Здесь мы представляем протокол, демонстрирующий микрохирургическую целесообразность трансплантации передних конечностей крысы. Эта модель может служить важной трансляционной платформой для исследований VCA.
Методическая статья
Ортотопическая трансплантация передних конечностей крысы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Васкуляризированная композитная аллотрансплантация (VCA) включает в себя трансплантацию нескольких типов тканей, включая кожу, мышцы, кости и нервы, предлагая многообещающий реконструктивный вариант для пациентов с тяжелыми травматическими повреждениями или обезображениями. Несмотря на свой преобразующий потенциал, VCA столкнулся со значительными проблемами, такими как отторжение трансплантата, хронические осложнения иммуносупрессии и сложности нервно-мышечного восстановления.
Мы используем модель передних конечностей крысы в качестве экономически эффективной и анатомически релевантной платформы для решения этих проблем. Передняя конечность крысы точно отражает анатомию конечностей человека, усиливая трансляционное воздействие наших результатов. Предыдущие исследования подтвердили надежность и воспроизводимость этой модели для измерения функционального восстановления, тем самым утвердив ее в качестве ключевого инструмента для оценки траектории отторжения трансплантатов передних конечностей.
Кроме того, эта модель предоставляет ценную возможность для изучения инновационных терапевтических подходов и служит хорошей трансляционной платформой для новых методов консервации. Благодаря дальнейшему исследованию этой модели мы стремимся углубить наше понимание механизмов отторжения трансплантата и нервно-мышечного восстановления. В конечном счете, эта работа направлена на то, чтобы проложить путь к улучшению клинических результатов VCA, устраняя как текущие ограничения, так и будущие проблемы в трансплантационной медицине.
Введение
Васкуляризированная композитная аллотрансплантация (VCA) — это процедура, которая меняет жизнь и позволяет реконструировать серьезные дефекты тканей. VCA относится к трансплантации композитной ткани, состоящей из кожи, мышц, костей, соединительной ткани, кровеносных сосудов и нервов. Дальнейшее совершенствование и изучение методов СВУ принесет огромную пользу пациентам, страдающим от травматических повреждений или увечий1. Тем не менее, его более широкое применение осложняется постоянными препятствиями, такими как отторжение трансплантата, осложнения от длительной иммуносупрессии, нервно-мышечное восстановление и перитрансплантационная логистика.
Модель передних конечностей крысы стала предпочтительным выбором для исследований VCA из-за ее экономической эффективности и близкого сходства с анатомическими и нервно-мышечными характеристиками человека 2,3. Наша предыдущая работа показала, что эта модель обеспечивает надежные и воспроизводимые средства оценки поведенческого функционального восстановления4. В этом исследовании мы представляем подробное, пошаговое руководство по основным микрохирургическим методам, необходимым для этой модели.
По мере того, как исследования VCA продолжают развиваться, модель передних конечностей крысы позволит исследовать процесс отторжения, регенерации нервов и функционального восстановления нервно-мышечной системы. Исследователи могли бы изучить новые методы консервации, оценить эффективность методов машинной перфузии и протестировать новые иммуномодулирующие методы лечения, которые могут помочь снизить нынешнюю зависимость от долгосрочной иммуносупрессии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Хирургические процедуры проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Джонса Хопкинса (RA18M74) в соответствии с рекомендациями, установленными Национальными институтами здравоохранения и Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными.
1. Процедура донорства (Рисунок 1)
- Проводите индукцию анестезии путем ингаляции изофлурана в концентрации 5% и поддерживайте на уровне 1% на протяжении всей процедуры. Начните процедуру после подтверждения точного уровня анестезии путем щипкования пальцев ног.
- Сделайте круговой разрез примерно на 1 см выше локтя. Разделите кожу и обнажите нижележащую поверхностную подкожную клетчатку, не повреждая ее (рисунок 1A).
- Рассеките подкожную клетчатку/фасцию, прижгите все поверхностные сосуды и сделайте трансекту. Впоследствии будут обнажены дельтовидная мышца, часть большой грудной мышцы и трицепс плеча.
- Тупо рассеките под большой грудной мышцей, обнажив плечевые сосуды, а также срединный и локтевой нерв (рисунок 1B).
- Прижгите поверхностную вену на дельтовидной мышце и разрежьте проксимально, затем пересеките дельтовидную мышцу перпендикулярно ориентации мышечных волокон. После этого рассеките и пересеките большую и малую грудную мышцу, обнажив подмышечную артерию, вену и нерв. (Рисунок 1С).
- Пересеките срединный, локтевой и лучевой нервы на их проксимальном конце (сразу после расщепления), сохраняя как можно большую длину.
- Рассеките и освободите плечевую артерию и вену.
- Пересеките двуглавую мышцу плеча, трицепс плеча и широчайшую мышцу спины. Убедитесь, что плечевая кость правильно обнажена после завершения вскрытия.
- Используйте щипцы ронжера, чтобы пересечь кость дистальнее дельтовидного бугра плечевой кости.
- Аккуратно проверьте просвет плечевой артерии и вены (рисунок 1В). Промойте трансплантат 6 мл гепаринизированного физиологического раствора.
- Установите полиимидную манжету на плечевую артерию и вену соответственно (Рисунок 1D).
- Оберните привой влажной хлопчатобумажной марлей и храните при температуре 4 °C.
- Усыпьте крысу-донора с помощью ингаляционного анестетика (изофлурана). Когда вы полностью перестаете реагировать на защемление пальца ноги, проведите торакотомию и иссекайте сердце.
2. Процедура получения (Рисунок 2)
- Проводите индукцию анестезии путем ингаляции изофлурана в концентрации 5% и поддерживайте на уровне 1% на протяжении всей процедуры. Подтвердите статус анестезии с помощью щипки на пальце ноги.
- Сделайте круговой разрез примерно на 1-2 см выше локтя.
- Рассеките подкожные сосуды и прижгите более крупные сосуды, чтобы обнажить дельтовидную мышцу, часть большой грудной мышцы и трехглавой мышцы плеча.
- Выполните тупое рассечение под большой грудной мышцей, чтобы выявить плечевые сосуды, а также срединный и локтевой нервы.
- Пересеките дельтовидную мышцу и часть большой и малой грудной мышцы на их дистальном конце, обнажив плечевые сосуды, срединный и локтевой нервы (рис. 2A).
- Рассеките и пересеките срединный и локтевой нервы на их дистальном конце. Перевязывайте все сосудистые ветви (рисунок 2В).
- Пересеките двуглавую мышцу плеча, трицепс плеча и широчайшую мышцу спины, чтобы обнажить плечевую кость. Тщательно прижгите любые кровотечения из пересеченных мышц.
- Пересеките плечевую кость в дельтовидном бугристости. Используйте костный воск для герметизации полости костного мозга.
- Используйте интрамедуллярный стержень, чтобы восстановить соединение полости костного мозга донора и реципиента, затем используйте костный воск для герметизации соединения. Сшить трехглавой мышцы плеча рассасывающимся швом 6-0, создав таким образом платформу для сосудистого анастомоза.
- Выполняют эпиперинерриальную нейроррафию с прерывистым 10-0 швом лучевого нерва.
- Выполняйте сосудистый анастомоз с помощью бесшовной манжеты (Рисунок 2C).
- Выполните эпиперинерриальную нейроморфию с прерывистыми швами 10-0 для повторного соединения срединного и локтевого нервов (рисунок 2D).
- Соедините дельтовидную и большую грудную мышцы с помощью прерывистых швов.
- Закройте рану нерассасывающимся швом 4-0.
- Введите теплый, стерильный физиологический раствор в количестве 2% от массы тела подкожно в конце операции.
- Наблюдайте за животным не менее 4 часов под согревающей лампой для восстановления. Возвращайте его в помещение для содержания животных, как только он придет в себя, сможет стоять прямо, демонстрировать скоординированные движения и самостоятельно добывать воду и пищу.
3. Долгосрочное послетрансплантационное лечение
- Ежедневно наблюдайте за животными на предмет признаков боли и стресса, как определено ниже.
- Проверка на анорексию проявляется по отсутствию кала в клетке.
- Проверьте, не пьет ли животное воду, приводящую к обезвоживанию, о чем свидетельствует тентование кожи.
- Проверьте, не сгорбилось ли животное, не желает двигаться, не отдает ли предпочтение конечности или охраняет место разреза.
- Проверьте, не уходит ли животное за шерстью, отражаясь в взъерошенной или грязной шерсти.
- Проверьте, не вылизывает ли животное чрезмерно. Проверьте на наличие покраснения и отека в месте разреза и членовредительства.
- Проверьте на агрессивное поведение, особенно при попытке взять животное на руки.
- Проверьте, не дышит ли животное, затруднено ли дыхание и не имеет красновато-коричневых выделений из носа/глаз.
- Проверьте наличие сепсиса.
- Снимите швы через 14 дней после операции.
- Введите вторую дозу бупренорфинаSR (доза для крыс: 1,0 мг/кг подкожно) на 2-й день после операции (POD2; через 48 ч после начальной дозы).
- Начните еженедельную функциональную оценку на 4-й неделе после трансплантации.
- Кратко, под общим наркозом, зафиксировать переднюю конечность животного под углом 90°. Поместите два игольчатых электрода на расстоянии 1 мм друг от друга в подмышечной впадине рядом с прикреплением большой грудной мышцы к плечевой кости.
- Стимулируйте проксимальный срединный нерв чрескожно при напряжении 10 В, чтобы вызвать максимальное тетаническое сокращение сгибателей.
- Как только полное сгибание пальцев сформирует хватку, поместите металлическую петлю, соединенную с измерителем силы, на ладонь и закрепите ее внутри согнутых пальцев. Затем потяните измеритель силы до тех пор, пока хват не будет потерян, записывая максимальную силу (в ньютонах).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выживаемость трансплантата можно контролировать и определять с помощью макроскопического наблюдения. Репрезентативные картины как краткосрочного (POD7), так и долгосрочного наблюдения (POD120) представлены на рисунке 3. Трансплантат мог восстанавливаться без видимых признаков некроза. Данные о выживаемости представлены на рисунке 4. Образцы кожи и мышц собираются в назначенной конечной точке. Репрезентативные гистологические изображения представлены на
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ортотопическая трансплантация передних конечностей у крыс является широко используемой моделью в экспериментальной реконструктивной трансплантации, поскольку она не только содержит васкуляризированные композитные ткани, но и позволяет оценить функциональное восстановление. Традиционная техника наложения швов при сосудистом анастомозе очень сложна и требует передовых микрохирургических навыков, которые требуют многолетней микрохирургической подготовки. Чтобы значительно сократить время и ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Джеральд Брандахер — медицинский советник компаний X-Therma и Ossium Health.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами 1R43HL158398 (NIH), 5R44AI145782 (NIH) и Maryland Stem Cell 2020-MSCRFL-5414. Мы хотим выразить признательность нашему руководителю лаборатории, Анжеле Эстевес, за ее поддержку в этом исследовании.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10-0 Нестерильный микрошовный материал | AROSurgical | TK-107038 | |
| 4-0 Sharpoint Нейлон Черный | эстуры | A1667N | |
| 4-0 Sharpoint Polysyn Taper | esutures | G214N | |
| 5 мл шприцев | MDC | 2045 | |
| 6-0 шелк | Fisher Scientific | NC9742105 | |
| ABB-22 V Двойной микрососуд | S& T | 00480 | |
| B-1 V Зажим для одного микрососуда | S& T | 00462 | |
| BD Quincke Спинальные иглы | 405073 | ||
| Микроиглодержатели Castroviejo | F.S.T | 12061-02 | |
| Chatilon DFE II измеритель силы | Ametek | DFE II series | |
| Хлопковый наконечник | JH Supply store | 100252 | |
| Тонкие ножницы - Карбид вольфрама | F.S.T | 14569-09 | |
| Щипцы | S& T | FRS-15 RM-8 | |
| Марлевые губки | Fisher Scientific | 22-362178 | |
| Холстед-комары гемостаты | F.S.T | 13009-12 | |
| Гепарин | JHH Аптека | NDC 63323-540-05 | |
| И.В. Катетер рентгеноконтрастный 24 G | esutures | SMTH5053 | |
| Jewelers Биполярные коагулирующие щипцы, нержавеющая сталь | ASSI | 103000BPS03 | |
| Пружинные ножницы Vannas с круглой ручкой | F.S.T | 15400-12 | |
| Специальные щипцы | S& T | FRAS-15 RM-8 | |
| Сосудистые расширители - Сбалансированные приборы | F.S.T | 18602-15 |
Ссылки
- Schneeberger, S., et al. First forearm transplantation: outcome at 3 years. Am J Transplant. 7 (7), 1753-1762 (2007).
- Heinzel, J. C., et al. Evaluation of functional recovery in rats after median nerve resection and autograft repair using computerized gait analysis. Front Neurosci. 14, 593545(2020).
- Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regen Res. 15 (3), 491-502 (2020).
- Kern, B., et al. A novel rodent orthotopic forelimb transplantation model that allows for reliable assessment of functional recovery resulting from nerve regeneration. Am J Transplant. 17 (3), 622-634 (2017).
- Sarhane, K. A., et al. Defining the relative impact of muscle versus Schwann cell denervation on functional recovery after delayed nerve repair. Exp Neurol. 339, 113650(2021).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753(2014).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic hind limb transplantation in the mouse. J Vis Exp. (108), e53483(2016).
- Pendexter, C. A., et al. Development of a rat forelimb vascularized composite allograft (VCA) perfusion protocol. PLoS One. 18 (1), e0266207(2023).
- Amin, K. R., et al. Randomized preclinical study of machine perfusion in vascularized composite allografts. Br J Surg. 108 (5), 574-582 (2021).
- Rezaei, M., et al. Ex vivo normothermic perfusion of human upper limbs. Transplantation. 106 (8), 1638-1646 (2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеТеги
