Method Article

Настройка режимов сократимости и деформации активных сборок на основе актина in vitro: от двумерных активных сетей до жидкокристаллических капель

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем методы получения квазидвумерных (2D) запутанных, сшитых и жидкокристаллических актиновых сборок из очищенных белков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Материалы на основе актиновых цитоскелетов широко исследуются в качестве модельных клеточных материалов для выяснения физических механизмов клеточной механики, таких как регуляция формы и производство силы, а также интригующих мягких полимерных материалов. В этом методе мы подробно описываем создание сборок на основе актина in vitro с использованием очищенного белка для исследований флуоресцентной микроскопии. Мы полимеризуем длинные актиновые филаменты в камере для образцов и используем полимерный деплетант для вытеснения филаментов в двумерную (2D)-запутанную сеть на поверхности, пассивированной слоем поверхностно-активного вещества. Добавление филаментов миозина II скелетных мышц в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ) вызывает сокращение актиновой сети. Объединяя актиновые филаменты с помощью сшивающего агента, мы настраиваем сократительную способность сборки, переходя от материала, который изгибается, к материалу, который скользит в микромасштабе. Уменьшая длину актиновых филаментов за счет сополимеризации актина в присутствии кэппинг-белка, мы превращаем материал из 2D-сети в жидкий кристалл. Сшивание дисперсных коротких актиновых филаментов приводит к образованию трехмерных (3D) жидкокристаллических капель.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активные биологические материалы лежат в основе механических процессов в различных физиологических процессах, включая внутриклеточный транспорт, миграцию клеток, регуляцию формы клеток и генерацию биологических сил 1,2,3. Сборки in vitro цитоскелетных систем, построенные из очищенных и сконструированных белковых компонентов, самоорганизующихся в буфере, являются признанным инструментом для характеристики фундаментальных биофизических и биохимических процессов 4,5,6,7. Эти упрощенные модельные системы позволяют изучать белки без сложностей клеточной среды, что позволяет идентифицировать роли отдельных компонентов. В дополнение к поддержке фундаментальных биологических исследований, цитоскелетные сборки in vitro также широко разрабатываются в качестве экспериментальных систем для исследования жидкокристаллических и активных или неравновесных материалов 8,9,10,11,12,12,13,14,15.

Актин является ключевым биополимером в цитоскелетных сборках, регулирующим механику и динамику клеток с помощью моторных и полимеризационных сил 3,16. Эксперименты с флуоресцентной микроскопией позволяют визуализировать структурные изменения актиновой сети во время таких процессов, как моторное сокращение и связывание актина с помощью сшивающихся белков. Визуализация трехмерных актиновых сетей по мере их ремоделирования встроенными моторными белками пролила свет на роль актиновых сшивающих агентов в сокращении сети и формировании паттернов 12,17,18,19. Тем не менее, квазидвумерные актиновые сети преодолевают трудности визуализации с достаточным пространственно-временным разрешением для фиксации структурных изменений сети. Кроме того, квазидвумерные актиновые структуры высокой плотности являются более близким имитатором клеточных сборок, таких как плотная актиновая кора клетки20. Стратегии получения квазидвумерных актиновых структур включали присоединение актиновых белков к покровному стеклу21,22, связывание актина с поверхностью через линкерные молекулы 10,23,24, образование плотных актиновых пучков, прикрепленных к бусинам на поверхности покровного стекла 25,26, и концентрирование актиновых филаментов на поверхности покровного стекла с молекулярными скученными агентами10,27.

В этой статье мы подробно описываем метод создания воспроизводимых сборок на основе актина модели и способы его модификации для подготовки вариаций от активных сетей до квази-2D жидких кристаллов и нематических капель. Ранее мы использовали аналогичные методы для изучения образования фазово-разделенных жидкокристаллических капель коротких актиновых филаментов с добавлением сшивающего агента11, изменений в моделях деформации актиновой сети, генерируемых миозином II (например, изгиб филамента или относительное скольжение) с поперечным сшиванием филаментов и связностью28, различия в силах, генерируемых миозином II, на актиновых пучках с различным расстоянием иподатливостью 29, и миозин II транспортный30. Использование сшивающих белков и белков каппинга актина позволяет систематически варьировать длину актинового филамента и архитектуру сборки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Белки и мечение: Для целей настоящего протокола предполагается, что исследователь начинает с запасов очищенных белков, которые флуоресцентно мечаются, когда это целесообразно для исследования флуоресцентной микроскопии. Эти белки могут быть куплены или очищены и флуоресцентно помечены в лаборатории 31,32,33,34,35,36,37. В этом протоколе использовались запасы белков, которые были заморожены в жидком азоте и хранились при температуре -80 °С. Белки обычно могут быть помечены аналогичными методами. Белок может быть помечен как ступень очистки или из замороженного бульона. Разморозьте замороженные белковые запасы на льду, прежде чем приступать к маркировке. Ниже приведен метод флуоресцентного мечения миозина II скелетных мышц (миозина) с помощью малеимид-функционализированного флуорофора (адаптировано из38).

1. Приготовьте миозин с флуоресцентной мечкой

  1. Начните с ~2 мл миозина в концентрации 5-10 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовали миозин II скелетных мышц, выделенный из куриных мышц с использованием опубликованных методов35 . Миозин хранится в буфере для хранения миозина (25 мМ KPO4, 0,6 М KCl, 10 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1 мМ дитиотреитол (DTT), pH 6,6) либо сразу после очистки, либо из замороженного сырья. Важно постоянно держать миозин в холоде, чтобы предотвратить потерю двигательной активности.
  2. Добавьте DTT в размороженный раствор миозина до конечной концентрации 10 мМ. Используйте стоковое решение 1M DTT, чтобы ограничить объем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DTT снижает тиоловую группу цистеинов в белке миозина, подготавливая их к реакции с малеимидом для мечения.
  3. Чтобы предотвратить вмешательство в реакцию мечения, удалите DTT путем диализа в течение ночи в 50 мМ HEPES, 500 мМ KCl, 1 mM EDTA, pH 7,6, при 4 °C.
  4. После диализа раствор миозина центрифугируют при 100 000 x g при 4 °C в течение 15 минут для гранулирования любых агрегатов. Соберите надосадочную жидкость.
  5. Определяют концентрацию миозина в надосадочной жидкости с помощью спектрофотометра. Оцените концентрацию миозина с использованием коэффициента экстинкции при 280 нм ~148 000 М-1 см-1 для миозина скелетных мышц38. Этот коэффициент экстинкции предполагает, что «мономер» состоит из одной тяжелой цепи, одной основной легкой цепи и одной регулирующей легкой цепи.
  6. Готовят флуорофор для реакции мечения путем ресуспендирования порошкообразного флуорофора в сухом диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 5 мМ флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой флуорофор с малеимимидной реакционноспособной группой должен работать. Использовался малеимид Alexa 647. ДМСО гигроскопичен и накапливает воду. «Сухой» ДМСО относится к ДМСО, который хранился в окружающей среде для предотвращения накопления воды. Чтобы убедиться, что растворитель является сухим ДМСО, для этого этапа использовалась только что открытая ампула ДМСО. Не откладывайте растворы ДМСО на лед. ДМСО имеет температуру плавления 19 °C, поэтому он должен быть комнатной температуры (или чуть теплее) для пипетки39.
    ВНИМАНИЕ: ДМСО может проникать в перчатки, поэтому рекомендуется носить двойные нитриловые перчатки и следить за тем, чтобы предотвратить разливы.
  7. Чтобы приготовить миозин для добавления флуорофора, кратковременно снимите раствор миозина со льда и дайте ему нагреться до комнатной температуры (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте миозин в режиме лучевой терапии дольше, чем это необходимо. Делайте этот шаг после того, как флуорофор будет суспендирован в ДМСО.
  8. Как только раствор миозина приблизится к RT, добавьте раствор флуорофора к миозину и быстро перемешайте так, чтобы молярное соотношение флуорофора и миозина составило 5:1. Поместите раствор миозина на лед, как только он смешается с флуорофором.
  9. Инкубировать на льду в течение 1 ч, защищенном от света, затем остановить реакцию, добавив ДТТ до концентрации 1 мМ. Используйте приклад 1M DTT, чтобы свести к минимуму добавляемый объем.
  10. Удалите непрореагировавшие флуорофоры. Используйте один из двух способов, описанных ниже:
    1. Вариант 1:
      1. Полимеризуйте миозин, медленно разбавляя его в F-буфер (10 мМ имидазола, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 2 мМ EGTA, 4 мМ АТФ, pH 7,5). Это примерно 10-кратное разбавление, в зависимости от объема красителя, добавленного на шаге 1.8.
      2. Выдерживать на льду в течение 20 минут. Вращайте при 8 000 x g в охлаждаемой центрифуге при 4 °C в течение 10 минут до гранулирования.
      3. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую свободный краситель, и восстановите/деполимеризуйте миозин с помощью буфера для хранения миозина (начиная с Шага 1). Для удаления остатков красителя необходимо провести диализ в 5 мМ 2-[4-(2-сульфоэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоте (PIPES), 0,45 М KCl, pH 7,0 (превышение объема в >100 раз) три раза в течение 15 мин каждый раз с использованием отсечного диализного стакана 10 кД.
    2. Вариант 2:
      1. Используйте обессоливающую колонну для замены буфера в трубки 5 мМ, 0,45 М KCl, pH 7,0, в соответствии со стандартным протоколом от производителя колонки.
  11. Оцените соотношение флуорофора к белку путем измерения концентрации миозина и флуорофора с помощью спектрофотометра, используя коэффициенты экстинкции для миозина при 280 нм и для флуорофора, как указано производителем. Типичным является соотношение 2-4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меченый миозин теперь готов к мгновенной заморозке аликвот в жидком азоте. Аликвоты хранятся при температуре -80 °C для длительного хранения.

2. Опционально: Процедура удаления неактивного миозина

Примечание: Миозин можно использовать непосредственно из размороженной аликвоты в экспериментах, но некоторая часть миозина будет неактивна. В следующей процедуре описано, как удалить неактивный миозин. Это необязательный шаг, но он может иметь решающее значение для воспроизводимости. Аликвоты миозина используются в течение примерно 3 дней после размораживания, хранятся при температуре 4 °C или на льду.

  1. Полимеризуйте немеченный, стабилизированный фаллоидином актин:
    1. Смешайте 10 мкл 10-кратного F-буфера, 1 мкл 100 мМ АТФ и ddH2O таким образом, чтобы конечный объем (включая актин на шаге 2.1.2) составил 100 мкл в микроцентрифужной пробирке.
    2. Добавьте мономер актина до конечной концентрации 20 мкМ и перемешайте пипетки.
    3. Для стабилизации актиновых филаментов добавляют фаллоидин до конечной концентрации 6,7 мкМ, используя запас 100 мкМ фаллоидина в смеси метанола и пипеток.
      ВНИМАНИЕ: Фаллоидин является токсином40. Избегайте разливов и загрязнения.
    4. Инкубируйте на льду в течение 20 минут, чтобы актин успел полимеризоваться. После полимеризации актин хранить при температуре 4 °C для будущих вращений.
  2. Пипетку смешайте 10 мкл фаллоидин-стабилизированного актина, 3 мкл 10-кратного F-буфера, 0,3 мкл 100 мМ АТФ, 6 мкл 2 М KCl и ddH2O до конечного объема 30 мкл (включая объем, связанный с добавлением миозина на следующем этапе) в микроцентрифужной пробирке на льду.
  3. Добавляйте димерный меченый миозин из готового бульона до нужной концентрации, поддерживая молярное соотношение миозина к актину ≤ 1:6.
  4. Полученный раствор центрифугировать холодным (4 °C) при 100 000 x g в течение 30 минут. Неактивный миозин будет связываться с актиновыми филаментами и оставаться связанным. Неактивные филаменты миозина и актина образуют гранулу во время центрифугирования.
  5. Удалите надосадочную жидкость (содержащую активный миозин) и храните ее при температуре 4 °C для использования в экспериментах.
  6. Оценивайте концентрацию миозина с помощью того же спектрофотометрического метода для измерения концентрации миозина после мечения.
    Примечание: При концентрациях белков и АТФ, которые остаются в надосадочной жидкости, пик поглощения 280 нм скрыт пиком поглощения АТФ 260 нм, поэтому измерение концентрации через поглощение, связанное с флуорофором, или измерение относительной флуоресценции является более точным.

3. Приготовьте раствор поверхностно-активного вещества

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор поверхностно-активного вещества также можно приобрести предварительно смешанным и готовым к использованию.

  1. Начните с чистого стеклянного флакона. Промойте флакон в воде и этаноле, чтобы удалить потенциальные загрязнения в масле, которое является растворителем для поверхностно-активного вещества. Используйте флаконы из боросиликатного стекла с крышкой, покрытой политетрафторэтиленом (ПТФЭ).
  2. Наберите 5-20 мг фторповерхностно-активного вещества с помощью наконечника для пипетки и положите на дно стеклянного флакона. Измерьте количество поверхностно-активного вещества по весу с помощью весов с точностью до миллиграмма.
  3. Пипеткой наберите соответствующий объем фторсодержащего масла, чтобы получился 2 мас.% раствор и закройте флакон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масло летучее, поэтому закройте флакон сразу после измерения.
  4. Вихрь на небольшой скорости перемешивают.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель. Возраст и качество поверхностно-активного вещества могут влиять как на скученность, так и на внешний вид актина. Актин, который кажется крапчатым, прилипшим к поверхности или не скученным к поверхности, может указывать на необходимость свежего раствора поверхностно-активного вещества. Хранение под газообразным азотом может увеличить срок годности.

4. Подготовьте камеру для образцов (три варианта)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описана процедура создания трех стандартных камер для образцов, используемых для подготовки образцов к микроскопии. Следующие два раздела посвящены подготовке собственно образца и пассивации пробоотборной камеры для загрузки образца.

  1. Вариант 1: Flowcell
    ПРИМЕЧАНИЕ: Простая проточная ячейка является стандартным способом изготовления образцов для микроскопа во многих лабораториях. Для этого протокола он особенно подходит для образцов, заключенных в капли эмульсии. Может быть трудно достичь больших плоских полей зрения с помощью поверхностно-активного покрытия, описанного в этом протоколе, поэтому для 2D-образцов варианты 2 и 3 часто являются более воспроизводимыми. Геометрия канала также может привести к неравномерному смешиванию компонентов, добавленных в более позднее время, таких как миозин.
    1. Поместите 2 куска двустороннего скотча параллельно друг другу по ширине предметного стекла микроскопа, чтобы сформировать границы канала проточной ячейки. Канал, образованный между двумя кусками ленты, должен быть примерно 2 мм в ширину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие каналы помогают предотвратить застревание эмульсий в начальной части канала. Чтобы сделать хорошую герметизацию, используйте куски ленты чуть длиннее, чем ширина стеклянного предметного стекла, и обрежьте после постройки проточной ячейки.
    2. Поместите покровное стекло на канал ленты. Убедитесь, что покровное стекло расположено перпендикулярно предметному стеклу микроскопа. Используйте для этой цели покровное стекло размером 30 мм x 40 мм, так как оно обеспечивает небольшой свес при размещении на предметном стекле.
    3. Чтобы обеспечить хорошее уплотнение и устранить воздушные карманы между лентой и покровным скотчем, надавите на область покровного стекла, которая соприкасается с двусторонним скотчем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сломать покровное стекло при надавливании по краям. Потирание области округлым предметом, например, концом маркера с колпачком, хорошо подходит для придавливания ленты.
    4. С помощью лезвия бритвы обрежьте все излишки ленты со предметного стекла микроскопа и покровного стекла так, чтобы единственная видимая лента находилась в канале образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при выполнении этого шага, так как при попытке снять ленту легко случайно сломать покровное стекло.
  2. Вариант 2: Цилиндр на необработанном покровном покрытии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вариант подходит для 2D планарных образцов. Он удобен для добавления компонентов в разное время во время микроскопических экспериментов. Эту камеру для образцов не следует использовать для эмульсий, которые взбиваются, а не оседают, что затрудняет визуализацию.
    1. Промойте покровное стекло и цилиндр для клонирования стекла водой, этанолом и водой. Сушка на воздухе.
    2. С помощью тонкого слоя 5-минутной эпоксидной смолы приклейте цилиндр для клонирования стекла к покровному стеклу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно приложить силу к баллону, пока эпоксидная смола высыхает, положив на него чистый предмет. Хорошо подойдет небольшая крышка чашки Петри или коробка с крышкой.
  3. Вариант 3: Цилиндр на покровном покрытии с силановым покрытием
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция воспроизводимо приводит к образованию большой плоской области в центре камеры и уменьшению объемного потока образца. Для достижения этой цели была создана гидрофобная область, окруженная гидрофильной областью на покровном листе, в результате чего получается окончательный образец, имеющий актиновую сеть на пассивированной, ограниченной области, где актин закреплен в гидрофильных областях на краю камеры. Эту камеру для образцов не следует использовать для эмульсий, которые взбиваются, а не оседают в буфере, что затрудняет визуализацию.
    1. Подготовьте покровные стекла с силановым покрытием, чтобы сделать их гидрофобными.
      1. Загрузите чистые стеклянные покровные стекла в стеллаж из нержавеющей стали. По желанию предварительно очистите стекло ультразвуком в моющем средстве или этаноле.
      2. В стеклянной посуде для окрашивания разведите триметокси(октил)силан до 2% раствора в изопропаноле.
      3. Погрузите покровные стекла в раствор на 10 минут.
      4. Для полоскания замените раствор водой. Поднимите и снова погрузите стойки покровного стекла шесть раз. Повторите процесс еще четыре раза, обмениваясь водой между ними.
      5. Накройте стеллажи алюминиевой фольгой, чтобы защитить покровные стекла от пыли, и высушите их при температуре 25-30 °C.
    2. Поместите обработанный октилсиланом покровный лист на дно стеклянной чашки Петри или любой другой открытой стеклянной емкости, которая поместится в ультрафиолетовый (УФ)-озоночиститель.
    3. С помощью щипцов поместите квадрат из ПТФЭ размером 2 мм x 2 мм (вырезанный из листа) на покровное стекло, которое будет действовать как маска для последующей обработки ультрафиолетовым озоном.
    4. Обработать покровное стекло УФ-озоном в течение 10 минут. Этот процесс делает стекло гидрофильным в открытых областях, которые не покрыты маской из ПТФЭ.
    5. Осторожно снимите посуду, не потревожив покровную крышку или квадрат из ПТФЭ. Приклейте цилиндр для клонирования стекла к покровному стеклу с помощью 5-минутной эпоксидной смолы. Убедитесь, что цилиндр обхватывает квадрат из ПТФЭ, который можно удалить щипцами после высыхания эпоксидной смолы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Квадрат ПТФЭ может быть повторно использован в будущих экспериментах.

5. Сборка актиновой сети

ПРИМЕЧАНИЕ: Нижеследующее относится к получению образца объемом 50 мкл. Для цилиндрических образцов больший объем может уменьшить воздействие мениска и повысить стабильность образца.

  1. В микроцентрифужную пробирку добавьте 5 μL 10x F буфера, ddH2O необходимо для доведения конечного объема до 50 μL, 1 μL 25 vol% бета-меркаптоэтанола, 1 μL 225 мг/мл глюкозы, 1 μL смеси глюкозооксидазы (135 мг/мл) и каталазы (85 000 единиц/мл), 1 μL 25 мМ АТФ, и 10 мкл 2 мас.% 15 сантипуаз метилцеллюлозы. Пипетку тщательно перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бета-меркаптоэтанол является токсином. Избегайте разливов и загрязнения. Реагенты глюкозооксидаза, каталаза, глюкоза и бета-меркаптоэтанол находятся в образце для создания системы поглощения кислорода. Исходный раствор метилцеллюлозы получают путем перемешивания при 4 °C и можно хранить при 4 °C в течение нескольких недель. Метилцеллюлоза может выпадать в осадок из раствора, и ее следует повторно приготовить, если есть видимый осадок или если скученность актина плохая.
  2. Дополнительно: Добавьте сшивающий белок (0,1-1 сшивающий белок на каждый 1 мономер актина). Пипетка смешать.
    Примечание: Сшивающий белок(ы) также может быть добавлен после полимеризации актина и дан ему возможность связываться в течение 10-20 минут перед добавлением миозина. Это предпочтительно для концентраций сшивающих агентов, которые достаточно высоки для связывания актиновых филаментов - пучки более равномерно и воспроизводимо распределены на границе между поверхностно-активным веществом и водой. Цилиндрическая камера для образцов поддается добавлению сшивающего агента после полимеризации актина.
  3. При желании добавьте фаллоидин (1 фаллоидин на каждые 1-3 актиновых мономера). Пипетка смешать.
  4. В отдельной пробирке смешайте немеченный и меченый актин таким образом, чтобы при добавлении всей смеси актина к образцу объемом 50 мкл общая концентрация составила 2,64 мкм. Используйте соотношение 1 меченый мономер актина на каждые 9 немеченных мономеров актина. Пипетка смешать.
    Примечание: Мономеры актина начнут полимеризоваться при добавлении к раствору образца. Раздельное добавление меченого и немеченного актина может привести к тому, что актин будет иметь пятна темных и флуоресцентных областей по контуру одной нити. Запасы актиновых мономеров смешиваются для обеспечения равномерно маркированных актиновых филаментов. Выделение актина и мечение описаны в31.
  5. Необязательно: Для проведения жидких кристаллов или других экспериментов с использованием коротких актиновых филаментов добавьте каппинговый белок в актиновую смесь из шага 5.4. Точное количество кэппинг-белка зависит от активной фракции белка и длины целевых актиновых филаментов, но, как правило, около 1-10 мололь-% кэппинг-белка (по отношению к актину) достаточно для создания коротких филаментов для экспериментов с жидкокристаллическими кристаллами. Очистка протеина крышки описана впункте 36.
  6. Чтобы начать полимеризацию актина, добавьте смесь актина в F-буферный раствор и смесь пипеток.
  7. Оставьте актин полимеризоваться в микроцентрифужной пробирке на RT, а затем добавьте его в ячейку образца через 10-30 минут.
  8. Дополнительно: При подготовке пробы в баллоне наберите весь раствор в наконечник для дозатора, чтобы он был готов к пипетированию на этапе 7.4 загрузки камеры для отбора проб в баллоне.

6. Дополнительно: Приготовьте эмульсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда бывает удобно готовить эти образцы в эмульсиях, которые обеспечивают ограниченную камеру для образцов. Эмульсии получают с использованием тех же реагентов, что и Chowdhury et al., в результате чего получается масляная непрерывная фаза, содержащая капли водной эмульсии41, опосредованные поверхностно-активным веществом. В присутствии разрушающего агента, такого как метилцеллюлоза, используемого в этом протоколе, образцы актина будут скучены на водной границе этой эмульсии. Для образцов, на которых основан этот протокол, разницы между полимеризацией актина до или после добавления его в эмульсии не наблюдается; Тем не менее, сообщалось, что стадию полимеризации важно учитывать в некоторых экспериментах по инкапсуляции42.

  1. Добавьте 3,5 мкл масла-поверхностно-активного вещества в микроцентрифужную пробирку. Для этого шага используйте прозрачную, светлую или прозрачную микроцентрифужную пробирку.
  2. Не перемешивая, добавьте 5 мкл раствора актина в верхнюю часть слоя масла и поверхностно-активного вещества. Закройте микроцентрифужную пробирку.
  3. Удерживая верхнюю часть пробирки микроцентрифуги, поверните нижний край пробирки, чтобы первоначально создать пену с видимыми эмульсиями. Продолжайте поворачивать тюбик до тех пор, пока на пене не исчезнут различимые признаки при подсветке, указывающие на микроэмульсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении образца в эмульсиях проточная ячейка или другая камера для образца должна быть готова до изготовления образца актина. Камера для образцов стеклянного цилиндра не очень хорошо подходит для эмульсий, так как они будут попадать на воздушный интерфейс, а не осаждаться на поверхность покровного стекла.

7. Загрузите камеру для образцов (Cylinder chambers)

  1. Нанесите 5 μл раствора масла и поверхностно-активного вещества на дно стеклянной камеры цилиндра
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы образцы могут быть изготовлены путем пассивации поверхности с помощью поддерживаемого липидного бислоя 11,29,30.
  2. Наклоните покровное стекло и медленно вращайте, чтобы поверхность покровного стекла и нижний цилиндр были покрыты раствором поверхностно-активного вещества.
  3. Удалите излишки раствора масла и поверхностно-активного вещества с помощью пипетки, чтобы получить как можно более тонкий слой масла, при этом не допуская полного испарения масла, которое является летучим.
  4. Сразу же добавьте в камеру раствор образца с шага 5.7.
  5. Накройте камеру небольшим кусочком ленты из ПТФЭ, чтобы предотвратить испарение и течение.

8. Альтернатива: загрузка камеры для образца (проточной ячейки)

  1. Чтобы подготовиться к загрузке проточной ячейки, смешайте небольшое количество 5-минутной эпоксидной смолы. Обычно достаточно падения с площадью менее 0,5 см2 .
  2. Чтобы поместить образец в проточную ячейку, сначала закачайте 1-3 мкл раствора масляного поверхностно-активного вещества в канал для образца проточной ячейки, чтобы создать небольшую пробку раствора, которая смачивает канал.
  3. Немедленно медленно нанесите пипеткой объем раствора образца или эмульсионной суспензии во вход проточной ячейки, чтобы заполнить канал. Как правило, для канала толщиной около 2 мм объем составляет около 8 мкл. Вход – это сторона, на которую был добавлен раствор масла и поверхностно-активного вещества.
    1. Если объем образца превышает объем проточной ячейки, проведите образец через проточную ячейку, поместив безворсовую салфетку или фильтровальную бумагу на другом конце канала.
    2. Если мениск раствора масла и поверхностно-активного вещества отступил, что привело к образованию воздушного зазора, то перед добавлением образца сначала наклоните проточную ячейку, чтобы удалить воздушный зазор на входе.
  4. При необходимости добавьте дополнительный раствор масла и поверхностно-активного вещества до тех пор, пока воздух не исчезнет в канале, или чтобы протолкнуть образец (особенно для эмульсий) дальше в канал.
  5. Загерметизируйте каждую сторону канала 5-минутной эпоксидной смолой (перемешанной непосредственно перед загрузкой проточной ячейки).

9. Визуализируйте и добавьте миозин

  1. Установите образец на микроскоп и начните покадровую визуализацию актина с помощью объектива с 20-кратным, 40-кратным, 60-кратным или 100-кратным увеличением с масляной или водяной иммерсией, чтобы обеспечить достаточно большую числовую апертуру для визуализации с высоким разрешением. При полимеризации в камере образца дайте полимеризации на ~30 минут или до тех пор, пока не исчезнет видимое удлинение или движение нити.
  2. Необязательно: Добавьте сшивающий агент.
  3. Добавьте миозин с помощью вариантов 1 или 2 ниже.
    1. Добавьте миозин в виде димера, наносимого пипеткой в верхнюю часть образца (смешивание не требуется, так как димер миозина будет диффундировать).
    2. Добавляйте миозин в виде предварительно полимеризованных нитей. Пипетка перемешивает примерно половину от общего объема очень медленно, чтобы не нарушить скопление актина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный метод для получения миозина в дополнение к получению желаемой плотности или размера нити на поверхности покровного стекла может варьироваться для различных архитектур актина и должен быть определен экспериментально.
  4. Запустите интервальную съемку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Широкий спектр актиновых сборок может быть сформирован в модельных системах с использованием очищенных белков в соответствии с общей стратегией, описанной в этих методах, где актин полимеризуется в филаменты в присутствии вспомогательных белков, которые изменяют архитектуру сборки (рис. 1). Когда актин полимеризуется в филаменты без сшивающих агентов или кэппинг-белка, он образует запутанные филаментные сети (рис. 1A). Добавление сшивающего агента к запутанным с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует множество соображений по поводу получения воспроизводимых актиновых сборок. Одним из наиболее важных для получения воспроизводимых и поддающихся анализу данных является поверхность покровного стекла камеры для образца. Белки в образцах актина in vitro, особенно миозин, чрезвычайно липкие и прилипают к необработанным или плохо обработанным стеклянным поверхностям, делая образец непригодным для использования (Рисунок 5A). Мы рассмотрели ста...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Тодда Торенсона, Майка Мюррелла, Дженнифер Росс, Патрика Макколла и других сотрудников лабораторий Гарделя и Ковара (Чикагский университет) за полезные обсуждения при разработке методов. M.A.C. и S.R. были частично поддержаны грантами Колледжа инженерных вычислений и прикладных наук Университета Клемсона, а V.J.A. был поддержан Clemson Biophysics REU в рамках NSF Award #2349368 с финансированием программ DBI и EPSCoR. Эта работа также была частично поддержана программой EPSCoR Национального научного фонда в рамках премии NSF #OIA-1655740, частично и частично программой Clemson Creative Inquiry + Undergraduate Research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,6 мл микроцентрифужная пробиркаFisher Scientific05-408-123
008-Фторповерхностно-активное веществоRAN Biotechnologies00115081361-6525Альтернатива предварительно смешанному раствору
008-FluoroSurtaant в HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50G Предварительносмешанный раствор
2-меркаптоэтанол (β-меркаптоэтанол)Sigma Aldrich63689Номер CAS: 60-24-2
Складской раствор: 25 мМ в воде MilliQ, хранение при температуре 4 °°; C
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этан-сульфоновая кислота (HEPES)Sigma AldrichH3375CAS Номер: 7365-45-9
5 мин Эпоксидная смолаDevcon14250
ActinCytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% чистая скелетная мускулатура кролика
(Чередуется с очищающим)
Актин (меченый родамин)Cytoskeleton, Inc.AR05-AСкелетные мышцы кролика
(Чередовать с очищающим)
Аденозин 5′-трифосфат (АТФ)Sigma AldrichA6419CAS Номер: 34369-07-8
Исходный раствор: 25 мМ в воде MilliQ, хранить при -20 °°; C
Хранить в замороженном виде во избежание гидролиза
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma AldrichC5670CAS Номер: 10043-52-4
Каппинговый белок (мышь)Очищен от гиперэкспрессии в E.coli с помощью HisTag
Стоковый раствор: 20 мМ в буфере каппингового белка при -80 °°; C
Каталаза из печени крупного рогатого скотаSigma AldrichC9322CAS Номер: 9001-05-2
Исходный раствор: 85 ку/мл, хранить аликвотированную глюкозооксидазу при -20°С; C
Крышка СтеклоFisherbrand12544CБоросиликат, #1.5, 24 мм x 40 мм
Fisherbrand not Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270CAS Номер: 50-99-7
Исходный раствор: 225 мг/мл в воде MilliQ, хранить при температуре -20 °°; C
Дитиотрейтол (DTT)Sigma Aldrich3860-OPНомер CAS: 3483-12-3
Исходный раствор: 1 м в воде MilliQ, хранить при -20 °°; C
Двусторонняя лента3M3136
Этилалхехол 200 пруфPHARMCO111000200CAS Номер: 64-17-5
200
(2-аминоэтилевый эфир)-N,N,N,N′-тетрауксусная кислота (EGTA)Sigma AldrichE3889CAS Номер: 67-42-5
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma AldrichE9884Номер CAS: 60-00-4
ГлюкозооксидазаSigma Aldrich345386CAS Номер: 9001-37-0
Исходный раствор: 135 мг/мл в воде MilliQ, хранить аликвотированную с каталазой при -20 °°; C
ГлицеринСигма Олдрич356352MНомер CAS: 56-81-5
ИмидазолФишер Биореагенты BP305-50Номер CAS: 288-32-4
Магния хлорид (MgCl2)Fisher Bioreagents BP214Номер CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
МетилцеллюлозаSigma AldrichM0512Номер CAS: 9004-67-5
Предметные стекла микроскопа 15 сантипуаз
Обычнаяэлектронная микроскопия Науки/Золотая печать63710-05  3 "x1", MilliQ вода толщиной 1 мм
MilliporeCUFBI001Сверхчистая вода
Novec-7500 Engineered Fluid3M7100134816Чередовать с предварительно смешанным раствором
Хлорид калия (KCl)Sigma AldrichP3911CAS Номер: 7447-40-7
Фосфат калия (KPO4)Sigma AldrichP3786CAS Номер: 7758-11-4
Порошок ацетона для скелетных мышц кроликаPel-Freez Biologicals41995-1Используется при очистке актина (чередуйте с покупкой)<бр/> Храните около 30 мМ в буфере актина G при -80 °°; C
Азид натрияSigma Aldrich71289Номер CAS: 26626-22-8
Тетраметилродамин-C6-малеимидAnaSpecAS-81445Номер CAS: 174568-68-4 Используется при очистке актина (чередуется с покупкой)
Храните около 30 мМ в буфере актина G при -80 °C. Используется при маркировке актина (чередуйте с покупкой)
Соляная кислота Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Номер CAS: 1185-53-1
Ультразвуковая ваннаEmerson Branson 
прЭтиленгликоль-бисCPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 486-498 (2015).
  4. Cáceres, R., Abou-Ghali, M., Plastino, J. Reconstituting the actin cytoskeleton at or near surfaces in vitro. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (11), 3006-3014 (2015).
  5. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nat Rev Phys. 1 (4), 249-263 (2019).
  6. Bezanilla, M., Gladfelter, A. S., Kovar, D. R., Lee, W. -L. Cytoskeletal dynamics: a view from the membrane. J Cell Biol. 209 (3), 329-337 (2015).
  7. Alfaro-Aco, R., Petry, S. Building the microtubule cytoskeleton piece by piece. J Biol Chem. 290 (28), 17154-17162 (2015).
  8. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  9. Foster, P. J., Fürthauer, S., Shelley, M. J., Needleman, D. J. Active contraction of microtubule networks. eLife. 4, e10837(2015).
  10. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  11. Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), 2131-2136 (2017).
  12. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nat Phys. 9 (9), 591-597 (2013).
  13. Keber, F. C., et al. Topology and dynamics of active nematic vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  14. Zhang, R., Kumar, N., Ross, J. L., Gardel, M. L., De Pablo, J. J. Interplay of structure, elasticity, and dynamics in actin-based nematic materials. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), E124-E133 (2018).
  15. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  16. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  17. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophys J. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  18. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nat Mater. 10 (6), 462-468 (2011).
  19. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  20. Svitkina, T. M. Actin cell cortex: structure and molecular organization. Trends Cell Biol. 30 (7), 556-565 (2020).
  21. Reymann, A. -C., et al. Actin network architecture can determine myosin motor activity. Science. 336 (6086), 1310-1314 (2012).
  22. Reymann, A. -C., et al. Nucleation geometry governs ordered actin network structures. Nat Mater. 9 (10), 827-832 (2010).
  23. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, e00116(2013).
  24. Liebe, N. L., et al. Bioinspired membrane interfaces: controlling actomyosin architecture and contractility. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (9), 11586-11598 (2023).
  25. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Thick filament length and isoform composition determine self-organized contractile units in actomyosin bundles. Biophys J. 104 (3), 655-665 (2013).
  26. Stachowiak, M. R., et al. Self-organization of myosin II in reconstituted actomyosin bundles. Biophys J. 103 (6), 1265-1274 (2012).
  27. Winkelman, J. D., Bilancia, C. G., Peifer, M., Kovar, D. R. Ena/VASP enabled is a highly processive actin polymerase tailored to self-assemble parallel-bundled F-actin networks with fascin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 4121-4126 (2014).
  28. Stam, S., et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  29. Weirich, K. L., Stam, S., Munro, E., Gardel, M. L. Actin bundle architecture and mechanics regulate myosin II force generation. Biophys J. 120 (10), 1957-1970 (2021).
  30. Scholz, M., Weirich, K. L., Gardel, M. L., Dinner, A. R. Tuning molecular motor transport through cytoskeletal filament network organization. J Soft Mat. 16 (8), 2135-2140 (2020).
  31. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. J Biol Chem. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  32. Li, Y., et al. The F-actin bundler αactinin Ain1 is tailored for ring assembly and constriction during cytokinesis in fission yeast. Mol Biol Cell. 27 (11), 1821-1833 (2016).
  33. Skau, C. T., Kovar, D. R. Fimbrin and tropomyosin competition regulates endocytosis and cytokinesis kinetics in fission yeast. Curr Biol. 20 (16), 1415-1422 (2010).
  34. Vignjevic, D., et al. Role of fascin in filopodial protrusion. J Cell Biol. 174 (6), 863-875 (2006).
  35. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol. 85, 55-71 (1982).
  36. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADPactin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. J Cell Biol. 155 (2), 251-260 (2001).
  37. Craig, S. W., Lancashire, C. L., Cooper, J. A. Preparation of smooth muscle alphaactinin. Methods Enzymol. 85, 316-321 (1982).
  38. Verkhovsky, A. B., Borisy, G. G. Nonsarcomeric mode of myosin II organization in the fibroblast lamellum. J Cell Biol. 123 (3), 637-652 (1993).
  39. LeBel, R. G., Goring, D. A. I. Density, viscosity, refractive index, and hygroscopicity of mixtures of water and dimethyl sulfoxide. J Chem Eng Data. 7 (1), 100-101 (1962).
  40. Lengsfeld, A. M., Lowt, I., Wielandt, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 31, 846(1974).
  41. Chowdhury, M. S., et al. Dendronized fluorosurfactant for highly stable waterinfluorinated oil emulsions with minimal interdroplet transfer of small molecules. Nat Commun. 10 (1), 4546(2019).
  42. Alvarado, J., Mulder, B. M., Koenderink, G. H. Alignment of nematic and bundled semiflexible polymers in cellsized confinement. J Soft Mat. 10 (14), 2354-2364 (2014).
  43. Weirich, K. L., Israelachvili, J. N., Fygenson, D. K. Bilayer edges catalyze supported lipid bilayer formation. Biophys J. 98 (1), 85-92 (2010).
  44. Tan, A. J., et al. Topological chaos in active nematics. Nat Phys. 15 (10), 1033-1039 (2019).
  45. Nasirimarekani, V., Strübing, T., Vilfan, A., Guido, I. Tuning the properties of active microtubule networks by depletion forces. Langmuir. 37 (26), 7919-7927 (2021).
  46. Heymann, E. Studies on solgel transformations: I. the inverse solgel transformation of methylcellulose in water. Trans Faraday Soc. 31, 846(1935).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles