Методическая статья

Модифицированная мышиная модель внутричерепной аневризмы на основе гемодинамических изменений и артериальной гипертензии

DOI:

10.3791/68087

⸱

21 февраля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 3Department of Neurosurgery, Zaozhuang Municipal Hospital, 4Department of Neurosurgery, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутричерепная аневризма (ИА) была построена у мышей с использованием факторов риска гипертензии и гемодинамических изменений. Гемодинамические изменения индуцировались лигированием ветвей сонной артерии, в то время как гипертензия достигалась лигированием задних ветвей почечной артерии. Образование ИА выявляли с помощью магнитно-резонансной ангиографии, стереомикроскопии и патологоанатомического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутричерепная аневризма (ИА) представляет значительный риск для здоровья из-за заболеваемости и смертности, связанных с разрывом аневризмы. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития IA, остаются неясными, и требуется подходящая мышиная модель. Мышиная модель ИА была создана путем лигирования крыло-нёбной артерии (ППА) для индуцирования аддитивных гемодинамических изменений в сочетании с индукцией гипертензии. У самцов мышей C57BL/6 сосуды, включая правую PPA, наружную сонную артерию (ECA), затылочную артерию (OcA) и левую контралатеральную общую сонную артерию (CCA), лигировали для индуцирования гемодинамических изменений. Через неделю двусторонние задние ветви почечной артерии (пРА) были перевязаны, и была введена диета с 8% солью, чтобы вызвать гипертензию. Магнитно-резонансная ангиография (МРА), стереомикроскопия и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание были выполнены для оценки морфологических и патологических изменений ИА через три месяца после индукции. В экспериментальной группе четыре мыши умерли после первоначальной индукции. IA в разных местах была обнаружена у пяти из одиннадцати оставшихся мышей. Как микроскопическое, так и MRA исследование подтвердили образование IA. Патологоанатомический анализ и анализ ИГХ выявили нарушение внутренней эластической пластинки, разъединение коллагеновых волокон и инфильтрацию CD86-положительных макрофагов M1, что согласуется с теми, которые наблюдаются при ИА человека. Эта мышиная модель IA воспроизводит патологические изменения, наблюдаемые в образцах человека, и может служить ценным инструментом для исследования молекулярных механизмов образования и прогрессирования IA.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространенность внутричерепной аневризмы (ИА) оценивается в 3,2% от общей популяции1. ИА представляет значительный риск для здоровья из-за связанной с ним высокой заболеваемости и смертности. ИА является сложным и многомерным патологическим состоянием, на которое влияют гемодинамические изменения, воспаление и ремоделирование сосудов 2,3. Гемодинамические изменения и гипертензия участвуют в формировании и прогрессировании аневризм 4,5. IA часто возникает при бифуркациях головного мозга с повышенным гемодинамическим напряжением сдвига6, а бифуркации с узкими углами определены как факторы риска развития IA у человека7. Несмотря на достижения в области эндоваскулярного лечения и хирургических стратегий, субарахноидальное кровоизлияние, вызванное разрывом IA, остается катастрофическим. Таким образом, изучение фармакологических методов лечения является перспективным подходом к предотвращению разрыва аневризмы8. Однако механизмы, лежащие в основе патологического формирования и прогрессирования ИА, остаются неясными. Разработка подходящей мышиной модели формирования и прогрессирования ИА, основанной на факторах риска человека, имеет решающее значение для раскрытия основных механизмов и определения потенциальных терапевтических мишеней. Данное исследование направлено на построение модели формирования IA без разрыва у мышей, имитирующих характеристики IA человека.

Виллизиева круг (CW) соединяет и сообщает правую внутреннюю сонную артерию (ICA), левую ICA, а также двусторонние вертебробазилярные артерии. ХО служит компенсаторным механизмом в случаях окклюзии или стеноза ВСА или позвоночной артерии9. Крыловидная артерия (ППА) является ветвью ВСА, которая снабжает кровью внешнюю часть мозга10. Основываясь на компенсаторной функции CW, окклюзия PPA увеличивает кровоток в ICA. Комбинированное лигирование левой общей сонной артерии (ОСА), правой наружной сонной артерии (ОСА) и затылочной артерии (ОкА) приводит к увеличению кровотока в ХО, особенно при суженных углах, что приводит к гемодинамическим изменениям. В этой модели кровоснабжение мозга поддерживается вертебробазилярной артерией и правой ВСА. Лигирование ППА не способствовало смертности у мышей11.

Для индуцирования модели IA, основанной на инъекции эластазы, артериальную гипертензию индуцировали высвобождением ангиотензина-II (Ang-II) через насос Alzet или соль дезоксикортикостерона ацетата (DOCA)12,13. Высокую стоимость Alzet и DOCA следует учитывать в экспериментах с участием большого количества животных. Достигнутые уровни артериальной гипертензии достоверно не различались между лигированием задней и нижней ветвей двусторонних почечных артерий или только задних ветвей двусторонних почечных артерий. Однако первый подход приводил к большей почечной дисфункции14. Таким образом, лигирование двусторонних задних почечных артерий (пРА) считается рациональным методом для большинства исследователей.

Эластаза вводилась в спинномозговую жидкость в правой базальной цистерне путем однократной стереотаксической инъекции12. Модель IA на основе инъекции эластазы вызвала разрыв IA на 60%-80% через три недели после инъекции15,16, что слишком мало для изучения формирования и развития IA. Кроме того, нет никаких доказательств того, что у человека возникал повышенный уровень эластазы во время формирования IA. Кроме того, стереотаксическая инъекция в правый резервуар связана с высокой смертностью и инвалидностью у мышей, что создает значительные проблемы для новичков.

В этом исследовании мышиная модель ИА без разрыва в течение трех месяцев была построена на основе факторов риска человека. Эта модель устраняет высокую стоимость, связанную с DOCA и Alzet. Более того, она может быть выполнена с помощью только стереомикроскопа и может быть легко освоена новичками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все операционные процедуры на мышах соответствовали критериям Комитета по этической экспертизе и были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Шанхайского университета Цзяотун. Мышей-самцов C57BL/6 (в возрасте 8 недель, 20-25 г) содержали при температуре 22 °C с циклом свет/темнота 12 ч/12 ч. Рабочий процесс показан на рисунке 1А. Короче говоря, у животных, находящихся под наркозом, левая общая сонная артерия (ОСА), правая наружная сонная артерия (ХКА), затылочная артерия (OcA) и крыло-небная артерия (ППА) были перевязаны для индуцирования гемодинамических изменений. Впоследствии гипертензию индуцировали путем перевязки двусторонних почечных артерий (bRA) через неделю после начала гемодинамических изменений, и животных кормили диетой, содержащей 8% соли. Гемодинамические изменения и образование IA изображены на рисунке 1В. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Установление МАУ у мышей на основе гемодинамических изменений и гипертонической болезни

Примечание: Мышей голодали в течение 12 ч перед операцией. Хирургические инструменты стерилизовали путем замачивания их в 70% спирте не менее чем на 30 минут.

  1. Введение анестезии (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) с использованием аппарата для анестезии мелких животных с ингаляцией 2% изофлурана в смесиО2 (1 л/мин) на нагреваемой прокладке при температуре 37 °С.
  2. Лигеть левый CCA
    1. Сделайте линейный разрез на 1 см по средней линии шеи. Рассеките подкожную клетчатку и платизму, чтобы обнажить трахею.
    2. Оттяните яремную вену в сторону и расположите влагалище сонной артерии вдоль трахеи (рис. 2A i,ii). Отделите левый ОСА от блуждающего нерва. Перевязать левый CCA шелковым швом 6-0 (Рисунок 2A iii, iv).
  3. Легирование правильных ECA и OcA
    1. Обнажите анатомическое строение CCA, ICA, ECA, OcA, блуждающего нерва и подъязычного нерва с правой стороны. Перевязать правую ЭКА шелковым швом 6-0 (Рисунок 2A iii, iv).
    2. Изолируйте OcA и разделите его с помощью 8-0 шелковый шов (Рисунок 2A v - viii). Отсоедините OcA с помощью двух прямых микрощипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OcA, возникающая проксимально от ECA, находится ниже подъязычного нерва (Рисунок 2A, v - viii). Препарирование OcA помогает эффективно выявить анатомию PPA.
  4. Лигировать правильный PPA
    1. Изолируйте подъязычный нерв от ВСА. Поместите хирургическую вату между подъязычным нервом и ВСА, чтобы защитить нерв от травм, связанных с процедурой.
    2. Рассеките периваскулярную ткань вокруг ППА с помощью микрощипцов. Зажмите PPA и временно слегка потяните его вверх. Ставка 8-0 шелковый шов между PPA и ICA для лигатирования PPA (рис. 2A ix,x).
    3. Перевязывайте ППА и поддерживайте достаточное расстояние между местом лигирования и началом ППА для обеспечения кровотока в Виллисовом круге (Рисунок 2А х).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основной проблемой на этом этапе является лигирование ППА в чрезвычайно узком операционном пространстве без повреждения периферических нервов и сосудистых структур. Избегайте сдавливания трахеи во время воздействия ППА.
  5. Завершите операцию
    1. Простерилизовать операционное поле повидон-йодом и зашить рану. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.
  6. Вызвать гипертонию
    1. Сделайте разрез по средней линии длиной 2 см на12-м уровне позвонков на спине. Разрежьте спинные мышцы, чтобы обнажить почку. Зажмите жировую ткань вокруг почки с помощью щипцов и зафиксируйте почку внутри мышечного разреза (рисунок 2B i,ii).
    2. Изолируйте жировую ткань вокруг ножки почки. Определите рРА в тесном контакте с почечной веной (рис. 2B iii, iv). Зажмите pRA и подтяните его вверх с помощью прямых микрощипцов. Рассеките фасцию между пРА и почечной веной с помощью других микрощипцов (рис. 2B v,vi).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить повреждение почечной вены, которое может привести к катастрофическому кровотечению.
    3. Лигать pRA с помощью шелкового шовного материала 6-0 (Рисунок 2B vii, viii). Сразу после лигирования наблюдайте образование ишемических очагов в верхней части почки (рисунок 2В ix,x). Зашивайте разрезы мышц и кожи.

2. Исследование ИА с помощью МРА и стереомикроскопа

  1. Проведите времяпролетную магнитно-резонансную ангиографию (МРА) магнитно-резонансной томографии (МРА) 7,0 Тл через три месяца после индукции аневризмы для оценки формирования IA.
    1. Усыпляйте мышей путем обескровливания и вывиха шейки матки после анестезии изофлураном (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Обнаружение IA под стереомикроскопом, как сообщалось ранее17.
    2. Введите в образцы охлажденный PBS, затем 4% параформальдегид, а затем микрофил для визуализации сосудов и аневризм.
    3. Определите аневризму как выпячивающуюся наружу в 1,5 раза больше, чем исходная артерия, как наблюдают два независимых нейрохирурга 8,18.

3. Гистологические и иммуногистохимические анализы

  1. Изолируйте круги Виллиса под микроскопом. Зафиксируйте образцы с 4% параформальдегидом при температуре 4 °C в течение 24 ч19.
  2. Обрабатывайте образцы в парафиновые и замороженные срезы для гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания. Окрашивание парафиновых срезов пятнами EVG и Masson в соответствии с инструкциями производителя19.
  3. Инкубируйте парафиновые срезы с помощью блокирующего раствора, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание.
  4. Инкубируйте секции с первичными антителами к CD86 в течение ночи при 4 °C. После инкубации со вторичным антителом разработайте коричневый цвет, реагируя на участки с DAB20.
  5. Выполнить противоокрашивание гематоксилином и смонтировать секции водным монтажным раствором20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скорость формирования НМА
В опытной группе (n = 15) 2 мыши умерли в течение первой недели после первоначальной процедуры по неизвестным причинам. Одна мышь умерла от инфекции в ране спины на третий день после второй процедуры, а другая мышь умерла на 38-й день по неизвестным причинам, при этом аневризм не было обнаружено. В контрольной группе (n = 5) все 5 мышей дожили до жертвоприношения. Среди выживших мышей опытной группы (n = 11) систолическое артериальное давление через три месяца после индукции ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлен модифицированный подход к построению мышиной модели ИА путем лигирования ППА для индуцирования аддитивных гемодинамических изменений в сочетании с артериальной гипертензией. Визуализация МРТ и микроскопический анализ показали значительные аневризматические изменения в виллизматическом круге. Патологические изменения, наблюдаемые в этой модели, согласуются с теми, которые были обнаружены в образцах человека. Эта мышиная модель может служить ценным инструм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рукопись прочитана и одобрена всеми названными авторами, при этом нет других лиц, удовлетворяющих критериям авторства, но не указанных в списке. У авторов нет конфликтов интересов, связанных с рукописью, и не было существенной финансовой поддержки этой работы, которая могла бы повлиять на ее результат. Спонсоры не участвовали в сборе данных, анализе данных или написании статей. Рукопись ранее не публиковалась в Интернете или в печатных изданиях, в том числе в журналах, на веб-сайтах или в блогах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным институтом трансляционной медицины (Shanghai TMSK-2021-147), Шанхайским исследовательским проектом больницы Жэньцзи (RJTJ-QT-007) и Китайским фондом постдокторантуры (номер сертификата: 2024M760658).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
7,0 Т магнитно-резонансная ангиографияBrukerBioSpec 70/20 
C57BL/6 мышейCharles River Laboratoriesпол: мужское
антитело CD86 CST91882
Elastic Van Gieson (EVG)stainSolarbioG1597
MassonSolarbioG1340
МикрощипцыShanghai Jinzhong Instrument Company
MicrofilFlow Tech Inc.MV-120
Аппарат для анестезии мелких животных  Стереомикроскоп RWDR500
Шанхайская компания оптических инструментовXYH-6B
Шовный материалШанхайская медицинская компания6-0, 8-0
Jinhuan

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vlak, M. H., Algra, A., Brandenburg, R., Rinkel, G. J. Prevalence of unruptured intracranial aneurysms, with emphasis on sex, age, comorbidity, country, and time period: A systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 10 (7), 626-636 (2011).
  2. Turjman, A. S., Turjman, F., Edelman, E. R. Role of fluid dynamics and inflammation in intracranial aneurysm formation. Circulation. 129 (3), 373-382 (2014).
  3. Shikata, F., et al. Potential influences of gut microbiota on the formation of intracranial aneurysm. Hypertension. 73 (2), 491-496 (2019).
  4. Penn, D. L., Komotar, R. J., Sander Connolly, E. Hemodynamic mechanisms underlying cerebral aneurysm pathogenesis. J Clin Neurosci. 18 (11), 1435-1438 (2011).
  5. Vlak, M. H., Rinkel, G. J., Greebe, P., Algra, A. Independent risk factors for intracranial aneurysms and their joint effect: A case-control study. Stroke. 44 (4), 984-987 (2013).
  6. Alfano, J., et al. Intracranial aneurysms occur more frequently at bifurcation sites that typically experience higher hemodynamic stresses. Neurosurgery. 73 (3), 497-505 (2013).
  7. Idil Soylu, A., Ozturk, M., Akan, H. Can vessel diameters, diameter ratios, and vessel angles predict the development of anterior communicating artery aneurysms: A morphological analysis. J Clin Neurosci. 68, 250-255 (2019).
  8. Starke, R. M., et al. Critical role of TNF-alpha in cerebral aneurysm formation and progression to rupture. J Neuroinflammation. 11, 77(2014).
  9. Vrselja, Z., Brkic, H., Mrdenovic, S., Radic, R., Curic, G. Function of circle of Willis. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 578-584 (2014).
  10. Azedi, F., et al. Intra-arterial drug delivery to the ischemic brain in rat middle cerebral artery occlusion model. Bio Protoc. 9 (23), e3438(2019).
  11. Yoshimura, S., et al. Reliable infarction of the middle cerebral artery territory in C57BL/6 mice using pterygopalatine artery ligation and filament optimization - The PURE-MCAo model. J Cereb Blood Flow Metab. , (2024).
  12. Nuki, Y., et al. Elastase-induced intracranial aneurysms in hypertensive mice. Hypertension. 54 (6), 1337-1344 (2009).
  13. Tada, Y., et al. Roles of hypertension in the rupture of intracranial aneurysms. Stroke. 45 (2), 579-586 (2014).
  14. Eldawoody, H., et al. Simplified experimental cerebral aneurysm model in rats: Comprehensive evaluation of induced aneurysms and arterial changes in the circle of Willis. Brain Res. 1300, 159-168 (2009).
  15. Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2014).
  16. Furukawa, H., et al. Mast cell promotes the development of intracranial aneurysm rupture. Stroke. 51 (11), 3332-3339 (2020).
  17. Dungan, C. M., et al. Deletion of SA beta-Gal+ cells using senolytics improves muscle regeneration in old mice. Aging Cell. 21 (1), e13528(2022).
  18. Miyamoto, T., et al. Site-specific elevation of interleukin-1beta and matrix metalloproteinase-9 in the Willis circle by hemodynamic changes is associated with rupture in a novel rat cerebral aneurysm model. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 2795-2805 (2017).
  19. Xu, C., et al. CD147 monoclonal antibody attenuates abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-Infused apoE(-/-) mice. Int Immunopharmacol. 122, 110526(2023).
  20. Taube, J. M., et al. Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study. J Immunother Cancer. 9 (7), e002197(2021).
  21. Frosen, J., et al. Saccular intracranial aneurysm: Pathology and mechanisms. Acta Neuropathol. 123 (6), 773-786 (2012).
  22. Cai, J., He, C., Yuan, F., Chen, L., Ling, F. A novel haemodynamic cerebral aneurysm model of rats with normal blood pressure. J Clin Neurosci. 19 (1), 135-138 (2012).
  23. Arnaout, O. M., et al. De novo large fusiform posterior circulation intracranial aneurysm presenting with subarachnoid hemorrhage 7 years after therapeutic internal carotid artery occlusion: case report and review of the literature. Neurosurgery. 71 (3), E764-E771 (2012).
  24. Nagata, I., Handa, H., Hashimoto, N., Hazama, F. Experimentally induced cerebral aneurysms in rats: Part VI. Hypertension. Surg Neurol. 14 (6), 477-479 (1980).
  25. Aoki, T., Kataoka, H., Morimoto, M., Nozaki, K., Hashimoto, N. Macrophage-derived matrix metalloproteinase-2 and -9 promote the progression of cerebral aneurysms in rats. Stroke. 38 (1), 162-169 (2007).
  26. Grunwald, I. Q., et al. An experimental aneurysm model: a training model for neurointerventionalists. Interv Neuroradiol. 12 (1), 17-24 (2006).
  27. Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: Utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. J Neurointerv Surg. 8 (5), 521-525 (2016).
  28. Adibi, A., Eesa, M., Wong, J. H., Sen, A., Mitha, A. P. Combined endovascular coiling and intra-aneurysmal allogeneic mesenchymal stromal cell therapy for intracranial aneurysms in a rabbit model: A proof-of-concept study. J Neurointerv Surg. 9 (7), 707-712 (2017).
  29. Liao, B. Y., Zhang, J. Evolutionary conservation of expression profiles between human and mouse orthologous genes. Mol Biol Evol. 23 (3), 530-540 (2006).
  30. Han, Y., et al. Axl promotes intracranial aneurysm rupture by regulating macrophage polarization toward M1 via STAT1/HIF-1alpha. Front Immunol. 14, 1158758(2023).
  31. Wang, S., et al. Rabbit aneurysm models mimic histologic wall types identified in human intracranial aneurysms. J Neurointerv Surg. 10 (4), 411-415 (2018).
  32. Nowicki, K. W., Hosaka, K., Walch, F. J., Scott, E. W., Hoh, B. L. M1 macrophages are required for murine cerebral aneurysm formation. J Neurointerv Surg. 10 (1), 93-97 (2018).
  33. Shi, Y., et al. Nrf-2 signaling inhibits intracranial aneurysm formation and progression by modulating vascular smooth muscle cell phenotype and function. J Neuroinflammation. 16 (1), 185(2019).
  34. Morimoto, M., et al. Mouse model of cerebral aneurysm: experimental induction by renal hypertension and local hemodynamic changes. Stroke. 33 (7), 1911-1915 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

M1
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи