Методическая статья

Генерация и характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека астроцитов, лишенных хрупкого рибонуклеопротеина X-мессенджера

DOI:

10.3791/68081

⸱

6 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы описываем протокол, который способствует дифференцировке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в функциональные астроциты, специфичные для переднего мозга. Это позволяет проводить исследования роли глиальных клеток в патогенезе нарушений развития нервной системы, таких как синдром ломкой X-хромосомы, и моделировать другие заболевания головного мозга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синдром ломкой Х-хромосомы (FXS), ведущая наследственная причина расстройства аутистического спектра и умственной отсталости, был широко изучен с использованием моделей грызунов. В последнее время модельные системы, полученные из стволовых клеток человека, также используются для получения механистического представления о патофизиологии FXS. Тем не менее, эти исследования были сосредоточены почти исключительно на нейронах. Кроме того, несмотря на растущее количество доказательств ключевой роли глии в функционировании нейронов в здоровье и болезнях, мало что известно о том, как FXS влияет на человеческие астроциты.

Поэтому в этом исследовании мы успешно разработали протокол, который фиксирует ключевые пространственно-временные вехи развития мозга и согласуется с процессом глиогенеза. В совокупности это дает полезную основу для изучения нарушений развития нервной системы. Во-первых, мы смоделировали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека в нейроэктодермальную линию с двойным супрессором матерей против ингибирования декапентаплегии (SMAD) и малых молекул. Впоследствии мы использовали специфические факторы роста и цитокины для получения контрольных (CTRL) и полученных от пациента астроцитарных клеток-предшественников (APC) FXS. Лечение АПК цилиарным нейротрофическим фактором, дифференцирующим цитокином, регулировало и подталкивало клетки-предшественники к астроцитарному созреванию, в результате чего получались специфичные для переднего мозга глиальные фибриллярные кислые белки, экспрессирующие астроциты.

Мы обнаружили, что эти астроциты функциональны, о чем свидетельствует их кальциевая реакция на применение АТФ, и они демонстрируют нарушение гликолитического и митохондриального метаболизма при АТФ. Взятые вместе, эти результаты обеспечивают полезную экспериментальную платформу человеческого происхождения для исследования клеточно-автономных и неклеточных последствий изменений в функции астроцитов, вызванных нарушениями развития нервной системы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синдром ломкой Х-хромосомы (FXS), распространенная наследственная форма умственной отсталости и расстройства аутистического спектра (РАС), вызван недостатком хрупкого рибонуклеопротеина X-мессенджера (FMRP), продуцируемого геном хрупкого рибонуклеопротеина 1 (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP играет роль в регуляции трансляции мРНК, образовании и транспортировке гранул мРНК, а также в микроРНК-опосредованной регуляции экспрессии генов1. Таким образом, потеря FMRP влияет не только на развитие мозга, но и на работу мозга взрослого человека. Как уровни транскриптов мРНК FMR1, так и иммуноокрашивание для FMRP в головном мозге показали высокую экспрессию нейронов, наряду со значительной экспрессией в глиальных клетках2. Тем не менее, подавляющее большинство более ранних исследований на животных моделях FXS было сосредоточено в первую очередь на нейронах и аберрациях в их функции. Следовательно, мало что известно о роли глии в FXS3. Традиционно считающиеся клетками «пассивной поддержки»4, накапливаются доказательства того, что астроциты играют решающую роль в опосредовании широкого спектра нейронных функций 5,6, включая содействие синаптогенезу7, совершенствование развивающихсянейронных цепей 8 и рециркуляцию нейротрансмиттеров9. Параллельно с этим появляется все больше доказательств роли астроцитов в патогенезе заболевания, и многие неврологические состояния связаны с астроцитарной дисфункцией.

В то время как большая часть более ранних работ с использованием животных моделей FXS была сосредоточена на идентификации и валидации различных молекулярных мишеней в нейронах для лечения FXS, эти доклинические результаты не всегда приводили к успешным клиническим результатам. Кроме того, неудачи в недавних клинических испытаниях также подчеркивают потребность в модельных системах, основанных на человеке. Модели неврологических расстройств, основанные на клетках мозга, полученных из стволовых клеток человека, предлагают мощную стратегию для преодоления разрыва между механистическими знаниями исследований на животных и ограниченным успехом клинических результатов для пациентов. Тем не менее, лишь немногие из этих исследований были сосредоточены на астроцитах, и то в основном на астроцитах, которые были спинальными по происхождению. Это, в свою очередь, актуально в свете исследований, показывающих, что структура и функции астроцитов различаются между областями мозга11,12. Таким образом, для лучшего понимания вызванных заболеванием изменений в астроцитах человека также необходимо учитывать эти различия, специфичные для областей мозга в астроцитах. Тем не менее, модели нарушений развития нервной системы с использованием астроцитов, полученных из стволовых клеток человека, специфичных для переднего мозга, остаются сравнительномалоизученными. Таким образом, чтобы начать восполнять эти пробелы, мы описываем протоколы генерации специфичных для переднего мозга астроцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), полученных от пациентов), несущих мутации FXS; Кроме того, мы показываем, что астроциты функциональны и демонстрируют измененный метаболизм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) (Таблица 1) были проведены после получения соответствующих разрешений регулирующих органов. На рисунке 1А представлен полный протокол дифференцировки ИПСК к зрелым астроцитам, специфичным для переднего мозга.

1. Поддержание и расширение ИПСК

  1. За день до нанесения иПСК покройте 6-луночную чашку разбавленным в соотношении 1:60 Матригелем (внеклеточный матрикс [ECM]) в Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) и храните при температуре 2-8 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте хранения посуды с покрытием Matrigel в течение >5 дней при температуре 2-8 °C, так как это может привести к деградации белка в ECM с течением времени. Чтобы избежать высыхания формы, нанесите не менее 1 мл разбавленного Матригеля в соотношении 1:60 на одну лунку 6-луночной чашки и равномерно распределите по чашке. При использовании в тот же день держите планшет в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 1 часа.
  2. В день культивирования ИПСК удалите материал покрытия и добавьте 1 мл полной среды Essential 8 (базальная среда E8 с добавкой Essential 8) вместе с ингибитором ROCK 1x конечной концентрации и выдержите чашку в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 перед добавлением ИПСК при температуре 37 °C и 5% CO2.
  3. Ресуспендируйте ИПСК в полной среде Е8 вместе с ингибитором ROCK в 1-кратной конечной концентрации для лучшей адгезии колоний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не готовьте большое количество питательной среды. Готовьте не более 3-4 дней и храните при температуре 2-8 °C.
  4. На следующий день восполните полную концентрацию среды E8 без ингибитора ROCK до тех пор, пока клетки не станут слившимися на 80% (примерно 4-5 дней).
  5. Когда они достигнут 80% слияния, отделите колонии ферментативным путем.
    1. Чтобы пропустить иПСК, удалите отработанную среду из чашки и добавьте 1 мл на лунку предварительно подогретой (37 °C) смеси коллагеназы (2 мг/мл) и диспаза (1 мг/мл) в соотношении 1:1 и инкубируйте при 37 °C в течение более 20-30 минут, чтобы дать возможность колониям iPSC подняться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте посуду при температуре 37 °C более чем на 20-30 минут; По истечении этого периода колонии будут распадаться, а клетки будут умирать.
  6. Когда колонии начнут подниматься, выньте чашки из инкубатора и нейтрализуйте активность фермента, добавив 2 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
  7. Соскребите колонии с помощью DPBS и соберите суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью широкой серологической пипетки объемом 10 мл.
  8. Осторожно разотрите суспензию 2-3 раза, чтобы разбить колонии с помощью серологической пипетки объемом 10 мл, и дайте колониям успокоиться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превращайте колонии в одиночные клетки; Это может привести к тому, что клетки не прилипнут к чашке и вызвать дальнейшую гибель клеток. Кроме того, не оставляйте их большими колониями; В дальнейшем это приведет к более дифференцированным колониям.
  9. Как только колонии успокоятся (примерно через 2 минуты), аспирируйте смесь ферментов DPBS, оставив в пробирке примерно 1 мл.
  10. Добавьте в пробирку 2 мл DPBS, перемешайте колонии постукиванием и дайте им отстояться. Повторите это 2 раза, чтобы удалить весь остаточный фермент из колоний. Удалите как можно больше надосадочной жидкости после2-й стирки, восстановите колонии в 1 мл полной среды E8 и положите в свежеприготовленную посуду, как указано в шагах 1.2-1.3.
  11. В качестве альтернативы можно криоконсервировать часть колоний, используя 10% диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве криопротекторного раствора для будущего расширения и использования.
    1. Приготовьте свежую криоконсервирующую среду, смешав 90% готовой среды E8 и 10% ДМСО в качестве криопротекторного раствора, и поместите его при температуре 2-8 °C до использования.
  12. Для криоконсервации необходимо выполнить шаги 1.5-1.10.
  13. Во время шага 1.10, после2-го промывки, дайте колониям осесть и удалите надосадочную жидкость. В колонии добавьте 1 мл свежеприготовленной холодной криоконсервационной среды и переложите в криоприемники.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления среды для криоконсервации в колонии быстро перенесите содержимое в криовиалы. Задержка может привести к снижению скорости оживления, поскольку ДМСО является криопротектором, который может повреждать клетки.
  14. Немедленно переместите криовиалы в криобокс и храните в морозильной камере при температуре -80 °C в течение ночи.
  15. На следующий день переместите все криовиалы в резервуар с жидким азотом (резервуар LN2 ) для дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК следует регулярно кариотипировать с использованием G-полосы (дополнительный рисунок S1) для любых аномалий, характеризовать с помощью иммуноцитохимии для плюрипотентности (рисунок 1B) и проверять на микоплазму.
    1. Чтобы охарактеризовать ИПСК с помощью иммуноцитохимии, нанесите на колонии 13 мм стеклянные покровные стекла толщиной 13 мм, покрытые Матригелем, в соотношении 1:60. Как только они слится на 40%, промойте клетки PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), зафиксируйте 4% параформальдегидом в течение 10 минут, пеабилизируйте 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут и заблокируйте 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS на 1 ч, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
    2. После блокирования культуры с первичными антителами инкубируют в течение 1 ч, а затем 3 раза промывают PBS-T в течение 5 мин каждая, а затем соответствующие вторичные антитела (Таблица материалов) в темноте в течение 1 ч.
    3. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах с монтажным носителем и получайте изображения с помощью конфокального лазерного сканирования с длиной волны 405 нм, 488 нм, 561 нм и 633 нм. Захватывайте изображения с разрешением 512 x 512 пикселей; установите размер шага Z на 0,5 μм с 1 воздушной единицей диаметра точечного отверстия.

2. Генерация и характеристика астроцитарных клеток-предшественников (АПК)

  1. Ферментативно поднимают иПСК, как указано в шагах 1.5-1.10, и помещают их на неадгезивную чашку для культуры суспензии (100 мм) с химически определенной средой14, содержащей 50% модифицированной среды Дульбекко от Iscove (IMDM), 50% смеси питательных веществ F-12 от Ham's (F12), 5 мг/мл BSA, 1% химически определенного липидного концентрата (CD-липид), 450 μM монотиоглицерина, 7 μг/мл инсулина, 15 μг/мл трансферрина, 1% пенициллин-стрептомицин с добавлением митогенов N-ацетилцистеина (1 мМ), LDN 193189 (0,1 мкМ) и SB431542 (10 мкМ) в течение 7 дней.
    Примечание: Низкомолекулярные ингибиторы SB431542 и LDN-193189 (LDN) являются ингибиторами костного морфогенетического белка и трансформирующих сигнальных путей фактора роста-бета.
    С этого момента носитель пополнялся один раз в 2 дня или по протоколу понедельник/среда/пятница.
  2. Поместите клеточную суспензию на орбитальный шейкер при 40 оборотах в минуту на 7 дней в нормоксических условиях, чтобы способствовать развитию кортикосфер (рис. 1A).
  3. На 8-й день перенесите кортикосферы в среду для пролиферации клеток, содержащую усовершенствованный DMEM/F12 с 1% антибиотиком-антимикотиком, 1% добавкой N2, 1% заменителем глютамина, 0,1% добавкой B27 и 2,5 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) в течение 7 дней.
  4. Индуцируйте сферы для глиальной специфичности, подвергая их воздействию глиальной обогащающей среды, содержащей Advanced DMEM/F12 с 1% антибиотиком-антимикотиком, 1% N2, 1% заменителем глютамина, 0,1% добавкой B27, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), bFGF-H (20 нг/мл bFGF-5 мг/мл гепарина) в течение 2 недель для получения ранних глиосфер (рис. 1A).
  5. Для созревания ранних глиосфер замените bFGF-H на 20 нг/мл фактора ингибирования лейкемии (LIF) и поддерживайте сферы в течение 4 недель.
  6. После 4 недель в среде созревания сохраняйте сферы в среде для глиального обогащения в течение длительного времени. Чтобы предотвратить агрегацию и потерю жизнеспособности, каждые 2 недели механически измельчайте глиосферы с помощью стерильного промышленного лезвия и заменяйте всю среду ДНКазой I, чтобы удалить фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате измельчения.
  7. Диссоциируйте глиосферы на монослои АПК с помощью набора для диссоциации папаина и положите на обработанную клеточной культурой адгезивную чашку с разбавлением покрытия Матригель в соотношении 1:80.
  8. Размножайте АПК в глиальной обогащающей среде до 80% конфлюентности и ферментативно пропускайте их с помощью среды для отслоения ферментных клеток (см. Таблицу материалов).
  9. К прохождению:
    1. Извлеките отработанные среды и соберите в коническую трубку. К клеткам добавьте фермент среды для отслоения клеток и подождите 1-2 мин. Как только клетки начнут отделяться, добавьте отработанную среду, чтобы нейтрализовать активность фермента.
    2. Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте при 800 x ɡ в течение 2 мин.
    3. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в глиальную обогащающую среду и нанесите примерно 1 x 106 клеток/лунку на 6-луночную чашку с покрытием Matrigel в масштабе 1:80.
  10. Для криоконсервации:
    1. Ресуспендируйте клетки в холодной смеси, состоящей из 90% пролиферационной среды кортикосферы (без bFGF) и 10% криопротектора. Переведите ресуспензированные клетки в криовиальные.
    2. Немедленно переместите криоциалы в криобокс и держите в морозильной камере при температуре -80 °C в течение ночи.
    3. На следующий день переместите все криовиалы в резервуар с жидким азотом (резервуар LN2 ) для дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: БТР крионировали с использованием 10% ДМСО до прохода No 6.
  11. Охарактеризовать диссоциированные АПК путем иммуноокрашивания (как указано в шагах 1.15.1-1.15.3) с помощью виментина и маркеров ядерного фактора IA (NFIA) (рис. 1C, D) (см. таблицу материалов для разведений).
  12. Чтобы подтвердить региональную специфичность переднего мозга АПК, полученных из hiPSC, проверьте клетки на маркер переднего мозга, такой как человеческий вилочный ящик G1 (hFOXG1) (положительный) и маркер заднего мозга, такой как человеческий гомеобокс B4 (hHOXB4) (отрицательный) с помощью количественной ПЦР в реальном времени (рис. 1E, F).
    Примечание: Последовательности праймеров, использованные для этих экспериментов, перечислены в Дополнительной таблице S1.

3. Генерация и характеристика однородной популяции специфичных для переднего мозга астроцитов

  1. Дифференцировка астроцитов от АПК
    1. Используйте среду для дифференцировки астроцитов (ADM) в течение 14 дней для дифференцировки APC в астроциты. Среда для дифференцировки астроцитов содержит нейробазал, 1% антибиотик-антимикотический, 1% заменитель глютамина, 1% добавку N2, 0,2% добавку B27, 1% заменимую аминокислотную среду (NEAA) и 10 нг/мл цилиарного нейротрофического фактора (CNTF).
    2. Подтвердите астроцитарную идентичность с помощью иммуноокрашивания (как указано в шагах 1.15.1-1.15.3.) с глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и маркерами экспрессии S100β (рис. 2A, B).
  2. Синтез белка de novo в АПК и астроцитах
    1. Поддерживайте полученные из hiPSC APC и астроциты переднего мозга на стерильных автоклавных стеклянных покровных стеклах толщиной 13 мм и окрашивайте их иммуно, как указано в шагах 1.15.1-1.15.3.
    2. Для синтеза белка de novo используйте метод флуоресцентного неканонического мечения аминокислот (FUNCAT), кратко описанный в шагах 3.2.3-3.2.6 (рис. 3A).
    3. Для устранения дефицита метионина питательную среду из культур удаляют питательную среду и заменяют ее средой, не содержащей метионина и цистеина, смешанной с 1 мМ L-азидогомоаланином (AHA) в течение 30 мин при 37 °C и 5%CO2.
    4. Промойте культуры PBS-T, зафиксируйте 4% параформальдегидом в течение 10 минут, пропитайте 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут и заблокируйте 3% BSA в PBS в течение 1 часа для предотвращения неспецифического связывания.
    5. Инкубируют культуры в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью химической реакционной смеси Click cell и алкина Alexa Fluor 647, а затем первичных антител в течение 1 ч и соответствующих вторичных антител (Таблица материалов) в течение 1 ч (Рисунок 3B).
    6. Закрепите покровные стекла на стеклянных предметных стеклах с монтажным носителем и используйте их для дальнейшего анализа изображений.
      1. Получение изображений с помощью конфокального лазерного сканирования с длиной волны 405 нм, 488 нм, 561 нм и 633 нм.
      2. Захватывайте изображения с разрешением 512 x 512 пикселей; установите размер шага Z на 0,5 μм с 1 воздушной единицей диаметра точечного отверстия.
      3. Поддерживайте постоянные параметры микроскопии и визуализации для всех типов клеток. Делайте снимки для каждой биологической реплики в одном сеансе.
      4. Выполняйте измерения интенсивности с помощью любого стандартного программного обеспечения для анализа изображений (например, на Фиджи или в Имарисе). В Imaris используйте модуль SURFACES для получения объемных измерений тел клеток, положительных на сигнал флуоресцентного неканонического мечения аминокислот (FUNCAT) с помощью Vimentin (APCs) и GFAP (астроциты), ограничивающих диапазон вокселей (250-350) для удаления мусора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте параметры для всех биологических репликат для обоих типов клеток.
  3. Аденозин-5'-трифосфат (АТФ)-индуцированные колебательные кальциевые волны
    1. Наведите астроциты на стеклянную чашку с дном (35 мм) в соотношении 5 × 10 до3 клеток/чашку для измерения клеточного ответа на АТФ.
    2. Дайте клеткам прилипнуть к стеклянному дну в течение 24 ч, промойте их 3 раза HBSS (20 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ Глюкоза, 1 мМ MgCl2, рН = 7,3) без кальция и инкубируйте в культуральной среде с соотношением 5 мкМ метрического красителя Фура-2АМ и 0,02% плюроника F127 в течение 1 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фура-2АМ является светочувствительным химическим веществом; хранить при температуре -20 °C.
    3. После инкубации промойте 2 раза питательной средой и замените 2 мМ Ca2+ , содержащим HBSS, и визуализируйте клетки со скоростью 2 кадра в секунду с помощью 60-кратного масляного объектива (1,35 NA) в инвертированном микроскопе с компенсацией дрейфа фокуса.
    4. Запишите АТФ-индуцированные реакции кальция при применении АТФ в ванне в конечной концентрации 5 мМ через 25с (рис. 4A).
    5. Нарисуйте области интереса вокруг каждой ячейки с помощью Fiji/ImageJ и рассчитайте соотношение F340/F380 во всех временных точках (рис. 4B).
  4. Анализы клеточного метаболизма
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR) живых клеток измеряли в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
    1. За сутки до проведения анализа дайте астроцитам прилипнуть к микропланшету (1,5 × 104 плотности посева) в среде CNTF и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2.
    2. Для анализа напряжения гликолиза:
      1. Замените среду для культивирования клеток базовой средой с добавлением 2 мМ глутамина (pH отрегулирован до 7,4) и инкубируйте в камере безCO2 при 37 °C в течение 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: pH необходимо регулировать на водяной бане при температуре 37 °C.
      2. Вставьте пластину картриджа в прибор для калибровки датчика. После калибровки замените картриджную пластину на пластину для культивирования клеток в конечной концентрации следующих компонентов набора: 10 мМ глюкозы, 1 мкМ олигомицина и 50 мМ 2-дезоксиглюкозы (2-DG) (рис. 5A).
      3. В конце теста лизируют клетки и оценивают общее содержание белка.
    3. Для анализа митохондриального стресса:
      1. Замените среду CNTF базовой средой с добавлением 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата, 10 мМ глюкозы (pH скорректирован до 7,4) на водяной бане при 37 °C.
      2. Инкубируйте планшет в камере безCO2 при температуре 37 °C в течение 1 ч. Тем временем вставьте пластину картриджа в прибор для калибровки датчика.
      3. После калибровки замените картриджную пластину на планшет для клеточной культуры с конечной концентрацией следующих компонентов набора: 1,5 мкМ олигомицина, 1 мкМ карбонилцианида-4 (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP) и 0,5 мкМ ротенона/антимицина А (рис. 5C).
      4. В конце теста лизируют клетки и оценивают общее содержание белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие индуцированные колонии плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) поддерживали с использованием коммерчески доступной определенной среды и иммуноокрашивали на маркеры плюрипотентности, Oct4 и Nanog (рис. 1B). FXS и CTRL APC показали сопоставимые высокообогащенные доли клеток, иммуноположительных на виментин и NFIA (рис. 1C, D). Мы обнаружили, что APC, полученные из здоровых и FXS hiPSCs, показали значит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы описываем метод получения астроцитов, полученных из iPSC человека, которые служат платформой для анализа характеристик функциональных изменений, вызванных FXS. Эти астроциты функционально жизнеспособны в культуре и проявляют различные свойства, о чем свидетельствует ряд измерений, проведенных в настоящем исследовании. Важнейшим этапом в этом протоколе является первоначальная конверсия иПСК в кортикосферы с использованием метода ферментативного лифтинга. На этом этапе р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим профессора Сумантру Чаттарджи за внутренние фонды. Мы благодарим профессора Гайти Хасана за доступ к установке для визуализации кальция, Центральную установку визуализации и потока Национального центра биологических наук, Падманабха Сингха и Прангья Хоту за корректуру и предложения, а также команду Labmate Asia за их помощь в проведении анализов XF Seahorse.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-тиоглицеринсигма-олдричM6145
аккутаза  растворSigma-AldrichA6964Среда для отслоения ферментных клеток 
Аденозин 5′-трифосфатно-магниевая сольSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
антибиотик-антимикотик (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Supplement (50x), бессывороточный альбумин
бычьей сывороткиSigma-AldrichA9418
Химически определенный липидный концентратThermoFisher Scientific11905031
коллагеназа, тип IV, порошокThermoFisher Scientific17104019
дезоксирибонуклеаза IWorthington Biochemical CorporationLK003170
диметилсульфоксидомSigma-AldrichD2650
Dispase II, порошокThermoFisher Scientific17105041
DPBS, без кальция, без магнияThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Институт медицинских исследований Кориелла GM07072, GM05848FXS клетки пациента
Добавка GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061заменитель глютамина
Ham's F-12 Питательная смесьThermoFisher Scientific11765054
здоровые контрольные клетки Медицинский центр Седарс-Синай ND30625здоровые контрольные клетки 
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньиSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Инсулин, человеческийRoche11376497001
LDN 193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Ингибиторный фактор лейкемии человекаSigma-AldrichL5283
Matrigel  Матрица базальной мембраны с пониженным фактором роста (GFR)Corning354230
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Mouse FGF-basic (FGF-2/bFGF) Рекомбинантный белокPeprotech450-33
Mr. Frosty морозильный контейнерThermoFisher Scientific5100-0001криобокс
N-2 Добавка (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-ацетил-L-цистеинSigma-AldrichA9165
Нейробазальная средаThermoFisher Scientific21103049
Nunc биобанкинг и криогенные пробирки для клеточных культурThermoFisher Scientific377267
Nunc Cell-Culture Processed 6 лунокThermoFisher Scientific140675
Система диссоциации папаинаWorthington Biochemical CorporationLK003150
пенициллин-стрептомицинThermoFisher Scientific15140122
рекомбинантный человеческий белок CNTF, CF НИР D Systems257-NT-010
Рекомбинантный человеческий белок EGF, CFR& D Systems236-EG-01M
Добавка RevitaCell (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Agilent Technologies
Набор для стресс-тестов Seahorse XF Cell MitoAgilent Technologies103015-100
Seahorse XF Набор для стресс-тестов на гликолизAgilent Technologies103020-100
Тарелки для культуры тканей-100 смBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
VWR Razor ЛезвияVWR International55411-050
антитела 
Первичное антителоCompanyКаталожный номер>Dilution
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Разведение: 1:250
Вторичное антитело: козье антимышиное IgG, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Разведение: 1:100
Вторичное антитело: Donkey anti-Goat IgG, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733Разведение: 1:500
Вторичное антитело: Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Разведение: 1:500
Вторичное антитело: Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Разведение: 1:500
Вторичное антитело: NA
GFAPDAKOZ0334Разведение: 1:500
Вторичное антитело: козье анти-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568
S100βDAKOIR504Разведение: 1:500
Вторичное антитело: козье анти-Rabbit IgG, антитело Alexa Fluor 488
Anti-Nuclei, клон 235-1Merck MilliporeMAB1281Разведение: 1:1000
Вторичное антитело: козье анти-мышиное IgG1, Alexa Fluor 555
Вторичные антитела  Dilution
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
Ослик против коз IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
Козий антикуриный IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
Козий антикролик IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
Козий антикролик IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
Козий анти-мышь IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific А211271:1000
ThermoFisher Scientific 17504044

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fragile X SyndromeInduced Pluripotent Stem CellsAstrocyte Progenitor CellsAstrocyte DifferentiationGlial Enrichment MediumCalcium ImagingGlycolytic MetabolismMitochondrial RespirationImmunostaining MarkersNeurodevelopmental Disorders

Похожие статьи