Влияние шиконина на сигнальный путь HIF-1α/VEGF у мышей с острым повреждением легких, вызванным сепсисом

Краткое содержание

Протокол направлен на оценку эффективности шиконина в облегчении острого повреждения легких, вызванного сепсисом у мышей. Нацеливаясь на путь HIF-1α/VEGF, исследование изучает, как различные дозы шиконина влияют на показатели выживаемости, патологию легких и экспрессию маркеров воспаления, подчеркивая его потенциальные терапевтические преимущества.

Аннотация

Сепсис часто вызывает острое повреждение легких (ОПЛ), осложнение с высокой смертностью. Путь HIF-1α/VEGF играет ключевую роль в развитии сепсиса, а шиконин, природное соединение с противовоспалительными свойствами, может облегчить повреждение легких, воздействуя на этот путь. Мыши Balb/c были случайным образом разделены на четыре группы: фиктивная группа, модельная группа, группа лечения низкими дозами и группа лечения высокими дозами. В симуляционной группе была выполнена лапаротомия без лигирования слепой кишки и пункции (CLP), в то время как модельной группе была выполнена операция CLP для индуцирования острого повреждения легких, связанного с сепсисом. После моделирования группы лечения с низкими и высокими дозами получали шиконин через зонд в дозах 12,5 мг/кг и 50 мг/кг соответственно один раз в сутки в течение 14 дней. Проводился мониторинг 7-дневной выживаемости мышей. Для оценки патологии легочной ткани использовали окрашивание гематоксилином и эозином (HE), измеряли массовое соотношение легких: влажное/сухое (W/D), а также проводили вестерн-блоттинг для выявления экспрессии HIF-1α, VEGF, TNF-α и IL-6 в легочной ткани. Шиконин значительно улучшил выживаемость септических мышей, при этом наибольший эффект наблюдался в группе с высокими дозами (p < 0,05). По сравнению с модельной группой, соотношение W/D в легких и повреждение тканей в группах, получавших шиконин, были значительно снижены дозозависимым образом. Кроме того, шиконин значительно снижал экспрессию HIF-1α, VEGF, TNF-α и IL-6, причем в группе высоких доз наблюдалось наиболее выраженное снижение (p < 0,05). Шиконин облегчает острое повреждение легких у мышей-септиков, потенциально подавляя экспрессию HIF-1α и снижая выработку связанных с ним воспалительных факторов.

Введение

Сепсис — это тяжелая системная воспалительная реакция, вызванная инфекцией. ¹ Это часто приводит к полиорганной дисфункции и может стать опасным для жизни по мере прогрессирования заболевания. ² Несмотря на использование таких методов лечения, как искусственная вентиляция легких и поддерживающая терапия, показатели смертности от сепсис-ассоциированного ОПЛ остаются высокими, достигая 30-40%³. Эти методы лечения в основном направлены на устранение симптомов, а не на основные причины, что ограничивает их общую эффективность. Таким образом, выявление новых терапевтических подходов, направленных на устранение причин повреждения легких, может значительно улучшить результаты лечения сепсиса у пациентов.

Недавние исследования определили индуцируемый гипоксией фактор-1α (HIF-1α) в качестве важнейшего регулятора в прогрессировании сепсис-индуцированного ALI ^4,5. HIF-1α накапливается в легочной ткани во время сепсиса, стимулируя экспрессию нижестоящих генов, которые усугубляют воспаление и повреждение тканей⁶. Этот процесс значительно способствует усугублению поражения легких. Таким образом, нацеливание на сигнальный путь HIF-1α предлагает многообещающий подход к смягчению воспалительных и гипоксических реакций, наблюдаемых при сепсис-индуцированном ОПЛ.

В поисках более эффективных методов лечения традиционная китайская медицина (ТКМ) предоставила ценные знания ^7,8. Шиконин — соединение антрахинона, извлеченное из Lithospermum erythrorhizon⁷. Он обладает выраженным^{противовоспалительным} 9, антибактериальным¹⁰ и противоопухолевым эффектами¹¹. Шиконин может облегчить повреждение легких, вызванное липополисахаридом (ЛПС), что указывает на его потенциальную терапевтическую роль при заболеваниях легких¹². В то же время некоторые исследования также показали, что шиконин может облегчить окислительное повреждение, вызванное сепсисом, регулируя мононуклеарную макрофагальную систему, уравновешивая провоспалительные и противовоспалительные реакции. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе защитных эффектов шиконина при ОПЛ, вызванном сепсисом, до конца не изучены. Это представляет собой критический пробел в современных исследованиях.

В этом исследовании мы стремимся изучить защитные эффекты шиконина в мышиной модели сепсис-индуцированного ОПЛ с использованием лигирования и пункции слепой кишки (CLP). Технология CLP играет важную роль в исследованиях сепсиса, поскольку она может моделировать сложные системные воспалительные реакции и полиорганную дисфункцию, что делает ее подходящей для оценки эффективности новых стратегий лечения. Технология CLP относительно более клинически актуальна по сравнению с традиционными методами введения ЛПС: она моделирует системную воспалительную реакцию, вызванную транслокацией микробиоты кишечника, которая ближе к патологическому процессу клинического сепсиса. Его можно градуировать и контролировать: регулируя длину лигирования и размер перфорации, можно контролировать тяжесть заболевания, и он подходит для всего исследования сепсиса. Кроме того, он может моделировать аналогичные динамические изменения в полиорганной дисфункции и цитокиновом ответе. Исследуя роль шиконина в модуляции сигнального пути HIF-1α/VEGF, мы надеемся получить представление о новых терапевтических стратегиях, которые воздействуют на основные механизмы повреждения легких, связанного с сепсисом, потенциально улучшая клинические исходы.

Протокол

Протокол получил одобрение Центра экспериментальных животных Медицинского университета Вэньчжоу. В данном исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6 (в возрасте 5–6 месяцев; 20–25 г). Подробная информация об основных реагентах и используемом оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка мышиной модели для лечения сепсиса

1. Домашние мыши при постоянной температуре 25 °C, влажности 50% и 12-часовом цикле свет/темнота.
2. После 7-дневного периода акклиматизации случайным образом разделите мышей на четыре группы: группа Шама, модельная группа, группа с низкой дозой лечения и группа с высокой дозой лечения, по 20 мышей в каждой группе.
3. Основываясь на ссылках из предыдущего исследования¹³, лечите группу с низкими дозами с концентрацией пурпурина 12,5 мг/кг в течение 14 дней, а группу с высокими дозами с концентрацией 50 мг/кг в течение 14 дней. В группе фиктивной хирургии выполните лапаротомию, вытяжение слепой кишки, уменьшение и закрытие без лигирования или пункции, а также лечение той же дозой физиологического раствора в течение 14 дней. Экспериментальные этапы для группы сепсиса следующие.
4. После ночного голодания (вода была разрешена) обезболивайте мышей пентобарбиталом натрия (40-80 мг/кг) в стерильных условиях на протяжении всего процесса. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
5. Проверьте правильность обезболивания как замедление частоты дыхания, снижение мышечного напряжения и отсутствие явной реакции на стресс при легком зажиме нижних конечностей кровоостанавливающими щипцами.
6. Провести дезинфекцию 75% этанолом, 3х. Сделайте продольный разрез около 1 см в среднем-левом положении брюшка мыши и разрежьте кожу, фасцию и мышцы слоями, чтобы обнажить брюшную полость.
7. С помощью офтальмологических щипцов с тупым концом в обеих руках аккуратно исследуйте брюшную полость, найдите и освободите слепую кишку мыши, а также перевязайте ее на расстоянии около 1 см от конца слепой кишки.
8. С помощью иглы 21G проколите и перевязайте конец слепой кишки, осторожно выдавите небольшое количество содержимого кишечника из места прокола с помощью офтальмологических щипцов с тупым наконечником, а затем извлеките его в слепую кишку.
9. Проводят подкожную инфузионную терапию 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Отметим, что животное, перенесшее операцию, не возвращается в компанию других животных до полного выздоровления.
10. После 7 дней моделирования CLP введите чрезмерную анестезию для эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с возможным раздражающим действием пурпурина на кожу, дыхательные пути и пищеварительный тракт, а также его высокой токсичностью для водных организмов, загрязнением окружающей среды, используйте средства индивидуальной защиты во время эксперимента.

2. Оценка животных моделей

1. Наблюдение за выживанием мышей
   1. Выполняйте работу с животными так, как описано выше. Запишите уровень смертности в течение 1 недели после моделирования для статистического анализа. Некоторые мыши умирают без сепсиса до эвтаназии, в то время как мыши модели CLP имеют определенный уровень смертности (табл. 1).
   2. Измерение соотношения влажного и сухого веса легких
      1. Через 24 ч моделирования снова обезболите мышей в соответствии с шагами 1.4-1.5.
      2. Сделайте продольный разрез примерно на 1 см с левой стороны средней линии ключицы мыши и удалите кожу, фасцию и мышечные слои, чтобы обнажить грудную полость с помощью хирургических ножниц и щипцов.
      3. Удалите левое легкое и слейте поверхностную жидкость. Измерьте влажный вес, а затем высушите его в духовке при температуре 80 °C в течение 72 ч до постоянного веса, чтобы получить сухой вес.
      4. Рассчитайте содержание воды в легких следующим образом:
         Содержание воды в легких = (Сырой вес - Сухой вес) / Сырой вес x 100%.
   3. Гистопатологическое сравнение тканей легких
      1. В указанные моменты времени соберите левое легкое, как описано выше в шаге 2.2. Зафиксируйте легкое в 10% нейтральном формальдегиде, погрузите его в парафин и разрежьте на толщину 5 мкм.
      2. Депарафинизируйте легкое в ксилоле, 2 раза, в течение 5-10 минут каждый раз. Выполняйте последовательную регидратацию этанола со значениями 100%, 95%, 85% и 75% в течение 3 минут на каждый градиент. Замочить в дистиллированной воде на 2 минуты.
      3. Окрашивайте примерно 100 мл раствора гематоксилина в течение 10 минут, затем смойте дистиллированной водой, чтобы удалить плавающий цвет.
      4. Добавьте около 70 мл раствора для дифференцировки и замочите на 30 секунд. Затем замочите в водопроводной воде 2 раза, каждый раз на 3-5 минут.
      5. Добавьте примерно 100 мл раствора красителя эозина по каплям в течение 2 минут. Вылейте излишки раствора красителя и быстро обезвоживайтесь, как описано ниже.
      6. Выполните обезвоживание, прозрачность и герметизацию, как описано ниже.
         1. Замочите образцы в градиентном этаноле: 75%, 85%, 95% и 100% этаноле (I) на 2-3 с каждый. Замочите в 100% этаноле (II) на 1 минуту и замочите в ксилоле 2 раза на 1 минуту каждый раз. С помощью соломинки или пипетки капните нейтральную камедь на поверхность срезов ткани и распределите ее максимально равномерно, чтобы избежать образования пузырьков. Запечатайте и наблюдайте под микроскопом при 400-кратном увеличении.
      7. Выберите 10 случайных полей для каждого участка легкого. Попросите патологоанатома оценить патологические изменения, такие как альвеолярный отек, кровоизлияние и инфильтрация нейтрофилов, от 0 (норма) до 4 (серьезное повреждение). Используйте общий балл для оценки.
   4. Вестерн-блоттинг
      1. Извлеките ядерные белки из легочной ткани в соответствии с инструкциями набора для экстракции ядерных белков и измерьте концентрацию белка методом BCA в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Подготовьте образцы с загрузкой белка 50 мкг белка на образец. Приготовьте SDS-PAGE разделительный гель (10%) и укладывающий гель (3%). Проведите электрофорез при напряжении 80 В в течение 45 минут, затем перенесите белок на мембрану PVDF при напряжении 110 В в течение 60 минут после того, как образцы попадут в разделительный гель.
      3. Перенесите белки на мембрану и заблокируйте на 60 минут. Инкубируют с первичными антителами (см. Таблицу материалов, 1:1000) в течение ночи при 4 °C, а затем инкубируют вторичными антителами (см. Таблицу материалов, 1:1000) при 37 °C в течение 2 ч.
      4. Промойте мембрану TBST и используйте ECL для визуализации. В темном помещении добавьте подготовленные реагенты на мембрану из ПВДФ и проведите встряхивание и флуоресцентную визуализацию. Реагенты ECL взаимодействуют с биомолекулами на мембране, вызывая сильные хемилюминесцентные реакции, которые регистрируются приборами флуоресцентной визуализации.
      5. Проанализируйте значение оттенков серого для белковых полос с помощью системы анализа изображений Метод количественной оценки полос (подробную информацию о системе, используемой для анализа денситометрии полос, см. в разделе Изображение NIH).
   5. Статистический анализ
      1. Используйте SPSS 26.0 для статистического анализа. Используйте однофакторный ANOVA для сравнения средних значений нескольких групп и тесты LSD-t для парных сравнений. Рассмотрим p-значение < 0,05 как статистически значимое.

Результаты

Чтобы оценить терапевтический потенциал шиконина, мы сначала оценили его влияние на выживаемость у септических мышей в течение 7-дневного периода. Лечение шиконином улучшало показатели выживаемости дозозависимым образом (Рисунок 1).

Учитывая широко распространенность повреждения легких при сепсисе, мы также оценили отек легких у мышей. Отек легких оценивали путем измерения соотношения влажной и сухой массы легких (W/D). Отношение W/D было значител...

Обсуждение

Будучи моделью золотого стандарта для исследований сепсиса, модель CLP является ключевым шагом в этом эксперименте, потому что CLP имитирует сложность сепсиса человека лучше, чем многие другие модели. Сепсис-ассоциированный ОПЛ остается критической клинической проблемой из-за его высокой смертности и ограниченной эффективности современных методов лечения^14,15. Наше исследование впервые демонстрирует, что шиконин значительно улучш...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
H& Набор для окрашивания	Solaibao Technology	G1120HE
Низкотемпературная центрифуга	Sigma	3K15
Microplate Reader	Bio-Rad	Model 680
моноклональное антитело к VEGF-рецептору	1 кролика Abcam	ab238632
кролик поликлональное HIF-1&альфа; антитело	Abcam	ab51608
SDS-PAGE Система электрофореза	Bio-Rad	MINI Protean2
Shikonin	MedChemExpress	HY-N0822