Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Островковые клетки, полученные в результате трансплантации протоковых клеток крысам

468 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68066

⸱

1 августа 2025 г.

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Островковые клетки, полученные из протоковых клеток, демонстрируют потенциал для лечения диабета за счет снижения уровня глюкозы в крови и увеличения выработки инсулина у крыс с диабетом. Тем не менее, остаются проблемы в обеспечении достаточной функции клеток, иммунологической защиты и безопасности. Необходимы дополнительные исследования для повышения терапевтической способности этих веществ.

Аннотация

Использование островковых клеток, полученных из протоковых клеток, стало потенциальным подходом к лечению диабета 1 типа. У пациентов с сахарным диабетом недостаточный синтез инсулина в организме из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток поджелудочной железы, отвечающих за выработку инсулина. В этих рамках целью трансплантации островковых клеток является восстановление способности пациентов вырабатывать инсулин. Однако такие препятствия, как недостаточное получение островковых клеток из донорских поджелудочных желез и иммунные реакции, препятствуют широкому применению этого метода терапии. При определенных обстоятельствах протоковые клетки поджелудочной железы обладают способностью трансформироваться в клетки, вырабатывающие инсулин. Эти клетки могут быть культивированы в контролируемой среде и преобразованы в островковые клетки, которые обладают способностью высвобождать инсулин, что делает их пригодными для трансплантации. Эта инновационная стратегия позволяет остановить прогрессирование диабета 1 типа и снизить зависимость от инъекций инсулина. В этом исследовании островковые клетки, полученные из протоковых клеток, были трансплантированы в печень через воротную вену печени у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином. После трансплантации мы отметили значительное снижение уровня глюкозы в крови крыс, начиная с 5-го дня, которое продолжалось в течение 15 дней. Кроме того, внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT) показал, что крысы с диабетом, получавшие трансплантацию островковых клеток, вырабатывали значительно больше инсулина, чем контрольная группа. Эти результаты свидетельствуют о том, что островковые клетки, полученные из протоковых клеток, могут быть многообещающим терапевтическим подходом для лечения диабета. Основными препятствиями в этой области исследований являются достижение достаточной функциональной способности клеток, их защита от иммунной системы и обеспечение их безопасности для терапевтического применения. Будущие исследования могут дать важные выводы для оптимизации использования этих клеток в терапевтических условиях, уделяя особое внимание повышению эффективности и безопасности.

Введение

Диабет 1 типа — это стойкое аутоиммунное заболевание, характеризующееся разрушением бета-клеток в поджелудочной железе, вырабатывающих инсулин. Современные методы лечения в основном включают долгосрочную инсулинотерапию, которая, хотя и успешна в контроле уровня глюкозы в крови, не обеспечивает излечения от этого состояния и не останавливает его прогрессирование. Исследование альтернативных методов лечения сахарного диабета 1 типа мотивировано потребностью в более эффективных альтернативах, чем существующий акцент на лечении инсулином. Текущие исследования были вызваны этим, сосредоточившись на альтернативных методах лечения, таких как трансплантация островковых клеток, которая направлена на восстановление врожденной способности организма вырабатывать инсулин. Тем не менее, тот факт, что донорские островковые клетки трудно найти и существует вероятность иммунологического отторжения, затрудняет широкое использование этого метода. В результате научное сообщество стало проявлять все больший интерес к поиску альтернативных источников клеток, вырабатывающих инсулин 1,2,3.

Этот метод направлен на использование потенциала регенерации этих клеток для создания устойчивого снабжения инсулин-секретирующими клетками4. Исследования in vitro продемонстрировали способность этих протоковых клеток трансформироваться в функциональные бета-подобные клетки, способные к секреции инсулина в ответ на стимуляциюглюкозой. Это направление исследований особенно важно, учитывая неблагоприятные результаты, связанные с обычной трансплантацией островковых клеток из-за сложных иммунных реакций. Многочисленные исследования показывают, что протоковые клетки не только обладают внутренней способностью вырабатывать инсулин, но также могут демонстрировать характеристики, которые могут способствовать иммунной толерантности, тем самым смягчая некоторые проблемы, связанные страдиционными методами трансплантации. Эти клетки могут быть культивированы вне тела, преобразованы в клетки, напоминающие островки, которые могут выделять инсулин, и впоследствии имплантированы людям с диабетом. Доклинические исследования, которые включали в себя эксперименты на крысах с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, показали, что трансплантация этих клеток может эффективно снижать уровень глюкозы в крови и усиливать секрецию инсулина.

Наш подход был направлен на ускорение процесса дифференцировки и улучшение функциональности инсулин-продуцирующих клеток путем добавления в стандартную среду для клеточных культур инсулин-трансферрин-селен (ITS)10,11,12, изоксазол 9 (ISX-9)13,14 и GLP-115. Сообщается, что эти факторы играют важную роль в облегчении дифференцировки поджелудочной железы и усилении секреции инсулина. Интеграция этих компонентов направлена на достижение более эффективного функционирования островковых клеток, обеспечивая их способность вырабатывать и высвобождать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой 9,10,11,12,13,14.

При трансплантации островковых клеток иммунное отторжение представляет собой значительное препятствие для достижения успешных результатов. Аллогенные трансплантированные островки уязвимы к иммунной атаке, что требует иммуносупрессивной терапии для предотвращения отторжения16,17. Участие протоковых клеток поджелудочной железы в иммунном отторжении во время трансплантации островковых клеток представляет собой развивающуюся область исследований. Считается, что протоковые клетки могут обладать свойствами, которые могут снизить иммунное отторжение, что повысит вероятность выживания и правильной работы трансплантированных островков. Ilieva et al. продемонстрировали, что островки, культивируемые совместно с протоковыми клетками, демонстрируют снижение центрального некроза и апоптоза, что указывает на защитный эффект против иммуноопосредованного повреждения. Этот эффект может быть опосредован такими факторами, как инсулиноподобный фактор роста 2 (ИФР-2), секретируемый протоковыми клетками, как отмечают Marín-Cañas et al. (2019)18. Защитный эффект имеет важное значение, поскольку иммунное отторжение представляет собой значительную проблему для успеха трансплантации островковых клеток, особенно при диабете 1 типа. Протоковые клетки в островковых трансплантатах были связаны с улучшенной функцией трансплантата и выживаемостью, что, вероятно, связано с их способностью секретировать иммуномодулирующие факторы, которые смягчают иммунный ответ19.

Несмотря на многообещающие достижения, необходимо устранить некоторые препятствия, чтобы гарантировать операционную эффективность и безопасность этих клеточных терапий для клинического использования. Важно убедиться в том, что индуцированные клетки демонстрируют функциональные свойства, сравнимые с нативными бета-клетками, и разработать эффективные методы защиты этих клеток от атак иммунной системы, чтобы обеспечить их длительную выживаемость и функциональность20,21. По мере развития этой области исследований всесторонние знания и решение этих препятствий будут иметь важное значение для использования перспектив инсулин-продуцирующих клеток, полученных из протоковых клеток, в лечении диабета 1 типа 22,23,24.

Данное исследование направлено на оценку in vivo эффективности островковых клеток, полученных из протоковых клеток, разработанных в оптимальных условиях, для восстановления гликемического контроля в модели крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ARRIVE, гарантируя, что дизайн, проведение и отчетность по исследованию соответствовали высоким стандартам благополучия животных и экспериментальной честности (https://arriveguidelines.org). Университет Медиполь в Анкаре получил одобрение комитета по этике (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) и разрешение учреждения. Все методы были выполнены в соответствии с действующими инструкциями и регламентами. Были приняты все меры для минимизации страданий животных и использования минимального количества животных, необходимого для достижения научных целей.

1. Приготовление растворов

  1. Ферментный раствор: Приготовьте раствор коллагеназы с 50 мг порошкообразной коллагеназы Clostridium histolyticum типа V. Приготовьте раствор объемом 50 мл, комбинируя коллагеназу с HBSS (содержащим Ca-Mg) для достижения концентрации 1 мг/мл. Используйте 7 мл раствора на образец, а остаток поставьте в морозильную камеру при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая концентрация коллагеназы составляет 1 мг/1 мл. Перед тем, как попасть в шприцы, коллагеназу необходимо смешать с заранее приготовленным раствором HBSS до концентрации 1 мг/мл.
  2. Раствор для промывки 1: Извлеките 62,5 мл из 500 мл фенолового HBSS, не содержащего красных веществ. Добавьте 50 мл FBS к оставшемуся HBSS очень осторожно. Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (P/S), 5 мл L-глутамина (L-Gln) и 2,5 мл 1 M HEPES. Доведите объем до 500 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С добавлением фенольного красного конечный объем состоит из 88% HBSS, 10% FBS, 1% P/S и 1% l-Gln. Чтобы предотвратить пенообразование и обеспечить точность, осторожно вводите фетальную бычью сыворотку шаг за шагом.
  3. Питательная среда для клеток и промывочный раствор 2: Извлеките 62,5 мл из 500 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI w/L-Gln). Соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить вспенивание FBS во время постепенного добавления 50 мл к оставшемуся RPMI. Добавьте 2,5 мл 1 M HEPES, 5 мл P/S и 5 мл L-Gln. Убедитесь, что общий объем составляет 500 мл. Хранить при температуре 4 °C.
  4. Растворы градиента плотности: Приготовьте окончательные растворы плотности путем разбавления раствора плотности 1100 мг/мл раствором HBSS для получения промежуточного диапазона плотности 1062-1096 мг/мл. Чтобы убедиться в точности, проверьте с помощью денситометра плотность каждого приготовленного раствора. Используйте концентрационный раствор 1077 в качестве эталона. Как только желаемые концентрации (1062-1096 мг/мл) будут достигнуты, переложите растворы в герметичные контейнеры и храните в темном месте при температуре 4 °C для поддержания их стабильности.
  5. Приготовьте 0,4% раствор трипана синего цвета. Развитию клеток способствует фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), который имеет pH 7,4.
  6. Среда для выращивания клеточных культур: Смешайте по 43,4 мл среды Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) и модифицированной среды Dulbecco Eagle's Medium (DMEM-низкий уровень глюкозы). Добавьте 10% фетальную телячью сыворотку (FCS), 1% инсулин-трансферрин-селен (ITS), 1% L-глутамин (L-Gln), 1% пенициллин-стрептомицин (P/S) и 0,2 мл 1 М HEPES. Составьте итоговый объем до 100 мл. Хранить при температуре 4 °C.
  7. Среда для дифференцировки клеточных культур: добавьте 43,4 мл RPMI с 43,4 мл DMEM с низким уровнем глюкозы. Добавьте в смесь 10% FCS, 1% инсулин-трансферрин-селен (ITS), 1% L-Gln, 1% P/S и 0,2 мл 1 M HEPES. Кроме того, добавьте 1 мкл изоксазола 9 (ISX-9), разведенного в 4 мл этанола, в среду для дифференцировки. Наконец, добавьте 24 мкл раствора глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1) в концентрации 50 нМ в среду для культивирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ISX-9 и GLP-1 добавляются в свежем виде только во время изменения культуры; Они заранее подготовлены. Для любого культурного материала требуется свежая подготовка.
  8. Раствор дитизона (ДТЗ): Растворите 100 мг дитизона в 20 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и хорошо перемешайте. Добавьте в полученный раствор 30 мл HBSS и размешайте до получения однородной смеси. Отфильтруйте раствор фильтрами 0,2 или 0,4 мкм. Добавьте в отфильтрованный раствор 50 мл HBSS. На этикетке раствора указана дата приготовления. После того, как твердые частицы полностью расщепляются, пропустите раствор через фильтрующее устройство 0,4 мкм. Поместите отфильтрованный раствор в пробирки объемом 2 мл и используйте их сразу, после того как они оттают. Храните приготовленный раствор при температуре -20 °C.
  9. Раствор Кребса: В емкость объемом 250 мл добавьте 1,68 г хлорида натрия (на 115 мМ), 0,50 г гидрокарбоната натрия (на 24 мМ), 0,09 г хлорида калия (чтобы получилось 5 мМ), 0,05 г хлорида магния (на 1 мМ), 0,09 г хлорида кальция (на 2,5 мМ) и 0,25 г бычьего сывороточного альбумина (на 0,1%). Добавьте 6,25 мл 1 М HEPES. Отрегулируйте объем до 250 мл, добавив деионизированную воду, и перемешайте до однородности. Отрегулируйте pH в диапазоне от 7,3 до 7,5 с помощью 1 М NaOH или 1 М HCl. Фильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Храните растворы при комнатной температуре. На водяной бане при температуре 37 °C добавьте растворы, когда они будут готовы к использованию.
  10. Раствор с высокой концентрацией глюкозы: отмерьте и добавьте 149,1 мг D-(+)-глюкозы в пробирку. Добавьте в пробирку 50 мл раствора Кребса и тщательно перемешайте, встряхивая. Профильтруйте через фильтр 0,22 мкм.
  11. Раствор с низкой концентрацией глюкозы: Смешайте 1 мл 16,7 мМ раствора с высокой концентрацией глюкозы с 9 мл раствора Кребса.

2. Изоляция поджелудочной железы от крыс

  1. Начните с когорты из трех лабораторных крыс-альбиносов Вистар (3 месяца/самец) весом от 220 г до 280 г. Обезболивайте животных комбинацией кетамина (35-50 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг). Проверьте глубину анестезии по отсутствию реакции отвода педали. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы они не высыхали.
  2. Начните хирургический процесс с разреза живота по средней линии живота на 3-4 см по белой линии с помощью ножниц. (Рисунок 1А). Выполняйте деликатные манипуляции с печенью, оказывая мягкое физическое давление пальцами на грудную клетку, чтобы поднять диафрагму. Выньте печень наружу и положите ее на стерильную марлю для стабильности.
  3. Приготовьте стандартизированный раствор коллагеназы в дозировке 28 мг/г массы тела и наберите 7 мл (около 7 г) в шприц для крыс массой от 250 до 300 г. Изменяйте объем раствора в зависимости от массы тела каждого животного.
  4. Надрезать проток поджелудочной железы. С помощью тонких сосудистых ножниц разрежьте проток возле печени. Используйте анатомические положения относительно поджелудочной железы и окружающей сосудистой сети для идентификации протока. Используйте признаки местоположения, такие как близлежащие кровеносные сосуды и особенности тканей, чтобы обеспечить точность. Сделайте один идеальный надрез в этом месте для окклюзии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез был минимальным - слишком маленьким, чтобы его можно было точно измерить, - но достаточно широким, чтобы можно было ввести катетер. Разрез позволяет обеспечить плавное и эффективное размещение катетера, обеспечивая минимальную травматизацию окружающих тканей.
  5. Вставьте катетер со встроенным наконечником в созданное отверстие протока (рисунок 1B). После правильной установки закрепите катетер с помощью хирургического зажима (например, микрощипцов), чтобы избежать смещения.
  6. Вводите ферментативный раствор коллагеназы путем контролируемой инфузии через постепенное, преднамеренное подавление поршня.
  7. После надувания используйте тонкие хирургические инструменты, чтобы аккуратно отделить ткань поджелудочной железы от окружающих структур. Выполняйте иссечение быстро и с точными и мягкими маневрами, чтобы свести к минимуму повреждение тканей. Сразу после удаления поместите поджелудочную железу в трубку объемом 50 мл на лед, чтобы остановить любую активность ферментов.
  8. Весь процесс должен занять около 60 с на одну поджелудочную железу25. Кроме того, до тех пор, пока все поджелудочные железы не набухнут, держите коллагеназу и удаленные поджелудочные железы на льду.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Обработка поджелудочной железы. (А) Пережатие протока поджелудочной железы, входящего в двенадцатиперстную кишку, и (Б) Раздувание коллагеназы 5-го типа приводит к изображению поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3 Выделение протоковых клеток из ткани поджелудочной железы

  1. После хирургического удаления инкубируйте поджелудочную железу на водяной бане при температуре 37 °C в течение 12 минут.
  2. Добавьте в пробирку 25 мл промывочного раствора 1 для нейтрализации активности коллагеназы. Вручную встряхните трубку, чтобы способствовать расщеплению ткани поджелудочной железы. Все последующие процедуры выполняют под стерильным полем с ламинарным потоком.
  3. Держите все носители на льду. Центрифугируйте образцы при температуре 4 °C, при 100 x g в течение 1 минуты и установите тормоз на максимальную настройку. Выбросьте надосадочную жидкость. К ячейке гранулы добавьте 25 мл промывочного раствора 1 и повторно суспендируйте смесь.
  4. Снова проведите центрифугирование и выбросьте надосадочную жидкость. К грануле добавьте 25 мл промывочного раствора 1 и повторите. Процедите обработанную ткань поджелудочной железы через стальную сетку длиной 425 мкм, чтобы удалить любые остаточные сосудистые или непереваренные фрагменты тканей.
  5. После фильтрации доведите объем до 25 мл с моющим раствором 1. Выполните центрифугирование 1x при 100 x g в течение 1 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость.
  6. Перенесите гранулу в новую пробирку с помощью стерильной пластиковой пипетки после добавления 50 мл среды RPMI. Снова центрифугируйте образец при 100 x g в течение 1 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и храните гранулу для дальнейшего анализа.
    Примечание: Все остальные этапы выполнялись в ламинарных шкафах в стерильных условиях, пригодных для экспериментов с клеточными культурами.
  7. Добавьте 10 мл раствора плотности 1,077 к грануле, полученной после последней, с последующим мягким разрушением и гомогенизацией гранулы путем постукивания пальцем по краю трубки.
    Примечание: Диапазон плотности для выделения островковых клеток из окружающей ткани поджелудочной железы составляет приблизительно 1,077, в отличие от плотности среды, которая составляет приблизительно 1,00126. Следовательно, для этой цели мы использовали решение плотности 1.077.
  8. Добавьте 10 мл RPMI и центрифугируйте при 600 x g в течение 12 минут при 4 °C с выключенными тормозами. Эта процедура установила деление на основе плотности внутри трубок, что привело к накоплению островковых клеток в слое прямо под слоем RPMI, расположенном непосредственно под слоем RPMI.
  9. Удаляются как островковые клетки, так и РПМИ. Целью этого этапа было очищение островковых клеток для улучшения их удаления из тканей поджелудочной железы, что приводит к более чистому процессу выделения протоковых клеток.
  10. Удалите лишнюю ткань поджелудочной железы в новую пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки. Добавьте 10 мл раствора плотности 1,096 в тканевую гранулу.
  11. Затем медленно добавьте 10 мл градиента раствора плотности 1,062 с помощью шприца. Обратите внимание на поддержание однородного распределения компонентов. Сделайте градиент, уложив растворы в порядке от самой плотной к наименее плотной.
  12. Добавьте сверху 10 мл RPMI. Центрифужные пробирки при 600 x g в течение 12 мин при 4 °C без тормозов. После вращения видны слои разной плотности. Протоковые клетки находятся в среднем слое, ниже слоя RPMI.
  13. Осторожно удалите протоковые клетки с помощью одноразовой пипетки Пастера и поместите их в отдельную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 25 мл моющего раствора 2 и аккуратно перемешайте суспензию, постукивая пальцем по тюбику.
  14. Вращайте пробирку при давлении 100 x g в течение 1 минуты и выбросьте надосадочную жидкость. Выполните еще два раунда центрифугирования с гранулой. После последней промывки добавьте в гранулу 27 мл моющего раствора27.

4. Выделение и культивирование протоковых клеток

  1. Инокулируйте собранные клетки в колбу T25 и добавьте 5 мл предварительно подогретых жидкостей для клеточных культур. Поддерживайте в инкубаторе 5%CO2и 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание стабильной физиологической температуры важно для работы клеточной культуры, поэтому перед использованием все растворы были нагреты примерно до 37 °C.
  2. Через 24 часа осторожно аспирируйте среду. Дважды промойте ячейки моющим раствором 2. Добавьте свежую питательную среду для клеточных культур и верните колбу в инкубатор. Те клетки, которые прилипали к поверхности колбы, назывались протоковыми клетками.
  3. Заменяйте питательную среду каждые 3 дня. Если цвет среды меняется очень быстро, это означает, что она теряет питательные вещества и становится более кислой, что указывает на то, что среду следует менять чаще.
  4. Проходные ячейки после того, как клетки в колбах достигают 80% конфлюенции. Умойтесь 1-2 мл PBS 2x и избавьтесь от лишних сред.
  5. Добавьте 2 мл раствора ферментативной диссоциации (без фенольного красного), чтобы запустить процесс ферментативного расщепления и отделить клетки от поверхности колбы.
  6. Инкубировать в течение 2-3 мин и оценить отслойку клеток под 10-кратным микроскопом. Если клетки остаются частично прикрепленными, повторно инкубируйте при 37 °C в течение еще 2 минут.
  7. После того, как клетки были полностью отделены от поверхности колбы, остановите расщепление фермента, добавив около 8 мл питательной среды для клеток, что в 4 раза больше объема раствора для ферментативной диссоциации. Аккуратно постучите по стенкам колбы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постукивание, которое может помочь клеткам разделиться, сокращает общее время инкубации и предотвращает повреждение ферментами клеточной мембраны, гарантируя, что это произойдет после длительного контакта с раствором ферментативной диссоциации.
  8. После добавления среды для клеточных культур перенесите клеточную суспензию в пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 150 x g в течение 10 минут при 25 °C с настройкой легкого замедления (скорость 9 перерывов) для гранулирования клеток.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 6-8 мл моющего раствора 2. Повторите центрифугирование, как описано выше. Выбросьте надосадочную жидкость. Процедуру повторяли, чтобы гарантировать полное устранение ферментативного диссоциативного раствора.
  10. Используя щадящее пипетирование, ресуспендируйте гранулу в 5 мл свежей клеточной питательной среды, чтобы получить однородную клеточную суспензию. На этом этапе проведите подсчет клеток.
  11. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  12. Семян 1 × 10по 6 ячеек в колбе Т25 с использованием подсчитанной суспензии.
    Примечание: К этому времени большинство клеток были идентифицированы как протоковые клетки. В каждую чашку было засеяно большое количество клеток в зависимости от количества клеток, которое было сделано. Основываясь на том, что мы увидели в экспериментах, клетки были распределены по двум разным колбам T25, как только они достигали наилучшего уровня слияния в одной колбе. Это было сделано для поддержания высокой эффективности распространения. С помощью этого метода нам удалось успешно отделить протоковые клетки от ткани поджелудочной железы крысы. После успешного разделения клетки были подготовлены к дальнейшим экспериментам в соответствии с планом исследования.
  13. Продолжайте культивирование до прохода 4. Пассаж клеток при необходимости для поддержания оптимальных условий роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с Отрывка 4 и далее, наблюдался заметный рост количества клеток между 3 и 9 днями. Поскольку клетки, как правило, менее способны делиться после большего количества циклов, этот метод убедился, что жизнеспособных клеток достаточно. Как только протоковые клетки достаточно выросли, они начали превращаться в островковые клетки. Основываясь на том, что мы обнаружили, клетки между стадиями 3 и 6 имеют самые быстрые темпы пролиферации. Пассаж 4 показывает особенно заметное увеличение количества протоковых клеток. Однако после отрывка 6 произошло снижение пролиферативной способности. Протокол был скорректирован на основе этих результатов, чтобы получить нужное количество клеток, сохраняя при этом их жизнеспособность иполезность.

5. Дифференцировка протоковых клеток в островковые кластеры

  1. Забор прохода 4 протоковых клеток с помощью стандартной процедуры пассирования. Дважды промойте 1-2 мл PBS, чтобы удалить остатки среды и неприкрепленные клетки.
  2. Добавьте в колбу 2 мл раствора ферментативной диссоциации (без фенольного красного). Инкубируйте при 37 °C в течение 2-3 минут и контролируйте под 10-кратным микроскопом.
  3. Если клетки остались прикрепленными, инкубировать еще 2 минуты. Остановите ферментативную реакцию, добавив 8 мл питательной среды для клеток.
  4. Переложите суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 150 × г в течение 10 минут при 25 °C, установив 9 для ускорения и замедления.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость. Суспендировать гранулу в 6-8 мл моющего раствора 2. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Окончательную гранулу суспендировать в 5 мл свежей среды. Подсчитайте ячейки, как описано выше.
  7. Высевают 1 × 10по 5 клеток в лунку в шестилуночный планшет, добавляя по 3 мл среды на лунку. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2.
  8. Заменяйте среду каждые 3 дня в течение первых 7 дней. Отрегулируйте частоту, если цвет среды быстро меняется.
  9. Постепенно переходите на дифференцировочную среду через 7 дней. Продолжайте культивирование в течение 15 дней (7 дней роста + 8 дней дифференцировки). Меняйте среду каждые 2 дня во время дифференцировки.
  10. На 8-й день начните фазу дифференцировки. Через 4 дня дважды промойте клетки PBS и добавьте 500 мкл раствора ферментативной диссоциации.
  11. Инкубировать 2-3 мин, остановив реакцию, добавив 2 мл питательной среды. Центрифуга при 150 x g в течение 10 минут при 25 °C. Ресуспендировать и повторно засеять 1 x 105 клеток в лунку в шестилуночных планшетах.
  12. На 15-е сутки проводят полный микроскопический анализ, чтобы четко охарактеризовать и подтвердить образование островковых клеточных агрегатов24.

6. Количественное определение концентрации цинка в дифференцированных протоковых клетках с помощью дитизона

  1. Размораживание и балансировка решения DTZ при хранении при температуре −20 °C. Добавьте по 3-4 капли раствора DTZ в каждую лунку 15-дневной дифференцировки клеток. Наблюдайте под микроскопом. Определите инсулин-продуцирующие клетки с помощью красного окрашивания28 (рисунок 2).

figure-protocol-2
Рисунок 2: Микроскопические изображения островковых протоковых клеток. Изображения в (A) день 11 культуры (20x), (B) день 13 культуры (20x), (C, D) день 15 культуры (20x). Клетки визуализировали после окрашивания дитизоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

7. Тест на стимуляцию глюкозы

  1. Засейте 1 x 104 островковых кластера на лунку в 24-луночный планшет с 1 мл дифференцировочной среды на лунку.
  2. На 15 день стимулируйте клетки глюкозой. Удалите существующую среду и добавьте 1 мл раствора с низким содержанием глюкозы (1,67 мМ). Инкубировать 1 ч при 37 °C.
  3. Соберите среду и переложите в пробирки объемом 2 мл. Добавьте 1 мл раствора с высоким содержанием глюкозы (16,7 мМ). Инкубировать 1 ч. Соберите среду для анализа. Собирают среду для культивирования клеток через каждые 1 ч интервал между добавлением различных растворов глюкозы.
  4. Проводите инсулиновый ИФА в соответствии с инструкциями производителя. После извлечения из пакета из фольги дайте микропланшету сбалансироваться до комнатной температуры перед началом процедуры ИФА.
  5. Добавьте 10 мкл реагента в пробу, контрольную и стандартную лунки. Добавьте 75 мкл рабочего сопряженного раствора. Высадите тарелку и выдержите в течение 2 ч при комнатной температуре с встряхиванием (700-900 об/мин).
  6. Промойте лунки 6 раз 350 μл промывочного буфера. Добавьте 100 мкл субстрата 3,3',5,5,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) в лунку. Укупорьте пластины и выдержите 15 минут в темноте с встряхиванием (700-900 об/мин) при комнатной температуре.
  7. Добавьте 100 μл стоп-раствора на лунку и перемешайте, осторожно перемешивая планшет, чтобы остановить процесс. Удалите пузырьки и считайте абсорбцию при 450 нм. Отмеряйте в течение 30 мин после добавления стоп-раствора27.

8. Трансплантация островков и островковых протоковых клеток

  1. Обезболивайте крыс с помощью кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Продезинфицируйте и задрапируйте место операции. Сделайте разрез по средней линии в 2-3 см.
  2. Сместите кишечник и обнажите воротную вену с помощью ретракторов. Проведите венотомию и введите катетер, предварительно заполненный физиологическим раствором (рисунок 3A).
  3. Влейте 100-500 мкл клеточной суспензии в воротную вену. Снимите катетер и закройте венотомию швами или клеем. Закройте брюшную полость и следите за восстановлением, обеспечивая обезболивание по мере необходимости (Рисунок 3B).

figure-protocol-3
Рисунок 3: Трансплантация островков и островковых клеток. (А) Стерильная внутривенная интракатетизация, используемая для трансплантации островков и островковых клеток. (В) Трансплантация островков и островковых клеток в стерильный шприц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

9. Стрептозотоцин (STZ) индуцировал диабет у крыс

  1. Быстрые крысы 12 ч. Вводите 45 мг/кг СТЗ внутрибрюшинно, растворив в холодном цитратном буфере (pH 4,5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Натощак в течение 12 часов перед инъекцией STZ усиливает экспрессию GLUT2, что облегчает транспортировку глюкозы в бета-клетках поджелудочной железы. Этот процесс увеличивает поглощение STZ клетками, что приводит к большему повреждению бета-клеток. Этот механизм способствует прогрессированию более значительной гипергликемии и повышает эффективность модели диабета.
  2. Подтвердить сахарный диабет через 48-72 ч после инъекции глюкозой крови >250 мг/дл. Классифицировать крыс, которые обычно достигали значений глюкозы в крови более 250 мг/дл, как диабетиков и включить их в эксперимент29.

10. Подготовка островков и островкоподобных клеток к трансплантации

  1. Забор клеток после обработки раствором ферментативной диссоциации в течение 1 мин. Соскребите ячейки, которые прилипают к поверхности. Замените на свежую среду и соберите ячейки.
  2. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин. Ресуспендируйте гранулу в 100-150 μл физиологического раствора. Выполните подсчет клеток и отрегулируйте количество клеток до 1000 IEQ или 800 островков на крысу или 1 x 105 островковых клеток на крысу.

11. Трансплантация воротной вены

  1. Обезболивание животных путем внутрибрюшинного введения кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
  2. Продезинфицируйте область живота животного стерильным раствором (бетадин или 70% этанол). Оберните операционную область стерильной простыней.
  3. Сделайте разрез по средней линии, примерно 2-3 см в длину, чтобы получить доступ к брюшной полости.
  4. Сместите кишечник, чтобы обнажить печень. Закрепите левую и правую доли печени стерильными ретракторами. Обнажите вентральную поверхность печени, чтобы найти воротную вену.
  5. Предварительно промойте полиэтиленовый катетер (ПЭ-10 или ПЭ-50) физиологическим раствором и заполните его целиком. Используйте микрохирургические щипцы для удержания ветви воротной вены - обычно левой или правой боковой ветви.
  6. Проведите незначительную венотомию (около 1-2 мм). Осторожно введите катетер в место венотомии. Чтобы предотвратить смещение, используйте шовный материал или щипцы для фиксации катетера, обычно с помощью шовной нити 6-0.
  7. Проверьте точное положение катетера, постепенно вводя стерильные физиологические растворы. Катетер постепенно доставлял подготовленную островковую клетку и суспензию островковых клеток в воротную вену. Общий объем составляет 100-500 μл.
  8. По завершении инфузии удалите катетер и используйте стерильный тканевый адгезив или рассасывающиеся швы, чтобы запечатать место венотомики.
  9. Проведите лечение кровотечения. Переместите все ткани, окружающие печень, и зашите мышцы живота с помощью рассасывающейся нити. Закрепите кожу швами или зажимами.
  10. Держите животное под присмотром в теплой среде. Обеспечьте подходящими анальгетиками для снятия боли во время выхода из анестезии (например, бупренорфин 0,1 мг/кг). Наблюдайте за животными в течение 48 часов. Осмотрите на наличие признаков инфекции, отека в месте операции или кровотечения30.

12. Мониторинг уровня глюкозы в крови

  1. Оцените исходный уровень глюкозы в крови. Осторожно держите крысу и с помощью ланцета сделайте небольшой надрез на кончике хвоста. Аккуратно удалите первоначальную каплю крови с помощью стерильного ватного тампона.
  2. Нанесите вторую каплю крови на тест-полоску для определения уровня глюкозы и задокументируйте исходный уровень глюкозы31.

13. Внутрибрюшинный глюкозотолерантный тест

ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы проходят внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT) для оценки эффективности клиренса глюкозы в кровотоке. Этот тест дает представление о метаболизме глюкозы, чувствительности к инсулину и возможных диабетических состояниях. Внутрибрюшинный глюкозотолерантный тест проводили на 15-е сутки после трансплантации. Основным обоснованием для введения определенной продолжительности голодания перед ИПГТТ является стабилизация базального уровня глюкозы и обеспечение постоянного метаболического состояния. Период голодания способствует истощению запасов гликогена в печени, что позволяет более надежно оценить реакцию толерантности к глюкозе. Голодание в течение 6 часов уменьшает постпрандиальные эффекты, в то время как ночное голодание (примерно 12-16 часов) может иметь различные последствия, потенциально влияя на чувствительность к инсулину и метаболизм глюкозы.

  1. Подвергайте крыс 6-часовому периоду голодания, при этом доступ к воде разрешен только на ночь, при этом продолжительность голодания не превышала 12 часов. Обеспечьте равномерный период голодания для всех испытуемых, чтобы уменьшить вариабельность при измерении уровня глюкозы.
  2. Перед введением глюкозы взвесьте крыс. Для приготовления стерильного раствора следует растворить 20 г глюкозы в 100 мл стерильного физиологического раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная дозировка обычно составляет 2 г глюкозы/кг массы тела (2 г/кг). Общий объем определяется массой тела животного.
  3. Оцените исходный уровень глюкозы в крови. Держите крысу и с помощью ланцета сделайте небольшой надрез на кончике хвоста. Аккуратно удалите первую каплю крови с помощью стерильного ватного тампона.
  4. Нанесите вторую каплю крови на тест-полоску с глюкозой и запишите исходный уровень глюкозы.
  5. В зависимости от массы тела крысы введите соответствующее количество раствора глюкозы из расчета 2 г/кг.
  6. Перед внутрибрюшинным (ВП) введением раствора глюкозы осторожно обрабатывайте крысу. Вводите глюкозу в брюшную полость, а не в подкожную клетчатку или любой другой орган, и убедитесь в правильности ее введения.
  7. После инъекции глюкозы собирайте образцы крови через определенные промежутки времени, чтобы контролировать уровень глюкозы. Типичные временные интервалы составляют 15, 30, 60, 90 и 120 минут после инъекции.
  8. В каждой точке соберите кровь, перерезав хвостовую вену. Перед каждым забором крови следите за тем, чтобы хвост был протерт спиртовым тампоном.
  9. В каждый назначенный момент времени измеряйте уровень глюкозы и документируйте с помощью глюкометра.
  10. Во время теста следите за крысами на предмет любых признаков дискомфорта или побочных реакций. Чтобы свести к минимуму стресс для животных между измерениями, поддерживайте теплую и тихую среду.
  11. После последнего измерения уровня глюкозы в крови очистите раны на хвосте и успокойте животных29.

14. Анализ на инсулин методом ИФА после забора крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги в этом протоколе заключаются в взятии крови из брюшной аорты крысы и последующем использовании метода иммуноферментного анализа (ИФА) для тестирования на инсулин.

  1. Обезболите крысу перед забором крови, как описано ранее. Поместите крысу под наркозом в положение лежа на спине на стерильную операционную платформу.
  2. Побрейте область живота и продезинфицируйте область с использованием 70% раствора этанола или йода для обеспечения стерильности.
  3. Сделайте разрез по средней линии скальпелем, чтобы проникнуть в кожу и мышечные слои и обнажить брюшную полость.
  4. Втяните кишечник, чтобы получить доступ к брюшной аорте, расположенной рядом с позвоночником. С помощью гепаринизированного шприца введите иглу в брюшную аорту под небольшим углом.
  5. Соберите кровь (обычно 1-3 мл, в зависимости от размера крысы) в шприц. Применяйте постепенное и последовательное отсасывание, чтобы избежать сосудистого коллапса или гемолиза крови.
  6. Собранную кровь поместите в центрифужную пробирку и держите ее на льду.
  7. Если животное подлежит эвтаназии после процедуры, проведите эвтаназию в соответствии с этическими принципами учреждения.
  8. Собранную кровь центрифугируют при 300 х г в течение 10-15 минут при 4 °С, чтобы обеспечить отделение плазмы или сыворотки. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и храните при температуре -80 °C для последующего анализа инсулина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать гемолиза во время забора крови, так как это может повлиять на точность результатов ИФА (Рисунок 4)29.

figure-protocol-4
Образцы крови были получены из хвостовой вены крыс в кровяные пробирки для анализа инсулина по завершении эксперимента на 15-й день после трансплантации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

15. Измерение уровня инсулина методом иммуноферментного анализа

  1. Приготовьте набор инсулинового ИФА в соответствии с инструкцией производителя. Перед началом анализа дайте всем реагентам, стандартам и образцам нагреться до комнатной температуры.
  2. Определите необходимое количество лунок на планшете ИФА для стандартов, контроля и образцов сыворотки крови крыс.
  3. Подготовьте образцы сыворотки крови крыс к анализу, разбавив их в соответствии с протоколом набора ИФА, например, разведением в соотношении 1:10 в PBS.
  4. Подготовьте стандарты инсулина путем последовательного разведения для получения стандартной кривой, например, в диапазоне от 0 до 10 нг/мл.
  5. Дозируйте стандарты, контрольные и разведенные образцы сыворотки крови крыс (обычно 50-100 мкл на лунку) в указанные лунки планшета для ИФА. Диспонируйте раствор антител для обнаружения, входящий в комплект комплекта, в каждую лунку, чтобы обеспечить равномерное распределение.
  6. Инкубируйте планшет в течение указанного времени (обычно 1-2 часа) при комнатной температуре или в соответствии с предоставленной инструкцией.
  7. После инкубации убедитесь, что лунки промыты специальным промывочным буфером, обычно PBS, содержащим 0,05% Tween-20, для удаления несвязанных веществ. Выполните этап стирки от 3 до 5 раз в соответствии с инструкциями набора, следя за тем, чтобы остатки жидкости полностью удалялись после каждой стирки.
  8. Поместите раствор субстрата в каждую лунку. Субстрат будет взаимодействовать со связанным с ферментом антителом, вызывая изменение цвета; Интенсивность цвета связана с количеством инсулина, присутствующего в образце. Инкубируйте тарелку в темноте в течение времени, указанного в наборе, обычно от 15 до 30 минут.
  9. Добавьте стоп-раствор в каждую лунку, чтобы завершить колориметрическую реакцию. Изменение цвета стабилизируется после добавления стоп-раствора, который обычно имеет желтый цвет.
  10. Немедленно измерьте оптическую плотность (OD) каждой лунки с помощью планшетного ридера, установленного на 450 нм (или как указано в комплекте).
  11. Постройте стандартную кривую, построив график известных концентраций стандартов инсулина в сравнении с соответствующими значениями оптической плотности (OD).
  12. Рассчитайте концентрацию инсулина в образцах сыворотки крови крыс с помощью стандартной кривой и соответствующих значений OD. Уровни инсулина должны быть указаны в нг/мл или других соответствующих единицах29.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ с помощью световой микроскопии

Во время исследования протоковых клеток на14-е сутки анализ с помощью световой микроскопии показал, что клетки группируются и образуют островковую структуру. Это структурное изменение указывает на то, что по прошествии определенного периода протоковые клетки изменяют свои морфологические характеристики, вступая в организационный порядок и приобретая островковый вид. Склонность клеток к скоплению, вероятно, связана с эффектами ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изучение функциональной способности островковых клеток из различных источников привлекло значительный интерес к исследованиям диабета. Первоначальные исследования показывают, что эти клетки могут высвобождать инсулин при повышении уровня глюкозы, что позволяет предположить, что они могут имитировать функции естественных островков поджелудочной железы. Исследователи использовали окрашивание дитизоном для проверки фенотипического сходства островковых клеток с островками поджелудочной железы, о чем свидетельствует характерн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор (авторы) не сообщал о потенциальном конфликте интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить команду лаборатории за их вклад в исследование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% хлорид натрияSahar PharmaДля удаления поджелудочной железы и трансплантации клеток
10 мл серологическая пипетка - стерильнаяCorning4488Для выделения
24 лунки планшетCorning353047Для GSIS 
Серологическая пипетка 25 мл - стерильнаяCorning4489Для выделения
70% этанола ISOLAB64-17-5Для дезинфекции крыс
бетадином Батиконол 1186Для дезинфекции крыс
Biocholl 1077SigmaL6715-BCДля очистки поджелудочной железы
Biocoll, плотность 1,10 г/млSigmaL6155-BCДля очистки поджелудочной железы
Глюкометры и тест-полоски для глюкозыOn Call PlusДля измерения уровня глюкозы
в крови BSASigmaA9418Для подготовки к воздействию кребса
CaCl2Sigma57647902Для предварительного введения катетерного состава кребса
: Полиэтиленовый катетер (внутривенный интракат)  Бикакджылар24G  и 14GДля поджелудочной железы и печени 
ЦентрифугаThermoST1R PlusДля изоляции 
Коллагеназа типа V, ≥ 1 FALGPA единицы/мг твердый,
>125 CDU/мг твердый;		SigmaC9263- 1GДля переваривания поджелудочной железы
D-(+)-глюкоза Sigma50-99-7Для GSIS и IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130Для определения островков
DMSO SigmaD8779Для решения DTZ
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM— низкий уровень глюкозы)Gibco11885084Для клеточных культур
Eppendorf TubeISOLABДля промывки клеток
Falcon Tube (50 мл)ISOLABLB. IS.078.02.009Для выделения
фетальной бычьей сыворотки (FBS)SigmaN4637Для выделения и культивирования поджелудочной железы
Тонкоигольный и шовный материал (размер 6-0 или 7-0)PROLENE Blue 18" Игла P-1 | 8697GДля удаления поджелудочной железы и трансплантации
клеток глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) Аладдинrp174144Для клеточных культур
сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS с Ca-Mg) CapricornHBSS-1AДля подготовки ферментов
HBSS без кальция, без магния, без фенола красногоBIOCHROM  L2015Для выделения поджелудочной железы
HEPESLonzaДля клеточной культуры
Инсулин ElisaAlpco80-INSRT-E01Для инсулина Elisa
инсулин-трансферрин-селен (ITS)GibcoITS -GДля клеточной культуры
Изоксазол 9 (ISX-9)АладдинI304735-10мгДля клеточной культуры
KClSigma329820207Для подготовки кребса
Кетамин HCl 200 мг/млNexGenДля крыс при анестезии
Ламинарные проточные шкафыLabor IldamBSC-1100IIA2-XДля изоляции и посевного периода
ЛанцетыAyset28 GДля измерения уровня глюкозы
в кровиL-глютамин Sigma59202cДля выделения и культивирования поджелудочной железы
MgCl2Sigma329759772микропланшетов krebs
BioTek SynergyH1 Multimode ReaderДля иммуноферментного
шейкераVWR  444-0270Для инсулина ИФА
Микрохирургический микроскопEMZ-200TR3.9X Для удаления поджелудочной железы и трансплантации клеток
Микрохирургические ножницы и щипцыAesculapДля удаления поджелудочной железы и трансплантации клеток
Millicell Hanging Cell Culture Insert, полиэтилентерефталат 8.0&микро; М MILLIPOREPIEP30R48 Для GSIS 
NaClSigma7647-14-5Для приготовления кребса
NaHCO3Sigma144-55-8Для приготовления кребса
Pasteur Pipette 3 млBIOSIGMAДля выделения
пенициллина/стрептомицина SigmaДля выделения и культивирования поджелудочной железы
Фосфатный буферный солевой раствор (PBS)БИОХРОМ  L1815Для пропускания клеток
Ретрактор (для стабилизации печени и соединительных тканей)ЭскулапДля удаления поджелудочной железы и трансплантации клеток
Мемориальный институт Розуэлл Парк Медиум (RPMI w/L-Gln)КозерогRPMI-AДля выделения и культивирования поджелудочной железы
Стерил Хлопковый наконечникDynarexДля удаления поджелудочной железы и трансплантации клеток
Стерильный шприц (10 мл)Ayset32MM 22GДля реакции Collegenase
СекундомерKenkoKK613DДля IPGTT
Streptozotocin (STZ) Sigma18883-66-4Для диабетических крыс
Фильтрующий блок драйвера шприца (GP-0.22 &; m-3 мм)MillexSLGP033RSДля стерилизации клеточных культуральных сред
колба T25Thermo130189Для культуральных
реагентов TrypLE ExpressGibcoДля пропускания клеток
водяной баней Труд IldamALB128Для колледжной реакции
Ксилазин 2% в/в Раствор для инъекцийРомпунДля крыс анестезия
Для подготовки считывателя

Ссылки

  1. Nichols, G. A., Kimes, T. M., Harp, J. B., Kou, T. D., Brodovicz, K. G. Glycemic Response and Attainment of A1C Goals Following Newly Initiated Insulin Therapy for Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 35 (3), 495-497 (2012).
  2. Shapiro, A. M. J., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  3. Barton, F. B., et al. Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
  4. Jacobson, A., et al. Biomedical Risk Factors for Decreased Cognitive Functioning in Type 1 Diabetes: An 18-year Follow-Up of the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) Cohort. Diabetologia. 54 (2), 245-255 (2010).
  5. Rovner, A. J., et al. Development and Validation of the Type 1 Diabetes Nutrition Knowledge Survey. Diabetes Care. 35 (8), 1643-1647 (2012).
  6. Knopp, B., Perumareddi, P. An Atypical Presentation of Type 1 Diabetes. Arch Clin Cases. 8 (3), 46-49 (2021).
  7. Low, J. C., et al. Do Obese Children With Diabetic Ketoacidosis Have Type 1 or Type 2 Diabetes. Primary Care Diabetes. 6 (1), 61-65 (2012).
  8. Xu, X., et al. β cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132 (2), 197-207 (2008).
  9. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832(2011).
  10. Kim, B., et al. Differentiation of human labia minora dermis-derived fibroblasts into insulin-producing cells. Exp Mol Med. 44 (1), 26(2012).
  11. Campbell, S. C., et al. Selenium stimulates pancreatic beta-cell gene expression and enhances islet function. FEBS Lett. 582 (15), 2333-2337 (2008).
  12. Shaer, A., Azarpira, N., Vahdati, A., Karimi, M. H., Shariati, S. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Into Insulin-Producing Clusters. Exp Clin Transplantat. 13 (1), 68-75 (2015).
  13. Koh, S. H., et al. Differential Effects of Isoxazole-9 on Neural Stem/Progenitor Cells, Oligodendrocyte Precursor Cells, and Endothelial Progenitor Cells . PLoS One. 10 (9), e0138724(2015).
  14. Tsakmaki, A., Fonseca Pedro, P., Pavlidis, P., Hayee, B., Bewick, G. A. ISX-9 manipulates endocrine progenitor fate revealing conserved intestinal lineages in mouse and human organoids. Mol Metabol. 34, 157-173 (2020).
  15. Khan, S., Sur, S., Newcomb, C. J., Appelt, E. A., Stupp, S. I. Self-assembling glucagon-like peptide 1-mimetic peptide amphiphiles for enhanced activity and proliferation of insulin-secreting cells. Acta Biomaterialia. 8 (5), 1685-1692 (2012).
  16. White, A. M., et al. Engineering Strategies to Improve Islet Transplantation for Type 1 Diabetes Therapy. ACS Biomater Sci Eng. 6 (5), 2543-2562 (2020).
  17. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The Fate of Allogeneic Pancreatic Islets following Intraportal Transplantation: Challenges and Solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  18. Marín-Cañas, S., et al. Pancreatic ductal cells may have a negative effect on human islet transplantation. PLoS One. 14 (7), e0220064(2019).
  19. Webb, M. A., et al. The Impact of Potential Islet Precursor Cells on Islet Autotransplantation Outcomes. Cell Transplant. 22 (6), 1041-1051 (2013).
  20. Vendrame, F., et al. Recurrence of Type 1 Diabetes After Simultaneous Pancreas-Kidney Transplantation, Despite Immunosuppression, Is Associated With Autoantibodies and Pathogenic Autoreactive CD4 T-Cells. Diabetes. 59 (4), 947-957 (2010).
  21. Barron, E., et al. Associations of Type 1 and Type 2 Diabetes With COVID-19-related Mortality in England: A Whole-Population Study. Lancet Diabetes Endocrinol. 8 (10), 813-822 (2020).
  22. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  23. Blum, B., et al. Functional β-cells maturation is marked by an increase in the glucose threshold for insulin secretion and by expression of urocortin3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  24. Karimi, N., Ozcan, G. B. Rat Ductal Cell-Derived Differentiation into Islet-Like Cells. Methods Mol Biol. , 1-15 (2024).
  25. Dagli Gul, A. S., Fadillioglu, E., Karabulut, I., Yesilyurt, A., Delibasi, T. The effects of oral carvacrol treatment against H2O2-induced injury on isolated pancreas islet cells of rats. Islets. 5 (4), 149-155 (2013).
  26. Noguchi, H., et al. Evaluation of Osmolality of Density Gradient for Human Islet Purification. Cell Transplant. 21 (2-3), 493-500 (2012).
  27. Boyuk, G., Yigit, A. A., Aydogan, I. Co-culture of rat luteal cells with islet cells enhances islet viability and revascularization. In Vitro Cell Dev Biol Animal. 54, 640-647 (2018).
  28. Karimi, N., Boyuk Ozcan, G. Isolation Procedure for Rat Pancreatic Ductal Cells. Methods Mol Biol. , (2024).
  29. Karakose, M., et al. Comparison of the Ovary and Kidney as Sites for Islet Transplantation in Diabetic Rats. Transplant Proc. 48, 2216-2220 (2016).
  30. Gou, W., Cui, W., Cui, Y., Wang, H. Minimizing post-infusion portal vein bleeding during intrahepatic islet transplantation in mice. J Vis Exp. (171), e62530(2021).
  31. Geiger, M. C., et al. Evaluation of Metabolic Control Using a Continuous Subcutaneous Glucose Monitoring System in Patients with Type 1 Diabetes Mellitus who Achieved Insulin Independence after Islet Cell Transplantation. Cell Transplant. 14 (2-3), 77-84 (2005).
  32. Farina, M., et al. 3D Printed Vascularized Device for Subcutaneous Transplantation of Human Islets. Biotechnol J. 12 (9), 1700169(2017).
  33. Biancone, L., et al. Platelet-Activating Factor Synthesis and Response on Pancreatic Islet Endothelial Cells: Relevance for Islet Transplantation. Transplantation. 81 (4), 511-518 (2006).
  34. Lee, Y. S., Lee, C., Choung, J. S., Jung, H. S. Glucagon-Like Peptide 1 Increases Β-Cell Regeneration by Promoting Α- To Β-Cell Transdifferentiation. Diabetes. 67 (12), 2601-2614 (2018).
  35. Akinci, E., Banga, A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta (β) cell character using Pdx1, Ngn3 and MafA. Biochem J. 442 (3), 539-550 (2012).
  36. Kalwat, M. A., et al. Isoxazole Alters Metabolites and Gene Expression, Decreasing Proliferation and Promoting a Neuroendocrine Phenotype in Β-Cells. Acs Chem Biol. 11 (4), 1128-1136 (2016).
  37. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  38. García-Ocaña, A., et al. Transgenic Overexpression of Hepatocyte Growth Factor in the β-Cell Markedly Improves Islet Function and Islet Transplant Outcomes in Mice. Diabetes. 50 (12), 2752-2762 (2001).
  39. Vegas, A. J., et al. Long-term glycemic control using polymer-encapsulated human stem cell-derived beta cells in immune-competent mice. Nat Med. 22 (3), 306-311 (2016).
  40. Zhang, W. J., et al. Evaluation of islets derived from human fetal pancreatic progenitor cells in diabetes treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 141(2013).
  41. El-Kersh, A. O. F. O., El-Akabawy, G., Al-Serwi, R. H. Transplantation of human dental pulp stem cells in streptozotocin-induced diabetic rats. Anat Sci Int. 95 (4), 523-539 (2020).
  42. Lee, D. Y., Park, S. J., Nam, J. H., Byun, Y. Optimal aggregation of dissociated islet cells for functional islet-like cluster. J Biomater Sci Pol Ed. 19 (4), 441-452 (2008).
  43. Brissova, M., et al. Intraislet Endothelial Cells Contribute to Revascularization of Transplanted Pancreatic Islets. Diabetes. 53 (5), 1318-1325 (2004).
  44. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  45. Brissova, M., et al. Pancreatic Islet Production of Vascular Endothelial Growth Factor-A Is Essential for Islet Vascularization, Revascularization, and Function. Diabetes. 55 (11), 2974-2985 (2006).
  46. Chow, L. W., Wang, L., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Self-assembling Nanostructures to Deliver Angiogenic Factors to Pancreatic Islets. Biomaterials. 31 (24), 6154-6161 (2010).
  47. Assady, S., et al. Insulin Production by Human Embryonic Stem Cells. Diabetes. 50 (8), 1691-1697 (2001).
  48. Homma, J., Sekine, H., Shimizu, T. Tricultured Cell Sheets Develop into Functional Pancreatic Islet Tissue with a Vascular Network. Tissue Engineering Part A. 29 (7-8), 211-224 (2023).
  49. Loganathan, G., et al. Culture of Impure Human Islet Fractions in the Presence of Alpha-1 Antitrypsin Prevents Insulin Cleavage and Improves Islet Recovery. Transplaxt Proc. 42 (6), 2055-2057 (2010).
  50. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. J Cell Mol Med. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  51. Choi, H., Shinohara, M., Ibuki, M., Nishikawa, M., Sakai, Y. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endocrine Progenitors to Islet-like Cells Using a Dialysis Suspension Culture System. Cells. 10 (8), 2017(2021).
  52. Ding, Y., Xia, S., Zhang, H., Chen, Q., Niu, B. Loureirin B Activates GLP-1R and Promotes Insulin Secretion in Ins-1 Cells. J Cell Mol Med. 25 (2), 855-866 (2020).
  53. O'Mara, B. A., Liehuaa, L., Ahrén, B. Stromal Derived Factor 1 Alpha (SDF-1a) in a Dual Therapy With the DPP-4 Inhibitor 1 Vildagliptin Does Not Enhance Beta Cell Function but Improves Glucose Clearance After Oral Glucose in Streptozotocin Diabetic Mice. J Chem Biol Ther. 1, 110(2016).
  54. Caporarello, N., Parrino, C., Trischitta, V., Frittitta, L. Insulin Receptor Signaling and Glucagon-Like Peptide 1 Effects on Pancreatic Beta Cells. Plos One. 12 (8), e0181190(2017).
  55. Schwenk, R. W., et al. GLP-1-oestrogen Attenuates Hyperphagia and Protects From Beta Cell Failure in Diabetes-Prone New Zealand Obese (NZO) Mice. Diabetologia. 58 (3), 604-614 (2014).
  56. He, Y., et al. Reversal of Early Diabetic Nephropathy by Islet Transplantation under the Kidney Capsule in a Rat Model. J Diabetes Res. 2016, 1-12 (2016).
  57. Yun, F., Zhaorigen, B., Han, X., Li, X., Yun, S. Islet-Like Cells Induced from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells with Neonatal Bovine Pancreatic Mesenchymal Exosomes for Treatment of Diabetes Mellitus. Hormone Metabolic Res. 56 (06), 463-470 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сахарный диабет 1 типавыработка инсулинабета-клетки поджелудочной железытрансплантация островковых клетокснижение уровня глюкозы в кровивнутрибрюшинной тест на толерантность к глюкозекрысы с стрептозотоцин-индуцированным диабетомиммунная защита

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.