Задача на мелкую моторику по изучению кинематики суставов в доклинической модели нейродегенеративного заболевания

Краткое содержание

В текущем исследовании описывается тест на мелкую моторику для изучения двигательного дефицита на моделях грызунов, включая крысу TgF344-AD, с использованием машинного обучения.

Аннотация

Двигательная дисфункция является критическим, но часто недооцениваемым компонентом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА) и связанные с ней деменции. Новое исследование показало, что задачи, связанные с мелкой моторикой, зрительно-пространственными способностями и исполнительной функцией у людей, могут иметь потенциал для раннего выявления заболеваний. Тем не менее, мало что известно о точных механизмах, с помощью которых эти задачи предсказывают когнитивное и функциональное снижение, связанное с болезнью Альцгеймера. В рамках текущего метода была создана задача на мелкую моторику, Kinematic Motor Ability Task (KINEMAT), для изучения изменений двигательных способностей при прогрессировании заболевания в доклинических моделях болезни Альцгеймера по сравнению с другими нейродегенеративными заболеваниями и нормальным старением с использованием бесплатного программного обеспечения машинного обучения с открытым исходным кодом. Здесь было установлено доказательство концепции с помощью разработки, тестирования и реализации задачи на мелкую моторику в пилотном исследовании крыс Fisher 344 CDF с двигательными нарушениями, вызванными гармалином, и без них. Дополнительная валидация с помощью модели крыс с болезнью Альцгеймера (TgF344-AD) еще раз продемонстрировала осуществимость модели и чувствительность к задаче. Крысы были обучены протягивать руку через небольшую щель в передней части камеры, чтобы достать сахарную гранулу из одной из трех чаш с разной сложностью. Извлечение гранул оценивалось с использованием одной из трех классификаций: успех (успешное схватывание и поедание сахарной гранулы), падение (хватает, но роняет угощение при захвате) или неудача (дотягивание, при котором гранула не достается, или гранулы выбиваются из миски при попытке схватить). Наблюдались значительные различия в моторных способностях между контрольной группой и крысами, получавшими гармалин, о чем свидетельствовало уменьшение общего охвата и повышенная вариабельность позы лапы. Крысы TgF344-AD также показали снижение общего охвата, а также снижение успеха во всех чашах. Подтверждая, что это задача мелкой моторики у грызунов, у него есть потенциал для изучения нормального старения и доклинических моделей нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, по мере появления патологии и симптомов с течением времени.

Введение

Было показано, что двигательная функция нарушена у людей с деменцией из-за болезни Альцгеймера (БА) или других подтипов (например, деменция с тельцами Леви). Сила хвата и скорость ходьбы позволяют различать^{пожилых людей с} когнитивными нарушениями и без ^них1,2, но не обязательно дифференцируют различные подтипы деменции (т.е. низкую специфичность)^1,2. Таким образом, по-прежнему существует потребность в новых диагностических инструментах для ранней стадии деменции, возможно, в сочетании с машинным обучением, для оценки сложных моделей и взаимосвязей между поведением^{и состоянием болезни.} Животные модели ценны для изучения прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, чтобы дать представление о раннем начале заболевания, поведенческих коррелятах и интеграции машинного обучения в аналитические конвейеры для различения тяжести и проявления ^5,6,7.

Новые поведенческие методы у людей выявили задачи, которые задействуют мелкую моторику наряду с когнитивной обработкой, такие как зрительно-пространственные способности и исполнительные функции ^8,9,10. Например, функциональное задание на верхние конечности может отслеживать паттерны нейродегенерации и отличать легкие когнитивные нарушения (ЛКН) от БА. В этой задаче люди перемещают сырую фасоль (по две за раз) из центральной домашней чашки в целевую чашку с помощью ложки. Фаза задачи, в которой бобы добываются ложкой, демонстрирует более сильную связь с познанием (в частности, зрительно-пространственной памятью), чем фаза, в которой бобы транспортируются к целевой чашке^11,12. Когда ложка входит в чашку, она может возмущать бобы в чашке, а это означает, что движения участника могут усложнить задачу. Кроме того, по мере того, как испытание продвигается и количество зерен в домашней чашке уменьшается, задача становится более сложной (т.е. время на получение зерен ложкой увеличивается)¹³. Было показано, что эта задача коррелирует со специфической патологией болезни Альцгеймера (амилоидом)^9,14 и нейродегенерацией (атрофией гиппокампа)^10,15, предполагая, что ее выполнение может зависеть от нейронных схем и поведенческих процессов, которые затрагиваются на ранних стадиях заболевания. Известно, что инициация движения, планирование, выполнение и коррекция движений контролируются разнообразной сетью, проходящей через мозг, включая моторную кору, с телами верхних мотонейронов, расположенных в коре головного мозга, синапсирующими на нижних моторных нейронах спинного мозга¹⁶. Эти нижние двигательные нейроны напрямую взаимодействуют с мышцами для контроля движений в нервно-мышечном соединении. Восходящие пути передают сенсорную информацию от периферии к спинному мозгу, в то время как нисходящие пути внутри мозга передают направленную информацию о том, как и куда двигаться обратно к мышцам^17,18. Понимание того, как эти пути избирательно влияют на патологию болезни Альцгеймера, имеет решающее значение для понимания прогрессирования заболевания, особенно с учетом того, что генетические модели животных, включая мышь 3xTg-AD и крысу TgF344-AD, ранее использовались для изучения того, как гены AD влияют на локомоцию, координацию и другие двигательные нарушения 19,20,21. Как правило, эти задачи сосредоточены на грубых моторных нарушениях, связанных с движением всего тела, но двигательные дефициты у людей гораздо более вариабельны, что может быть трудно выявить у грызунов^. Поэтому необходимы новые задачи по преодолению разрыва между человеческими и животными моделями, чтобы отразить эту изменчивость.

Одной из областей мозга, которая обычно участвует в двигательных нарушениях и треморе, является мозжечок²³. Мозжечок является важным регулятором точных и скоординированных движений и действует как процессор сенсорной информации для обеспечения обратной связи по нисходящим путям для коррекции и адаптации этого произвольного движения ^24,25. Важно отметить, что мозжечковая атрофия была распознана у людей с БА, но, в отличие от других областей, таких как гиппокамп, повышенное отложение амилоида в мозжечке не коррелирует с повышенной^{атрофией26}. В то время как прогрессирование патологии БА в мозжечке отличается, существуют мультисинаптические двунаправленные связи между мозжечком и гиппокампом, которые, вероятно, нарушены в 27,28,29 гг. Альцгеймера. Примечательно, что существуют функциональные связи между мозжечком и гиппокампом, поскольку было задокументировано, что дефицит памяти возникает после резекции опухоли мозжечка 30,31,32,33,34,35,36,37. У грызунов клетки места гиппокампа нарушаются с мозжечковым возмущением³⁸. Эти перекрывающиеся дефициты памяти, общительности и моторного контроля подчеркивают важность выявления потенциальных ранних изменений в моторных путях, которые происходят до снижения когнитивных способностей 30,31,38,39. С внедрением задач на мелкую моторику в ранних исследованиях болезни Альцгеймера мы можем начать менять традиционное понимание болезни Альцгеймера как просто когнитивного расстройства и перенаправить диагностические усилия на ранние двигательные изменения, которые могут предсказывать прогрессирование заболевания и могут быть более различимы между когнитивно ослабленными и здоровыми стареющими людьми.

Чтобы понять, как мелкая моторика может свидетельствовать об изменениях в структуре мозга, была создана и протестирована описанная выше версия человеческой задачи на грызуне. Эта задача на грызунов была названа KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task), и она отличается от предыдущих задач, требующих извлечения одной гранулы с пьедестала или лестницы, и более упрощенного подсчета очков в результате последовательного размещения гранул на всех этапах задачи 40,41,42,43,44,45,46^{. 47,48}. Эта задача на мелкую моторику включает в себя новые методы подсчета очков, чаши с различными уровнями сложности и самовозмущающиеся функции, имитирующие человеческий аналог, с движением дробины и последующими корректировками стратегии участника, занимающими центральное место в дизайне. В этой задаче используются инструменты машинного обучения, Social LEAP Estimates Animal Pose (SLEAP) и keypoint-MoSeq^49,50, позволяющие объективно и количественно измерять мелкую моторику и поведение при достижении цели. В то время как другие примечательные вычислительные модели были разработаны для задач квалифицированного досягаемости у грызунов ^44,45,51, keypoint-MoSeq устраняет шум, чтобы обеспечить точную количественную оценку движений и хватательных поз⁵⁰. Выполнение задач и стратегия моторного обучения были реконструированы с помощью высокопроизводительной камеры машинного зрения у типичных и моторно возмущенных крыс с использованием Harmaline⁵². Гармалин гиперактивирует нижнее ядро оливы и нарушает функцию мозжечка через глутаматергические лазающие волокна ^53,54. Кроме того, была изучена мелкая моторика у подгруппы крыс TgF344-AD. Таким образом, ожидалось, что задача на мелкую моторику обнаружит измеримые нарушения у крыс, получавших гармалин, и крыс TgF344-AD по сравнению с их типичными собратьями в качестве доказательства концепции. Этот протокол описывает построение задачи на мелкую моторику, обучение и тестирование животных, а также количественную оценку поведения при достижении с помощью SLEAP и keypoint-MoSeq.

Протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Аризона.

1. Проектирование и строительство камеры

1. Подготовьте прозрачные акриловые панели. Схемы коробки расположены по адресу https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Вырежьте прозрачные акриловые панели до следующих размеров (толщина всех панелей 1 см):
   1. Вырежьте две боковые панели: 26 см × 22 см.
   2. Вырежьте верхнюю панель: 27 см × 12 см.
   3. Вырежьте первую нижнюю панель: 26 см х 10 см
   4. Вырежьте вторую нижнюю панель: 26 см х 11 см
   5. Разрез лицевой панели: 20 см × 11 см.
   6. Вырежьте заднюю панель: 20 см х 12 см
   7. Вырежьте прорезь для лицевой панели (140 мм x 12 мм). Расположите прорезь по центру, выровняв его нижний край по нижней части панели.
   8. Вырежьте внутреннюю канавку: 1 см. На внутренних краях боковых панелей создайте углубление или углубление, чтобы передняя панель могла надежно вставляться и выдвигаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если функция скольжения не требуется, передняя панель может быть навсегда приклеена для упрощения конструкции.
   9. Просверлите равномерно расположенные отверстия (5 мм в диаметре) во второй нижней панели, чтобы при падении гранулы могли провалиться. Расположите отверстия на расстоянии 1 см друг от друга в виде сетки.
2. Соберите камеру с помощью клея (рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте прочный, прозрачный клей, специально предназначенный для акриловых материалов.
   1. Боковые панели: Нанесите непрерывную линию клея по краям нижней панели. Расположите боковые панели вертикально и плотно прижмите. Дайте клею застыть в соответствии с инструкциями по изготовлению.
   2. Задняя панель: Нанесите клей на задние края боковых и нижних панелей. Расположите заднюю панель и прижмите ее на место.
   3. Верхняя панель: Нанесите клей на верхние края боковой и задней панелей. Расположите верхнюю панель и сильно нажмите.
   4. Передняя панель: Осторожно вставьте переднюю панель в пазы на боковых панелях, обеспечивая плотное, но гладкое прилегание, или нанесите клей по краям передней панели и закрепите его на боковой, верхней и нижней панелях.
      1. Проверьте движение панели и убедитесь, что она точно выровнена по остальной части камеры.
3. Настройка освещения
   1. Расположите инфракрасный (ИК) свет на противоположном конце испытательной камеры, направленный в сторону камеры. Положите лист белой строительной бумаги на верхнюю часть камеры, чтобы отражать свет вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Освещение имеет решающее значение для правильного отслеживания, и все записи должны производиться под ИК-светом в темной комнате.
4. Подготовьте тренировочную миску.
   1. Изготовьте тренировочную чашу с радиусом 31 мм и удлинением 32 мм с помощью 3D-принтера. STL-файл доступен на https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask (Рисунок 1B: вверху)
   2. Прикрепите тренировочную чашу к дну камеры прямо перед прорезью. Расположите миску так, чтобы ее верхний край находился примерно над уровнем глаз крысы в камере, используя поддерживающую подставку, например, деревянный брусок.
5. Подготовьте тестовые чаши (Рисунок 1B: середина и дно).
   1. Распечатайте миски с помощью предоставленных файлов STL. Предлагаются две различные конструкции чаши: «Plain-Less» и «Plinko». (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Проверьте точность размеров и долговечность (размеры: 50 мм в глубину и 40 мм в ширину).

2. Компьютерное и фотоаппаратное обеспечение

1. Используйте штатив для надежного крепления камеры.
2. Расположите камеру примерно в 15-20 см от передней панели камеры.
   1. Отрегулируйте высоту и угол наклона штатива так, чтобы камера снимала изометрический вид под углом 45° как на прорезь, так и на чашу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что поле зрения камеры охватывает крысиную лапу и полный радиус действия, слот и тренировочную или испытательную чашу. При необходимости тестируйте различные углы и расстояния для достижения оптимальной видимости.
3. Загрузите программное обеспечение для сопряжения с камерой для записи поведенческих операций (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) и откройте программное обеспечение, чтобы использовать камеру для записи поведения.
   1. Используйте следующие настройки камеры: режим съемки: непрерывный, частота кадров: 216 Гц, режим экспозиции: по времени, автоматическая экспозиция: выкл., время экспозиции: 4430 μс, усиление авто: выкл., усиление: 16,85 дБ, гамма: 0,8.
   2. Настройки записи следующие: тип файла H264, 5 миллионов (5 000 000) битрейт.
   3. Чтобы записывать в течение 10 минут, введите 130 000 кадров и используйте потоковый режим для сохранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать выделенную машину с минимум 16 ГБ ОЗУ и внутренним твердотельным жестким диском емкостью 1 ТБ для хранения данных.

Рисунок 1: Схема задачи на мелкую моторику. (А) Мультяшное изображение задачи на мелкую моторику, в которой крыса протягивает руку через щель, чтобы достать сахарную гранулу. Достижения записываются для анализа машинного обучения. Используются три отдельные чаши: (внизу слева) тренировочная чаша, (внизу посередине) Plain/Less и (внизу справа) чаша Plinko с препятствиями, обведенными красным цветом. (B) Схемы каждой конструкции чаши, включая (верхнюю) тренировочную чашу, (среднюю) простую/меньшую чашу и (нижнюю) чашу Plinko. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Подготовка животных

1. Сопряжение (как минимум) с крысами Fisher 344 CDF (самцы и самки, в возрасте >3 месяцев) в обратном цикле свет/темнота, чтобы можно было провести тестирование, когда животные наиболее активны.
2. Взвесьте всех грызунов за 1 неделю до начала привыкания и обеспечьте ~30 г корма для грызуна массой свыше 300 г и ~15 г для грызуна 100-300 г для поддержания животных на 90% массы тела.
   1. Ежедневно взвешивайте крыс и корректируйте корм соответственно, уменьшая количество предоставляемой пищи на 1-2 г в день до тех пор, пока грызун не достигнет 90% массы тела. Ежедневное обращение с животными также поможет приучить их к экспериментатору.
   2. На протяжении всего привыкания и тестирования продолжайте эту процедуру, корректируя корм на +/- 0,5 г, когда вес опускается ниже или превышает пороговое значение.
   3. Во время тестирования взвешивайте животных до начала выполнения задачи, а затем выдавайте ей корм сразу после возвращения в клетку после выполнения задачи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любая внезапная потеря веса (>15%) в течение 1-2 дней может сигнализировать о основной проблеме, и следует проконсультироваться с ветеринаром.

4. Привыкание (2 дня)

1. Включите ИК-подсветку, камеру и компьютер.
2. Поместите тренировочную чашу с гранулами в отверстие для отверстия, следя за тем, чтобы кончик чаши немного выступал внутрь аппарата (первоначально примерно на 2 см).
3. Перенесите клетки в помещение для тестирования и дайте крысам акклиматизироваться в течение 5 минут.
4. День 1: Добавьте в камеру крыс, содержащихся в парах, и дайте им исследовать в течение 20 минут. Поместите 3-5 сахарных гранул в домашнюю клетку после тестирования, чтобы крысы могли ознакомиться с гранулами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер гранул 45 мг позволяет извлекать одну гранулу.
5. Очистите камеру дезинфицирующей салфеткой между крысами. В конце дня опрыскайте этанолом для дезинфекции.
6. День 2: Приучайте грызунов индивидуально к аппарату по той же методике (20 мин). Если грызуны кажутся напуганными или избегают передней части аппарата и чаши, продолжайте приучать их до тех пор, пока это поведение не исчезнет. Продолжайте давать гранулы в качестве лакомства в домашней клетке (3-5 гранул).
   1. Чтобы облегчить знакомство и приближение к чаше, постепенно перемещайте удлиненную трубку вглубь затвора аппарата на протяжении всего привыкания, перемещая кончик на 0,5 см ближе к грызуну, чтобы облегчить дотягивание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Привыкание, тестирование и обучение должны проводиться в одном и том же месте при красном освещении, чтобы исключить воздействие нового окружения.

5. Формовка (10 дней)

1. Включите ИК-подсветку, камеру и компьютер.
2. Перенесите клетки в помещение и дайте крысам акклиматизироваться в течение 5 минут.
3. Используя тренировочную чашу, обеспечьте 1-5 гранул вдоль удлинителя, при этом удлинитель должен быть полностью помещен внутрь снаряда в первый день. Дрессируйте животных за 10-минутные сеансы. Запись во время формовки не является обязательной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы познакомить грызунов с гранулами, важно предусмотреть несколько сахарных гранул в самом устройстве, чтобы уменьшить отвращение к гранулам в чаше. Грызуны, скорее всего, будут есть гранулы внутри устройства, потому что их легко достать, и они узнают эти гранулы в чаше. Важно приучить их смотреть в правильном направлении снаряда и привыкнуть к прикосновению к чаше.
4. В последующие дни тренировок начинайте убирать удлинитель чаши из снаряда. Для этого грызунам придется приближаться к отверстию аппарата спереди и стимулировать взаимодействие с удлинителем, находящимся прямо за пределами аппарата.
   1. Конструкция позволяет обеспечить конкретное размещение пеллет. Например, поместите гранулы в конец миски, ближайший к грызуну, и постепенно отодвиньтесь от него, чтобы побудить грызуна вытянуть руку из устройства.
5. По мере того, как грызуны привыкают брать гранулы с края удлинителей, даже если они только ртом, начинайте вводить гранулы через пинцет, чтобы стимулировать поведение при дотягивании.
   1. Держите одну гранулу в пинцете прямо за пределами аппарата, позволяя грызунам просто прикоснуться к пинцету. Немедленно вознаграждайте такое поведение, чтобы стимулировать дальнейшее достижение.
   2. По мере того, как грызуны будут чувствовать себя более комфортно при прикосновении к пинцету, позвольте им отойти немного дальше от устройства, чтобы коснуться или схватить гранулу, держа пинцет чуть дальше от отверстия устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите заметки обо всем поведении животных, в частности, если животные боятся миски или не дотягиваются до нее. Этим животным могут потребоваться дополнительные дни формообразования.
6. После того, как грызуны достигают непрерывно и самостоятельно в течение как минимум 3 дней (рисунок 2А), переходите к равнинной миске до тех пор, пока не установится поведение достижения (непрерывное достижение в течение 3 дней с не менее чем 10 независимыми дотягиваниями в день).
   1. При введении грызунов в обычную миску убедитесь, что миска максимально заполнена гранулами, чтобы грызуны могли визуализировать гранулы за бортиком миски.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе может потребоваться поощрение досягаемости с помощью пинцета.
7. Очистите камеру дезинфицирующей салфеткой между крысами. В конце дня опрыскайте этанолом для дезинфекции.

6. Подготовьтесь к тестированию:

1. Тестирование проводится в течение 9 дней (рисунок 2A), при этом каждый грызун выполняет 3 испытания в каждой миске, причем каждое 10-минутное испытание происходит в течение нескольких дней подряд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование лучше всего проводить утром.
2. В каждый день тестирования взвешивайте крыс. После завершения теста крыс оставляют в домашних клетках на 30-60 минут перед тестированием, так как взвешивание может вызвать стресс и подавить достижение результатов.
3. Включаем компьютер и настраиваем чашу. Подключите камеру и включите свет. Откройте программное обеспечение для записи и отрегулируйте настройки камеры, как описано в разделе 2 протокола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется записывать не менее 200 кадров в секунду (кадров в секунду) для захвата всех движений лап.
4. Выровняйте чашу в кадре камеры и визуализируйте ее в программном обеспечении для записи, нажав кнопку воспроизведения. Поместите чашу заподлицо с аппаратом и камерой под углом 45° к боковой стороне чаши.
   1. Перемещайте камеру, чтобы запечатлеть дотягивание прямо в лоб, чтобы изучить движение отдельных пальцев и ладони, а также движение, связанное с высотой ладони над чашей во время дотягивания.
   2. Расположите камеру непосредственно перпендикулярно чаше для фиксации движений рук и кистей рук к чаше и из нее, но не для фиксации расположения пальцев или подробностей о цепочном поведении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что для захвата движения в плоскостях x, y и z рекомендуется использовать угол 45°, другие конфигурации могут более легко захватывать информацию для желаемого исследования.

7. Тестирование (9 дней)

1. Поместите крыс в комнату для приучения на 1 час.
2. Первую миску поставьте на платформу чаши, закрепив ее стоматологическим воском. Убедитесь, что передняя часть чаши находится заподлицо и центрирована с отверстием аппарата.
3. Назовите видеофайл в Spinview, указав идентификационный номер крысы, дату записи и время записи.
4. Поместите крысу в аппарат. Закройте крышку и положите сверху белый картон, чтобы отразить свет.
5. На этом этапе дважды проверьте угол камеры, чтобы убедиться, что запечатлена соответствующая сцена, и отрегулируйте чашу, если она не расположена по центру.
6. Насыпьте нужное количество гранул в чашу и нажмите «Начать запись».
   День 1-3 Обычная чаша: ~100 гранул
   День 4-6 Меньше чаши: ~50 гранул
   День 7-9 Чаша Плинко: ~50 пеллет
7. Оставайтесь в комнате на протяжении всего тестирования, чтобы постоянно следить за крысой, делать заметки о достижении производительности и поведении и добавлять гранулы по мере необходимости для поддержания нужного количества.
   1. Для Plain bowl убедитесь, что грызуны могут видеть гранулы через край чаши и что гранулы всегда можно получить (т.е. заполняя чашу на протяжении всего испытания, по мере уменьшения количества гранул гранулы наслаиваются слоями).
   2. Для миски Less: убедитесь, что гранулы не сложены друг на друга, а между гранулами есть место, позволяющее им разлететься, когда крыса попытается дотянуться.
   3. Для чаши Plinko: убедитесь, что гранул достаточно, чтобы они были доступны между препятствиями.
8. Верните животное в домашнюю клетку и обеспечьте его положенным кормом. Очистите камеру дезинфицирующей салфеткой между крысами.
9. В конце дня распылите этанол для дезинфекции всей камеры, чтобы подготовиться к следующему дню.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При тестировании как самцов, так и самок грызунов, обязательно уравновесьте полы: некоторые самки и некоторые самцы были протестированы ранее утром, а аналогичная смесь была протестирована позже. Соблюдайте порядок тестеров на протяжении всего эксперимента.

Рисунок 2: Обучение и тестирование крыс, выполняющих задачу на мелкую моторику. (А) Хронология эксперимента. Крыс приучали к аппарату в течение двух дней, а затем в течение 10 дней проводили процедуры по приданию формы. Животных проверяли на мелкую моторику во всех трех чашах в течение трех дней в каждой миске. Затем животным вводили гармалин и повторно тестировали каждую чашу в течение трех дней. (B) Крысы (n = 6) подвергались двум разным мискам (тренировочной чаше и равнине) во время процедур формообразования, и тип чаши был изменен на 5-й день для улучшения охвата. Наблюдалось значительное увеличение формообразования в течение 10 дней для достижения критериев (F(9, 45) = 13,5, p < 0,001). Серая полоса обозначает переключение между оригинальной и текущей тренировочной чашей с удлиненной трубкой. (C) При тестировании всех трех чаш наблюдалась значительная разница в общем охвате за 9 дней тестирования (F(8, 32) = 3,74, p = 0,003). Примечание: Крыса 2 была удалена после придания формы. Чаша Плинко привела к значительным различиям между Less (p = 0,001) и Plain bowl (p = 0,027). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

8. Моделирование нарушения мелкой моторики с помощью Harmaline

Примечание: Для определения влияния двигательных нарушений на мелкую моторику и производительность в мелкой моторике, крысам вводили гармалин (10 мг/кг), β-карболиновый алкалоид, который является обратимым ингибитором моноаминоксидазы-А и нацелен на низшую оливу 52,55,56,57. Гармалин на моделях грызунов влияет на осанку и равновесие, ограничивает тонкую моторную координацию и вызывает двигательные нарушения в верхних конечностях.

1. Взвесьте крыс, чтобы рассчитать правильную дозу гармалина.
2. Дайте крысам привыкнуть к испытательному залу в течение 1 ч.
3. Включаем компьютер и настраиваем чашу. Подключите камеру и включите свет. Откройте программное обеспечение для записи и отрегулируйте настройки камеры, как описано в разделе 2 протокола.
4. Вводите грызунам Гармалин (10 мг/кг, в/ч).
5. Через 15 минут вылейте гранулы в подходящую миску и начните запись. Тестируйте крысу на каждой миске в течение 3 дней.
   День 1 Обычная чаша: ~100 гранул
   День 2 Меньше миски: ~50 гранул
   День 3 Плинко боул: ~50 пеллет
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте место инъекции на предмет аномалий, включая раздражение кожи, болезненное поведение, атаксию, гипотермию и изменения осанки в течение 3 часов после инъекции. После 3-часовых окон продолжайте следить за любыми изменениями в поведении, включая задержки при приеме пищи или питья, а также любой остаточный тремор.

9. Анализ видео с помощью машинного обучения

ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора данных и видеозаписи достижения были подсчитаны вручную и оценены следующим образом: Успех (извлечение и употребление гранулы), Выпадение (получение гранулы, но выпадение гранулы перед употреблением), Неудача (невозможность вернуть гранулу). Эти данные, полученные вручную, были использованы в качестве достоверных данных для анализа машинного обучения.

1. С помощью пользовательского кода Python в https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask были проведены сравнения между животными, получавшими исходный уровень, и животными, получавшими гармалин, чтобы определить изменения в показателях охвата (рис. 3, рис. 4, рис. 5 и рис. 6).
2. Для анализа совместной кинематики поведения при дотягивании, включая траекторию досягаемости, конформацию и положение лапы, а также изменения в стратегии досягаемости при различных типах чаш, используйте бесплатное программное обеспечение машинного обучения с открытым исходным кодом Social LEAP Estimates Animal Pose (SLEAP) (см. https://sleap.ai/ для более подробного объяснения и пошагового руководства по использованию программы с открытым исходным кодом⁴⁹).
   ПРИМЕЧАНИЕ: SLEAP⁴⁹ можно скачать по адресу https://github.com/talmolab/sleap.
3. Откройте новый проект и добавьте 3 видео с задачей на достижение цели.
4. Создайте скелет, состоящий из 15 узлов: 1 плеча, 1 запястья, 1 ладонного центра, 4 основания, 4 костяшек пальцев и 4 пальцевых узлов (скачать скелет можно на https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask).
5. Добавьте ребра между узлами так, чтобы верхняя часть руки соединялась с запястьем, затем с центром ладони. От центра ладони соедините узлы-основания, костяшки пальцев и узлы кончиков пальцев так, чтобы центр ладони всегда был начальным узлом (рис. 7A).
6. Пометьте не менее 50 кадров перед тренировкой по бегу. Здесь можно обучить новую модель или использовать модели для centered и centroid на github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Как только модель будет обучена, откройте новое видео и запустите вывод: trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count:1, tracking.target_instance_count:1, tracking.pre_cull_to_target:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вывод может быть запущен как bash-скрипт в локальном кластере. Записанные видео могут потребовать корректуры (инструкции по корректуре см. в https://sleap.ai/).
8. Для дальнейшего анализа узлов и понимания различий между группами в совместной кинематике используйте бесплатную ключевую точку с открытым исходным кодом — MoSeq⁵⁰ (подробности о загрузке и инструкции по использованию см. в https://github.com/dattalab/keypoint-moseq).
9. Создание дискретных слогов поведения с помощью keypoint-MoSeq⁵⁰ (рисунок 7B). Выполните дополнительный анализ, чтобы сопоставить частоту переходов, вероятность и изменения частоты переходов между условиями Harmaline и Baseline для каждой миски (рис. 7C, D). Код анализа см. в https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.

Рисунок 3: Изменения в досягаемости чаш и обработке. (A) Для исходного тестирования (n = 5) во всех 3 чашах наблюдалась значительная разница в общем охвате (H(df) = 8,48, p = 0,014, Краскал-Уоллис), причем большее количество достиганий наблюдалось при типе чаши Плинко (p = 0,011, апостериорный тест Данна с поправкой Бонферрони). (B) Возмущение гармалином (n = 5) не приводило к различиям между типами чаш. Ошибки отображаются как S.E.M. *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Сравнение производительности в разных условиях и по типам чаш .(A) Во время исходного тестирования наблюдалась значительная разница в чаше (F(2) = 5,78, p = 0,007) и исходах (F(2) = 3,92, p = 0,029). Попытки досягаемости увеличивались по мере усложнения типа чаши, хотя досягаемость уменьшалась от базового уровня во всех чашах в состоянии гармалина. (B) Не было обнаружено различий у крыс, получавших гармалин, при подсчете досягаемости в мисках. (C) Наблюдалась значительная разница в исходах (F(2) = 2,07, p < 0,001) во время базового тестирования при анализе по производительности. (D) Не было обнаружено различий у крыс, получавших гармалин, в отношении чаши или результатов. Ошибки отображаются как S.E.M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сравнение исходного уровня и условий с гармалином. (A) Не было различий в успешности работы между условиями. (B) При подсчете неудач наблюдалась значительная разница между исходными условиями и условиями Гармалина (H(df) = 4,85, p = 0,028, Краскала-Уоллиса) со значительным эффектом, обнаруженным в условиях Гармалина (p = 0,028, апостериорный критерий Данна с поправкой Бонферрони). Ошибки отображаются как S.E.M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Показатели обучения и достижения. (А) У животных, получавших гармалин, наблюдалась задержка в обучении по сравнению с исходным уровнем (t-stat = 2,833, p = 0,022). (B) Для общего количества попаданий в минуту наблюдалось значимое взаимодействие между чашей (меньше) и условием (гармалином) (F(1,5) = 9,83, p = 0,002, смешанная линейная модель) и чашей (плинко) и условием (гармалином) (F(1,5) = 22,67, p < 0,001, смешанная линейная модель). Гармалин уменьшил общее количество охватов в минуту для всех типов чаш (меньше: p = 0,01, Plinko: p < 0,001) по сравнению с исходным уровнем. Ошибки отображаются как S.E.M. *p < 0,05, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Машинное обучение выявляет уникальные позы и стратегию выполнения задач. (A) Расположение узлов на лапе крысы, помеченное с помощью SLEAP. (B) Примеры слогов, идентифицированных по ключевому точке-MoSeq во время досягаемости. (C) Матрица частот перехода биграмм между последовательными слогами. Вероятности переходов нормализуются на общее количество биграмм. (D) График переходов, сравнивающий различия в переходах по слогам между Harmaline и Baseline. Узлы графа представляют собой слоги, а ребра — переходы между ними. Более выступающие края указывают на слоговые переходы с более высокими частотами. Красные соединения указывают на переход вверх, в то время как синий сигнал указывает на переход вниз у животных, получавших гармалин. Красные круги указывают на повышенное использование, в то время как синий круг указывает на пониженное использование указанного слога у животных, получавших гармалин. Исключались пары слогов с частотой менее 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

После того, как крысы достигали 90% массы тела по ограничению корма, их приучали к камере в течение 2 дней, затем в течение 1-2 недель проходили процедуры по коррекции формы. Количество успешных, пропущенных и неудачных попыток оценивалось обученным наблюдателем, слепым к каждому условию. В течение 9 дней (исходный уровень) крыс проверяли мелкую моторику на 3 различных конфигурациях чаш (Plain, Less и Plinko). Затем тем же крысам (n = 5 в группе, 1 удалена после тренировки формы чаши из-...

Обсуждение

Задачи досягаемости грызунов обычно ограничены одиночными гранулами и не включают в себя препятствий или самобеспокойных особенностей, которые являются обычными проблемами для пациентов с нейродегенеративной патологией. Представленный здесь метод, использующий как переосмысленную задачу достижения дробины, так и машинное обучение, может обнаруживать как координацию, так и стратегию посредством анализа особенностей позы и переходов, в дополнение к индивидуальным движениям пальцев. Созданн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Материалы для 3D-печати	Amazon (увертюра)	B07PGY2JP1	Филамент PLA 1,75 мм PLA 3D-принтер, точность размеров +/- 0,03 мм
Камера	Edmond Optics	BFS-U3-13Y3M-C	1,3 МП, моно, 170 FPS, ON Semi PYTHON 1300 x2
Кабели камер	Edmond Optics	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 м, кабель Type-A до Micro-B (фиксирующий)
Объектив камеры	Лаборатории Тора	MVL5WA	4,5 мм EFL, f/1,4, объектив машинного зрения формата 1/2"
Соединение камеры с штатив	Edmond Optics	88-210	Подключение камеры к штатива
Чистящие салфетки	Amazon (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	AF3 Поверхностный дезинфицирующий очиститель Салфетка Canister Мягкий аромат 160 Ct P13872
Компьютер	Dell	Точность	Intel Core i7-13700 @ 2.1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
ИК-свет	Amazon (Serlium)	B0BJFDBT44	Камера с ИК-светом 48 светодиодов, ИК-светильники, водонепроницаемые инфракрасные лампы ночного видения, светильник для безопасности, камера видеонаблюдения и nbsp;
Клей для панелей	Amazon (Сдинтар)	B0B1DLRPNZ	Стеклянный клей
Плексиглас	Amazon (TOOLINHAND  США)	B0BRJ1L8TR	12 и раз; 12" прозрачные литые акриловые и плексигласные листы — прозрачные 1/8" Толстая (3 мм)
Python	Фонд программного обеспечения Python	Python 3.7
Спинвью	Teledyne Technologies	Версия 3.1.0.79
Сахарные гранулы (45 мг)	Bioserv	F0023	45 мг, без вкуса 50 000/коробку; Состав: сахароза, декстроза, магний стеарат, кальций-силикат, минеральное масло
Штатив	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Гибкий настольный веб-камерный штатив Amazon
Пинцет	Тонкие научные инструменты	11064-07	Ирисовые щипцы
Воск	Amazon (ортомеханика)	B00FKDC0UU	Настоящий ортовакс