Method Article

Настройка режимов сократимости и деформации активных сборок на основе актина in vitro: от двумерных активных сетей до жидкокристаллических капель

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем методы получения квазидвумерных (2D) запутанных, сшитых и жидкокристаллических актиновых сборок из очищенных белков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Материалы на основе актиновых цитоскелетов широко исследуются в качестве модельных клеточных материалов для выяснения физических механизмов клеточной механики, таких как регуляция формы и производство силы, а также интригующих мягких полимерных материалов. В этом методе мы подробно описываем создание сборок на основе актина in vitro с использованием очищенного белка для исследований флуоресцентной микроскопии. Мы полимеризуем длинные актиновые филаменты в камере для образцов и используем полимерный деплетант для вытеснения филаментов в двумерную (2D)-запутанную сеть на поверхности, пассивированной слоем поверхностно-активного вещества. Добавление филаментов миозина II скелетных мышц в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ) вызывает сокращение актиновой сети. Объединяя актиновые филаменты с помощью сшивающего агента, мы настраиваем сократительную способность сборки, переходя от материала, который изгибается, к материалу, который скользит в микромасштабе. Уменьшая длину актиновых филаментов за счет сополимеризации актина в присутствии кэппинг-белка, мы превращаем материал из 2D-сети в жидкий кристалл. Сшивание дисперсных коротких актиновых филаментов приводит к образованию трехмерных (3D) жидкокристаллических капель.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активные биологические материалы лежат в основе механических процессов в различных физиологических процессах, включая внутриклеточный транспорт, миграцию клеток, регуляцию формы клеток и генерацию биологических сил 1,2,3. Сборки in vitro цитоскелетных систем, построенные из очищенных и сконструированных белковых компонентов, самоорганизующихся в буфере, являются признанным инструментом для характеристики фундаментальных биофизических и биохимических процессов 4,5,6,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Белки и мечение: Для целей настоящего протокола предполагается, что исследователь начинает с запасов очищенных белков, которые флуоресцентно мечаются, когда это целесообразно для исследования флуоресцентной микроскопии. Эти белки могут быть куплены или очищены и флуоресцентно помечены в лаборатории 31,32,33,34,35,36,37. В этом протоколе использовались запасы белков, которые были заморожены в ж....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Широкий спектр актиновых сборок может быть сформирован в модельных системах с использованием очищенных белков в соответствии с общей стратегией, описанной в этих методах, где актин полимеризуется в филаменты в присутствии вспомогательных белков, которые изменяют архитектуру сборки (рис. 1). Когда актин полимеризуется в филаменты без сшивающих агентов или кэппинг-белка, он образует запутанные филаментные сети (рис. 1A). Добавление сшивающего агента к запутанным с.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует множество соображений по поводу получения воспроизводимых актиновых сборок. Одним из наиболее важных для получения воспроизводимых и поддающихся анализу данных является поверхность покровного стекла камеры для образца. Белки в образцах актина in vitro, особенно миозин, чрезвычайно липкие и прилипают к необработанным или плохо обработанным стеклянным поверхностям, делая образец непригодным для использования (Рисунок 5A). Мы рассмотрели ста.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Тодда Торенсона, Майка Мюррелла, Дженнифер Росс, Патрика Макколла и других сотрудников лабораторий Гарделя и Ковара (Чикагский университет) за полезные обсуждения при разработке методов. M.A.C. и S.R. были частично поддержаны грантами Колледжа инженерных вычислений и прикладных наук Университета Клемсона, а V.J.A. был поддержан Clemson Biophysics REU в рамках NSF Award #2349368 с финансированием программ DBI и EPSCoR. Эта работа также была частично поддержана программой EPSCoR Национального научного фонда в рамках премии NSF #OIA-1655740, частично и частично программой Clemson Creative Inquiry + Undergraduate Research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,6 мл микроцентрифужная пробиркаFisher Scientific05-408-123
008-Фторповерхностно-активное веществоRAN Biotechnologies00115081361-6525Альтернатива предварительно смешанному раствору
008-FluoroSurtaant в HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50G Предварительносмешанный раствор
2-меркаптоэтанол (β-меркаптоэтанол)Sigma Aldrich63689Номер CAS: 60-24-2
Складской раствор: 25 мМ в воде MilliQ, хранение при температуре 4 °°; C
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этан-сульфоновая кислота (HEPES)Sigma AldrichH3375CAS Номер: 7365-45-9
5 мин Эпоксидная смолаDevcon14250
ActinCytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% чистая скелетная мускулатура кролика
(Чередуется с очищающим)
Актин (меченый родамин)Cytoskeleton, Inc.AR05-AСкелетные мышцы кролика
(Чередовать с очищающим)
Аденозин 5′-трифосфат (АТФ)Sigma AldrichA6419CAS Номер: 34369-07-8
Исходный раствор: 25 мМ в воде MilliQ, хранить при -20 °°; C
Хранить в замороженном виде во избежание гидролиза
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma AldrichC5670CAS Номер: 10043-52-4
Каппинговый белок (мышь)Очищен от гиперэкспрессии в E.coli с помощью HisTag
Стоковый раствор: 20 мМ в буфере каппингового белка при -80 °°; C
Каталаза из печени крупного рогатого скотаSigma AldrichC9322CAS Номер: 9001-05-2
Исходный раствор: 85 ку/мл, хранить аликвотированную глюкозооксидазу при -20°С; C
Крышка СтеклоFisherbrand12544CБоросиликат, #1.5, 24 мм x 40 мм
Fisherbrand not Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270CAS Номер: 50-99-7
Исходный раствор: 225 мг/мл в воде MilliQ, хранить при температуре -20 °°; C
Дитиотрейтол (DTT)Sigma Aldrich3860-OPНомер CAS: 3483-12-3
Исходный раствор: 1 м в воде MilliQ, хранить при -20 °°; C
Двусторонняя лента3M3136
Этилалхехол 200 пруфPHARMCO111000200CAS Номер: 64-17-5
200
(2-аминоэтилевый эфир)-N,N,N,N′-тетрауксусная кислота (EGTA)Sigma AldrichE3889CAS Номер: 67-42-5
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma AldrichE9884Номер CAS: 60-00-4
ГлюкозооксидазаSigma Aldrich345386CAS Номер: 9001-37-0
Исходный раствор: 135 мг/мл в воде MilliQ, хранить аликвотированную с каталазой при -20 °°; C
ГлицеринСигма Олдрич356352MНомер CAS: 56-81-5
ИмидазолФишер Биореагенты BP305-50Номер CAS: 288-32-4
Магния хлорид (MgCl2)Fisher Bioreagents BP214Номер CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
МетилцеллюлозаSigma AldrichM0512Номер CAS: 9004-67-5
Предметные стекла микроскопа 15 сантипуаз
Обычнаяэлектронная микроскопия Науки/Золотая печать63710-05  3 "x1", MilliQ вода толщиной 1 мм
MilliporeCUFBI001Сверхчистая вода
Novec-7500 Engineered Fluid3M7100134816Чередовать с предварительно смешанным раствором
Хлорид калия (KCl)Sigma AldrichP3911CAS Номер: 7447-40-7
Фосфат калия (KPO4)Sigma AldrichP3786CAS Номер: 7758-11-4
Порошок ацетона для скелетных мышц кроликаPel-Freez Biologicals41995-1Используется при очистке актина (чередуйте с покупкой)<бр/> Храните около 30 мМ в буфере актина G при -80 °°; C
Азид натрияSigma Aldrich71289Номер CAS: 26626-22-8
Тетраметилродамин-C6-малеимидAnaSpecAS-81445Номер CAS: 174568-68-4 Используется при очистке актина (чередуется с покупкой)
Храните около 30 мМ в буфере актина G при -80 °C. Используется при маркировке актина (чередуйте с покупкой)
Соляная кислота Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Номер CAS: 1185-53-1
Ультразвуковая ваннаEmerson Branson 
прЭтиленгликоль-бисCPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles