Создание мышиной модели для лечения псориаза с помощью Imiquimod

Краткое содержание

Здесь мы представляем высокоэффективную и стабильную мышиную модель псориаза, созданную с помощью имиквимода. Кроме того, мы подробно описываем методологии, используемые для оценки тяжести псориаза.

Аннотация

Псориаз — это распространенное, хроническое, рецидивирующее и воспалительное заболевание кожи, характеризующееся утолщенной инфильтрацией кожи, чешуйками и эритемой. Патогенез заболевания очень сложен и включает в себя взаимодействие различных факторов, таких как генетика, иммунитет и факторы окружающей среды. Чтобы исследовать механизмы, лежащие в основе псориаза, исследователи разработали несколько животных моделей заболевания. Однако вариативность методологий создает проблемы для последовательного построения этих моделей. В этом исследовании мы создали и всесторонне оценили высокоэффективную и стабильную мышиную модель псориаза с использованием имиквимода (IMQ). 8-недельные самки мышей класса SPF C57BL/6J были использованы для создания модели мышей с псориазом. После одной недели акклиматизации были исключены мыши с раздраженной или поврежденной кожей в депилируемых зонах. Начиная со второго дня, 5% крем IMQ (62,5 мг/сут) наносился ежедневно на депилированную область шеи и спины в течение семи дней подряд. Во время эксперимента проводились ежедневные измерения массы тела, фотографирование кожи, оценка кожи и поведенческие наблюдения. После эксперимента проводили определение индекса селезенки, гистологический анализ кожи, определение сывороточных цитокинов и определение уровня мРНК кожи. Результаты показали, что у мышей в группе IMQ развились типичные псориазоподобные симптомы, включая эритему, чешуйки и утолщение кожи, сопровождающиеся повышенным поведением при расчесывании, потерей веса, повышенным индексом селезенки и увеличением толщины кожи. И значительные изменения уровней TNF-α, IL-23 и IL-17A в сыворотке крови, а также уровней мРНК IL-23, IL-17A, IL-17F и ИФН-γ в коже. Уровни сывороточных цитокинов (TNF-α, IL-23, IL-17A) и экспрессия мРНК кожи провоспалительных маркеров (IL-23, IL-17A, IL-17F, ИФН-γ) были заметно повышены. В отличие от этого, в контрольной группе таких изменений не наблюдалось. Оптимизируя продолжительность индукции IMQ и стандартизируя протокол введения, а также динамически отслеживая изменения кожи, это исследование направлено на то, чтобы предоставить исследователям стандартизированную основу для построения надежных моделей псориаза.

Введение

Псориаз является распространенным, хроническим, рецидивирующим и воспалительным системным заболеванием кожи, при этом бляшечный псориаз является наиболее преобладающим клиническим проявлением¹. Его клинические характеристики обычно включают инфильтрацию кожи, толщину, чешуйки и эритему², а также он может вызывать различные осложнения, включая псориатический артрит, депрессию, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания¹. Кроме того, псориаз часто сопровождается хроническим зудом³. Во всем мире псориазом заболевает от 2^{% до 3}% населения4, и его заболеваемость растет. Таким образом, создание надежных животных моделей, которые точно имитируют патологические особенности псориаза человека, имеет решающее значение для раскрытия его патогенеза и разработки новых терапевтических стратегий.

В области дерматологических исследований псориаз привлек к себе значительное внимание из-за его сложного патогенеза, который включает в себя взаимодействие генетических, иммунологических факторов и факторов окружающей среды, что создает значительные проблемы для углубленного изучения¹. Современные исследования показывают, что возникновение псориаза в первую очередь опосредовано Т-клетками, которые при активации стимулируют кератиноциты к чрезмерной пролиферации и изменяют секрецию цитокинов^{в процессе их} дифференцировки. В этом процессе ключевую роль играет ось интерлейкин (ИЛ)-23/ИЛ-17. IL-23 способствует дифференцировке и активации клеток Th17, которые продуцируют цитокины, такие как IL-17A и IL-17F, играя значительную роль в развитии псориаза ^6,7,8. В настоящее время патогенез псориаза включает в себя многочисленные молекулярные изменения. К ним относятся цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), ось IL-23/IL-17, IL-37, внутриклеточные сигнальные пути, такие как ядерный фактор-κB (NF-κB), а также трансдукция и активатор транскрипционного сигнала янус-киназы (JAK-STAT). Кроме того, он тесно связан с молекулами, связанными с сахаром, циклом трикарбоновых кислот (ТСА), аминокислотами, путями липидного обмена, а также эпигенетическими регуляторными факторами, включая метилирование ДНК и модификацию гистонов. Эти мишени тесно переплетены и взаимодействуют друг с другом, совместно способствуя возникновению и прогрессированию псориаза⁹.

В современных исследованиях псориаза используются различные животные модели, в том числе спонтанные модели, аллогенные модели трансплантации, трансгенные модели или модели нокаута генов, а также модели с химически индуцированными^{веществами.} Эти животные модели играют важную роль в изучении псориаза, при этом ученые использовали несколько видов, таких как мыши, морские свинки и рыбки данио, для создания моделей псориаза 11,12,13. Тем не менее, все эти модели имеют определенные ограничения, включая генетическую сложность, видовые различия, этические проблемы и соображения^{стоимости.}

Имиквимод (IMQ), являясь агонистом толл-подобных рецепторов (TLR), может вызывать воспаление кожи и инфильтрацию иммунных клеток, а также способствовать пролиферации кератиноцитов и увеличению кожных кровеносных сосудов¹³. В исследовании сообщается, что местное применение IMQ у людей может вызвать псориаз¹⁵. Клинические наблюдения также показали, что IMQ усугубляет симптомы псориаза у пациентов⁷. В моделях псориаза у мышей непрерывное введение 5% концентрации IMQ может воспроизводить кожные проявления псориаза человека, такие как эритема и чешуйки. Кроме того, другие симптомы очень похожи на симптомы бляшечного псориаза человека, включая эпидермальные изменения, такие как акантоз и паракератоз, неоангиогенез и так далее. Мышиные модели псориаза, индуцированные IMQ, также способны моделировать хронический зуд⁴. Также наблюдается инфильтрация воспалительных клеток, состоящих из Т-клеток, нейтрофилов и дендритных клеток в мышиных моделях псориаза ^2,16. IMQ-индуцированные поражения кожи в основном зависят от оси TNF-α-IL-23/IL-17, что указывает на то, что мышиные модели псориаза на основе IMQ могут быть использованы для дальнейшего исследования псориаза^{человека.}

Мышиная модель IMQ-индуцированного псориаза, использованная в этом исследовании, подходит для таких линий мышей, как C57BL/6 и BALB/c, которые имеют тенденцию к Th1 и Th2 соответственно⁷. Эта модель стабильна и высокоэффективна, обладает такими преимуществами, как низкая стоимость, короткая продолжительность эксперимента, простота в эксплуатации, отчетливые симптомы и высокий процент успеха. В эксперименте мы подробно рассказали о нескольких методах, используемых для мониторинга прогрессирования псориаза. Эти методы включали в себя оценку кожи и поведенческое тестирование. Кроме того, мы дополнительно подтвердили экспериментальные результаты с помощью гистопатологического анализа, иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Эта модель подходит не только для изучения патогенеза псориаза, но и для доклинической оценки новых терапевтических подходов, что делает ее ценным инструментом в исследованиях.

Протокол

Протокол использования животных, перечисленный ниже, был рассмотрен и одобрен Комитетом по институциональному благополучию и этике Университета китайской медицины Гуанси (DW20191220-153). Сертификат животного на купленных мышей был SCXK (Xiang) 2024-0009. В этом исследовании 8-недельные самки мышей C57BL/6J класса SPF были случайным образом разделены на группы, каждая из которых состояла из 6 мышей. Клетка размещается в помещении с регулируемой температурой (23 ± 2 °C, цикл 12 часов света/темноты) со свободным доступом к пище и воде. Блок-схема эксперимента представлена на рисунке 1. За исключением того, что их не индуцировали кремом IMQ, мыши в контрольной группе получали такое же лечение, как и в группе IMQ, во всех остальных отношениях.

1. Подготовка животных

1. Приступайте к моделированию после адаптации животного к окружающей среде в течение недели. Перед началом эксперимента тщательно продезинфицируйте экспериментальный стол с помощью 75% раствора этанола.
2. С помощью маркера четко обозначьте хвосты мышей, обеспечив их индивидуальную идентификацию.
3. С помощью бритвы сбрейте шерсть на шее и спине всех мышей на площади около 4 см х 3 см (день 0; Рисунок 2А). С помощью ватного тампона нанесите необходимое количество крема для депиляции на выбритую кожу и равномерно распределите его (рисунок 2B).
4. После нанесения крема для депиляции подождите около 15 с. Оставьте крем для депиляции на поверхности кожи мыши на оптимальные 15-20 с. Аккуратно и быстро протрите.
5. С помощью нового ватного тампона смочите его в воде и многократно протрите по направлению от хвоста мыши к голове, чтобы очистить волосы. Аккуратно высушите местную кожу медицинской впитывающей бумагой.
6. Изучите состояние кожи мышей через 24 ч после депиляции и исключите мышей с поврежденными участками депиляции.

2. IMQ-индуцированная модель псориаза у мышей

1. Убедитесь, что небольшие повреждения кожи, вызванные бритьем или депиляцией, полностью восстановлены.
2. Начиная со^2-го дня применять 5% IMQ крем в дозировке 62,5 мг⁷. Для этого необходимо заранее наполнить весь шприц объемом 1 мл кремом IMQ и ввести препарат мыши согласно объему, соответствующему 62,5 мг IMQ в сутки на депилированную кожу мыши с помощью ложки с плоской ручкой (рисунок 2С). Во время нанесения следите за тем, чтобы крем IMQ был максимально равномерно распределен по депилируемой зоне, а область нанесения была меньше зоны депиляции.
3. Размазав препарат, поместите мышь в пустую клетку и подождите 15 мин. Поместите мышь обратно в клетку для кормления после того, как препарат полностью впитается. Выполнять применение препарата непрерывно в течение 7 дней.

3. Анализ массы тела мышей с псориазом

1. Поместите чистый стакан на электронные весы и задержите его. Затем аккуратно поместите мышь внутрь и запишите стабильные показания, отображаемые на весах.
2. С 1-го дня (за день, предшествующий первоначальному применению IMQ) взвешивайте мышей ежедневно до 8-го дня. Сравните вес каждой мыши с соответствующим весом в день 1.

4. Характеристика кожи мышей с псориазом

1. Поместите мышей на белый фон с помощью линейки. Держите тела мышей прямо, не сжимая голову и не делая больших раскачиваний (Рисунок 3).
2. Начиная с первого дня, каждый день делайте фотографии места введения мышей с высоким разрешением при одинаковой интенсивности освещения и записывайте характеристики кожи мышей.
3. Во время каждой фотосессии соблюдайте постоянное расстояние между камерой и мышами, а также увеличивайте камеру и располагайте линейку перпендикулярно камере.

5. Оценка скинов

1. Оценивайте тяжесть псориазного дерматита у мышей с помощью модифицированного индекса площади и тяжести псориаза (PASI)¹⁷ каждый день с 1-го по 8-й день. Используйте трое исследователей с помощью двойного слепого метода для независимой оценки эритемы, чешуи и толщины кожи по шкале от 0 до 4, используя среднее арифметическое трех методов. Правила подсчета баллов PASI см. в таблице 1.
   Оценка по шкале PASI = эритема + чешуйка + толщина

6. Поведенческое наблюдение за мышами

1. В том же тихом, нормально освещенном помещении при комнатной температуре (как в шаге 4) поместите каждую мышь в индивидуальную акриловую коробку (10 см x 10 см) с небольшим количеством набивки из кукурузных початков на дне.
2. Используйте черные перегородки, чтобы отделить каждую коробку и перекрыть линию обзора. После 15-минутного периода адаптации запишите поведение животных на видео в течение 1 часа.
3. Записывайте поведенческие видео в определенное время каждый день с 1-го по 8-й день. Расположите объектив камеры перпендикулярно акриловой коробке и убедитесь, что он полностью фиксирует действия мыши внутри.
4. Записывайте случаи, когда мышь поднимает заднюю лапу, чтобы почесать шею и спину, а затем опускает ее в знак зуда.

7. Забор крови и измерение уровня цитокинов в сыворотке крови методом ИФА

1. Быстро удалите глазные яблоки мышей щипцами и соберите кровь на 9-й день.
2. Оставьте кровь при температуре 4 °C на 4 часа. Отделите кровь с помощью низкотемпературной центрифуги при давлении 3000 x g в течение 30 минут при 4 °C. Соберите сыворотку и храните ее при температуре -80 °C для дальнейшего использования.
3. Количественно оценивайте уровни ФНО-α, ИЛ-17А и ИЛ-23 в сыворотке крови с помощью соответствующего набора ИФА в соответствии с протоколом производителя¹⁸.

8. Забор образцов кожи и селезенки

1. Согласно правилам соответствующего комитета по этике экспериментов на животных, вывихнуть шейные позвонки мышей для эвтаназии после забора крови на 9-й день.
2. После эвтаназии разрежьте повреждения кожи на спине мышей на две части. Погрузите одну порцию в центрифужную пробирку объемом 5 мл с 4% раствором параформальдегида для фиксации и консервации. Отделите и упакуйте другую часть тканей кожи и храните их при температуре -80 °C для использования в будущем.
3. С помощью стерилизованных ножниц разрежьте кожу по средней линии брюшка мыши, обнажите брюшную полость, а также найдите и полностью удалите селезенку. Промойте образцы стерильным физиологическим раствором, затем поместите их в физиологический раствор, взвесьте и запишите данные.

9. Гистологические анализы участков кожи

1. Удалите кожную ткань из параформальдегида и поместите его в закладную коробку.
2. Выполните следующие действия на коже: Используйте градиентный спирт от 75% до 100% (от низкой до высокой концентрации), с тремя баллонами 100% спирта. Оставьте его в каждой емкости на 30 минут при комнатной температуре. Используйте два баллона с ксилолом. Оставьте его в каждой емкости на 30 минут при комнатной температуре. Используйте три емкости парафинового воска с температурой плавления 56-58 °C. Оставьте его в каждой емкости на 1 час при комнатной температуре.
3. Внедрите обработанную ткань кожи: поместите пропитанную воском ткань кожи вертикально в форму для парафина. Высыпайте расплавленный парафин в форму, когда температура закладного парафина будет на 5-7 °C выше температуры плавления парафина. Быстро переместите его на стол для заморозки, чтобы быстро охладить и затвердеть восковой блок.
4. Заморозьте восковой блок до 0 °C, выньте его из закладной коробки, закрепите на прижимном столе слайсера и нарежьте до толщины 3 мкм.
5. С помощью пинцета возьмите срезы и бланшируйте их в теплой воде при температуре 45 °C. Приложите срез к центру гладкой части предметного стекла и отметьте карандашом патологическое число на матовом участке. Наклоните горло на 45° на мгновение, чтобы влага вытекла, затем поставьте в духовку при температуре 62 °C и выпекайте 30 минут.
6. Окрашивание HE: Поместите ломтики в ксилол на 5 минут, затем в другой резервуар с ксилолом на 5 минут, в безводный этанол на 1 минуту, в 95% этанол на 1 минуту, в 85% этанол на 1 минуту и в 75% этанол на 1 минуту. Промыть водопроводной водой в течение 1 мин, испачкать раствором гематоксилина в течение 5 мин, и смыть раствор гематоксилина под проточной водой в течение 1 мин.
7. Замочить в 1% этаноле соляной кислоты на 3 с, промыть водой в течение 20 с, использовать теплую воду для синего возврата в течение 5 мин, промыть проточной водой в течение 2 мин, окрасить 0,5% эозином в течение 1 мин, замочить в 95% этаноле на 2 с, затем в 95% этаноле на 2 мин, в безводном этаноле на 4 мин, в другом резервуаре с безводным этанолом в течение 4 минут, в ксилоле в течение 4 минут, в другом резервуаре с ксилолом в течение 4 минут, и в последнем резервуаре с ксилолом в течение 4 минут. После сушки на воздухе запечатайте его нейтральной камедью.
8. Наблюдайте за срезами под микроскопом и произвольно делайте снимки в трех положениях с увеличением 400. Для каждого снимка случайным образом измерьте толщину эпидермиса в пяти местах с помощью программного обеспечения Image J. Записывайте и анализируйте данные.

10. Измерение уровня мРНК IL-17A, IL-17F, IL-23 и ИФН-γ в коже методом ОТ-кПЦР

1. Возьмите ткань кожи, хранящуюся в холодильнике при температуре -80 °C, весом около 100 мг, и извлеките РНК методом Тризола.
2. Обратная транскрибация в кДНК по набору для обратной транскрипции (VAZYME, Китай).
3. Сконфигурируйте реакционную систему ПЦР в соответствии с инструкцией и проведите ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного количественного ПЦР-прибора в соответствии с указанной процедурой реакции (Таблица 2) и последовательностью праймера (Таблица 3).
4. Соберите данные количественной ПЦР флуоресценции в режиме реального времени, рассчитайте и проанализируйте результаты с помощью алгоритма количественной ПЦР (метод 2-ΔΔCt).

Результаты

После продолжительного введения IMQ у мышей в группе IMQ наблюдались клинические симптомы кожи спины, напоминающие псориаз (рис. 4), при этом в области, индуцированной IMQ, проявлялись типичные симптомы эритемы, чешуи и толщины (рис. 5). Напротив, в контрольной группе не наблюдалось никаких симптомов, сходных с симптомами в группе IMQ. По сравнению с контрольной группой, эритема и малые чешуйки начали появляться в группе IMQ с 3-го дня (рис....

Обсуждение

В нашем исследовании используется IMQ для индуцирования псориазоподобных поражений кожи, тем самым создавая модель псориаза. Эта модель может быть использована для изучения механизмов, лежащих в основе развития псориаза, и для получения представления о разработке методов лечения этого заболевания. В исследовании ван дер Фитса⁷, при первоначальном введении индукции IMQ, время индукции было установлено на уровне 5 или 6 дней. Тем не менее, Jabeen et al. предположили...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5% крем имиквимод	Sichuan Medshine Pharmaceutical Co.
75% этанол	XUE HUAN	20240401
Аналитические весы	sartorius	SQP
Крем для депиляции	Reckitt Benckiser	20240612 08X
Электронные весы	Yingheng Technology	7915
Медицинская папиросная бумага	JD	20221208
Shaver	HORD shenjian	AUX-C6S
Стерилизованный ватный тампон	реки Бэйлунь	20230728

40220602