхания реакторный массив и фитинги можно снова использовать для сборки.

Результаты

Образцы кала были собраны у мышей, колонизированных фекальной суспензией человека, через 2 недели после инокуляции и хранились при температуре -80 °C. Система биореактора была сконфигурирована с непрерывным потоком среды МЕГА для двух реакторных скважин репликации (рис. 3А). Фекальную суспензию готовили из фекальных гранул мышей в соответствии с протоколом, описанным на этапе 6, и оба реактора инокулировали через порт для отбора проб с помощью реагирующей мы...

Обсуждение

Система мини-биореактора, описанная в этом протоколе, позволяет выращивать независимые фекальные сообщества для параллельных экспериментов. Эта способность изучать микробные сообщества в изоляции от факторов хозяина является важным подходом к пониманию внутренней способности микроорганизмов адаптироваться к окружающей среде. Этот протокол может быть легко адаптирован для культивирования определенных бактериальных консорциумов или даже отдельных изолированных культур, если это необходимо....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл шприц BD Slip Tip стерильный, одноразового использования	Fisher Scientific	309659
резьба 1/4-28 мм к адаптеру с зазубренной наружной резьбой (3,2 мм), 5 / упаковка	Cole-Parmer	008NB32-KD5L	Чтобы построить 1 массив из 6 лунок, необходимо 2 упаковки
10M NaOH (гидроксид натрия)	Sigma	72068-100ML
2,0 мл Трубка с завинчивающейся крышкой, без накатки, с юбкой, натуральная, E-Beam Стерильная трубка с прикрепленной крышкой	Fisher Scientific	14-755-228
2mag MIXdrive 60 Привод перемешивания	2mag	40060	60-позиционная магнитная пластина для перемешивания (опциональное добавление нагревательной мощности - cat# 40260)
6-луночный реактор arrray, ABS-Like Полупрозрачный прозрачный пластик	Protolabs	Custom	Смотрите дополнительные файлы для .stl файла для 3D-печати
Абсолютный этанол (200 пруф)	Fisher Scientific	BP2818
Уксусная кислота, ледниковый	адаптер Sigma	A6283
нейлон, наружная резьба люэр на 1/4-28 нить, 25/пак	Cole-Parmer	EW-45505-82	Для сборки 1 6-луночного массива, необходимо 6 (1 упаковка)
Алюминиевая фольга	Fisher Scientific	01-213-100
Анаэробная камера	Coy Lab Products	Тип B
Bel-Art  SP Scienceware Flea Micro Spinbar Магнитные перемешивающие стержни (1 / шт)	Fisher Scientific	22-261679	Чтобы построить 1 6-луночный массив, нужно 6
Шкаф биобезопасности класса 2	Nuaire
Масляная кислота	Sigma	B103500
CaCl2 · 2H2O (дигидрат хлорида кальция)	Sigma	C7902
Clorox Healthcare Бактерицидные салфетки с отбеливателем, без запаха, 6" x 5", Упаковка из 150 салфеток	Depot	129202
D-(-)-фруктоза	Sigma	F0127-100G
D-(+)-целлобиоза	Sigma	C7252-100G
D-(+)-глюкоза	Sigma	G8270-100G
D-(+)-Мальтоза моногидрат	Sigma	M5885-100G
Дрель America Plug Hand Tap DWTP1/4-28	Home Depot	305699489
Фосфатный буферный раствор Dulbecco, 1X без Ca и Mg, стерильный	Genesee	25-508
Female luer × 1/16″ адаптер для шланга Barb, нейлон, 25/pack	Cole-Parmer	EW-45502-00	Чтобы построить 1 6-луночный массив, требуется 24 (1 упаковка)
Внутренняя лунка & раз; 1/8 и Prime; адаптер для шланга, нейлон 25 / упаковка	Cole-Parmer	EW-45502-04	Чтобы построить 1 6-луночный массив, необходимо 6 (1 упаковка)
Внутренняя лунка & раз; 3/32 и Prime; адаптер для шланга, нейлон, 25 / упаковка	Cole-Parmer	EW-45502-02	Для создания 1 6-луночного массива, Требуется 6 (1 упаковка)
Женский луэровский чайник, нейлон, 25/упаковка	Cole-Parmer	EW-45502-56	Чтобы собрать 1 6-луночный массив, необходимо 10 (1 упаковка)
FeSO4 · 7H2O (железо [II] сульфат гептагидрат)	Sigma	F8633
Гематин	Sigma	H3281
Гистидин	Sigma	H7750
Изовалериановая кислота	Sigma	129542
K2HPO4 двухосновной (дикалийгидрофосфат)	Sigma	P2222-1KG
KH2PO4 одноосновной (дигидрофосфат калия)	Sigma	P0662-500G
Наконечники пипеток с большим отверстием	Fisher Scientific	02-707-134
L-цистеина гидрохлорид	Sigma	C1276-10G
Наружная вилка люэра со стопорным кольцом × 1/8″ адаптер для шланга с шипом, Нейлон, 25 / упаковка	Cole-Parmer	EW-45505-04	Чтобы построить 1 6-луночный массив, необходимо 42 (2 упаковки)
Мясной экстракт	Sigma	70164-500G
Med Vet International  Игла Exel, 20G x 1", подкожная, 100/коробка, 26417	Fisher Scientific	50-209-2532
Менадион (витамин K3)	Sigma	M5625
MgSO4  · 7H2O (гептагидрат сульфата магния)	Sigma	M1880-500G
Milli-Q вода
NaCl (хлорид натрия)	Sigma	S9888-500G
NaHCO3 (бикарбонат натрия)	Sigma	S5761-500G
Omnifi t Q-series крышка от бутылки с двумя отверстиями	Cole-Parmer	00945Q-2	Чтобы построить 1 массив из 6 лунок, требуется 1
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V	24-канальный перистальтический насос	MasterFlex	ISM939C-115V
Precision Seal® резиновые перегородки, белые, стеклянные трубки с наружным диаметром 7 мм (100 / шт.)	Millipore Sigma	Z553905-100EA	Чтобы построить 1 6-луночный массив, необходимо 6 септ
Пропионовая кислота	Sigma	P5561
Насосная трубка, 2-ступенчатая, Tygon S3 E-Lab, внутренний диаметр 1,02 мм; 12/PK	VWR	MFLX96460-28	Для создания 1 массива из 6 скважин требуется 6  (1 упаковка)
Трубка для насоса, 2-ступенчатая, Tygon S3 E-Lab, внутренний диаметр 1,14 мм; 12/PK	VWR	MFLX96460-30	Чтобы построить 1 массив из 6 лунок, требуется 6 (1 упаковка)
Puritan Cary-Blair Medium, 5 мл	Fisher Scientific	22-029-646
PYREX 2L Круглые бутылки для хранения медиа, с завинчивающейся крышкой GL45 Бритвенные	Fisher Scientific	06-414-1E
Лезвия бритвы	Genesee	12-640
Резазурин, натриевая соль	ACROS Organics от ThermoFisher	AC41890-0010
Растворимый крахмал	Sigma	S9765-100G
Микрошпатели из нержавеющей стали, ложечное лезвие	Fisher Scientific	S50823
TBNG TYGON ELFL 2,06MMID 100'VWR		MFLX06449-42	Чтобы построить 1 массив из 6 лунок, требуется 205,5 см
Добавка микроэлементов	ATCC	MD-TMS
Триптиказ пептон (BBL)	Трубка Fisher Scientific	B11921
, ПТФЭ, 1/8 и прайм; (3,2 мм) OD & times; Внутренний диаметр 1,5 мм, 10 м	Cole-Parmer	008 T32-150-10	Для создания 1 массива из 6 скважин требуется 300 мм
Tween 80	Sigma	P1754
Витаминная добавка	ATCC	MD-VS
Экстракт дрожжей (Bacto)	Fisher Scientific	DF0127-17-9