Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культивирование первичных клеток Мюллера сетчатки у крыс Sprague-Dawley (SD)

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68129

⸱

17 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен подробный протокол выделения первичных клеток Мюллера сетчатки от неонатальных крыс Спрага-Доули (SD). Процедура включает в себя энуклеацию глазных яблок, диссекцию ткани сетчатки, экстракцию и идентификацию клеток, а также ключевые соображения для последующей клеточной культуры.

Аннотация

Клетки Мюллера (RMC) сетчатки играют решающую роль в обеспечении структурной поддержки и регулировании различных функций сетчатки. Являясь основным компонентом микроокружения сетчатки, РМК выполняют несколько жизненно важных функций. Благодаря многочисленным ионным каналам, лигандам, рецепторам, трансмембранным транспортерам и ферментным системам эти клетки способствуют секреции нейротрансмиттеров и трофических факторов, регулируют метаболизм сетчатки и поддерживают водно-ионный гомеостаз. Примечательно, что RMC недавно были определены как значительный источник эндогенных регенеративных стволовых клеток сетчатки, предлагающий новые терапевтические мишени для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки. Таким образом, изучение РМК имеет важное значение для понимания патологических механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчатки. В этом исследовании систематически устанавливается стандартизированный экспериментальный протокол, который включает в себя расщепление трипсина и очистку первичных RMC, морфологическое наблюдение с использованием инвертированной оптической микроскопии и окрашивания гематоксилином и эозином (HE), идентификацию специфических белков с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и анализ чистоты клеток с помощью проточной цитометрии. Этот протокол служит ценным справочным материалом как для фундаментальных исследований, так и для клинического применения, связанного с RMC, поддерживая изучение их механизмов при заболеваниях сетчатки и способствуя разработке терапевтических стратегий.

Введение

Глиальные клетки Мюллера (РМК) сетчатки, преобладающие макроглии в сетчатке, составляют ядро нейроваскулярной единицы сетчатки 1,2. Охватывая почти всю толщину сетчатки, RMC охватывают почти все нейроны сетчатки и микроциркуляторное русло. Их отростки распространяются вверх до внутренней пограничной мембраны (ILM), образуя апикальные концевые лапы, и вниз до внешней пограничной мембраны (OLM), где они развивают специализированные микроворсинки3. Эта уникальная архитектура позволяет RMC функционировать в качестве основного структурного каркаса для организации сетчатки 4,5.

РМК обогащены ионными каналами, лигандами, рецепторами, трансмембранными транспортерами и ферментами6 и участвуют в метаболизме глюкозы сетчатки посредством гликолиза7. Ионные каналы калия (Kir2.1, Kir4.1) и белки водных каналов (AQP4, AQP9, AQP11) совместно регулируют ионный и водный гомеостаз через клеточную мембрану, поддерживая физиологический баланс сетчатки7. Кроме того, RMC поглощают и выводят нейротрансмиттеры, выделяемые нейронами, включая глутамат, γ-аминомасляную кислоту (ГАМК) и глицин 7,8.

Патологические состояния, такие как диабетическая ретинопатия7, глаукома9 и пигментный ретинит10, могут повреждать RMC, нарушать гемато-ретинальный барьер, вызывать воспаление, увеличивать проницаемость сосудов и ухудшать функцию сетчатки. РМК также признаны латентными внутренними источниками регенеративных клеток сетчатки 11,12. У рыб и некоторых амфибий RMC могут дедифференцироваться в клетки-предшественники сетчатки, которые заменяют нейроны, утраченные из-за повреждения. В сетчатке взрослых млекопитающих RMC экспрессируют маркерные белки, связанные со стволовыми клетками14,15, что дает им возможность дифференцироваться в нейроны сетчатки и замещать поврежденные клетки при дегенеративных заболеваниях, таких как возрастная макулярная дегенерация, глаукома и диабетическая ретинопатия16. Первичные РМК близко имитируют их состояние in vivo и имеют большое значение для изучения и лечения дегенеративных заболеваний сетчатки. Тем не менее, в литературе содержится мало установленных методов выделения и культивирования первичных RMC, особенно у неонатальных крыс Sprague-Dawley (SD).

В этом протоколе используются 3-5-дневные неонатальные крысы SD без гендерных предпочтений. В стерильных условиях глазные яблоки энуклеируются, а ткань сетчатки переваривается с помощью трипсина. Затем первичные RMC выделяют с помощью центрифугирования и очистки для последующего культивирования и пассажа. Морфологический анализ с использованием инвертированной оптической микроскопии в сочетании с окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) показал, что выделенные клетки проявляют характерные особенности RMC. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило экспрессию RMC-специфичных белковых маркеров, включая глутаминсинтетазу (GS), клеточный ретинальдегидсвязывающий белок (CRALBP), виментин, аквапорин-4 (AQP4) и внутренний выпрямитель калиевого канала 4.1 (Kir4.1). Проточный цитометрический анализ после мечения антителами GS и CRALBP показал чистоту клеток на уровне ≥90%, что соответствует установленным критериям для биологических экспериментов на основе RMC и обеспечивает пригодность для последующих функциональных исследований. В ходе эксперимента клетки на четвертом пассаже показали сниженную адгезию к колбе с культурой, морфологические изменения и признаки старения, что в конечном итоге привело к гибели клеток. Поэтому в последующих экспериментах использовались только клетки из первых трех ходов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Комитетом по этике животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (номер этики: 2024069). В исследовании использовались пятьдесят специфических крыс Спрага-Доули без патогенов (SPF) (в возрасте 3-5 дней, пол не указан, масса тела 7-10 г). Животные были коммерчески получены и размещены в Центре экспериментальных животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (лицензия на использование объекта: SYXK [Sichuan] 2024-049) в стандартных лабораторных условиях. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Выделение и культивирование первичных RMC

  1. Подготовка экспериментальных изделий
    1. Перед использованием стерилизуйте следующие предметы под ультрафиолетовым светом в течение не менее 30 минут на чистом столе: колбы для культур T25, центрифужные пробирки и штативы, пипетки и подставки, контейнеры для жидких отходов, зажигалки, спиртовые лампы и маркеры.
    2. Перед использованием стерилизуйте следующие предметы путем автоклавирования: наконечники для пипеток объемом 1 мл, гнущиеся пластины, стеклянные чашки Петри с крышками, изогнутые пинцеты, нейлоновая сетка 45 мкм (300 меш), зубчатый пинцет, беззубый пинцет и ножницы для микророговицы.
  2. Подготовка окружающей среды: Дезинфицировать окружающую среду и операционный стол для рассечения глазного яблока ультрафиолетовым светом в течение более 30 минут. Распыляйте спирт на руки экспериментатора каждый раз перед входом и после выхода с чистой скамейки. Установите инкубатор на 37 °C и 5%CO2. Опрыскайте руки экспериментатора спиртом до и после открытия инкубатора.
  3. Приготовление раствора: Приготовьте раствор D-Hank's, фосфатно-солевой буфер (PBS), модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM с высоким содержанием глюкозы), фетальную бычью сыворотку (FBS, термоинактивированную), раствор пенициллина/стрептомицина (100x) и 0,25% раствор трипсина-ЭДТА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием согрейте DMEM и FBS на водяной бане при температуре 37 °C.
    1. Приготовьте растворы D-Hank's и PBS, содержащие 1% пенициллин/стрептомицин, добавив 100 мкл раствора пенициллина/стрептомицина к 10 мл раствора D-Hank's или PBS соответственно.
    2. Приготовьте полную питательную среду, добавив 100 мкл раствора пенициллина/стрептомицина и 2 мл FBS к 10 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте растворы на чистом лабораторном столе и используйте их немедленно, когда это возможно. Храните всю питательную среду при температуре 4 °C и нагревайте до 37 °C перед каждым использованием. Выбросьте, если храните более одной недели.
  4. Удаление глаз
    1. Усыпляйте неонатальных крыс с СД путем вывиха шейки матки (без удушьяСО2) на стерилизованном рабочем столе в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами. Погрузите тела в 75% спирт на 5 минут для дезинфекции, затем переложите в стерильную изогнутую посуду.
    2. Разлейте раствор D-Hank в две стеклянные посуды для культуры диаметром 10 см.
    3. Используйте зубчатый пинцет, чтобы разорвать веко вдоль глазной щели, чтобы обнажить глазное яблоко.
    4. Используйте беззубый пинцет, открытый и параллельный глазной щели, чтобы надавить на глазницу. Как только зрительный нерв будет достигнут и глазное яблоко обнажено, закройте пинцет, чтобы поднять и извлечь глазное яблоко.
    5. Поместите глазное яблоко в стеклянную чашку с раствором Д-Хэнка, промойте его и переложите в другую чашку со свежим раствором Д-Хэнка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что глазное яблоко остается неповрежденным. В идеале часть зрительного нерва должна оставаться прикрепленной, чтобы облегчить отделение ткани сетчатки.
  5. Диссекция сетчатки
    1. Подготовьте стерилизованную пустую чашку для культуры с крышкой и отрегулируйте микроскоп.
    2. Поместите стеклянную чашку для культуры с шагом 1.4.5 под микроскоп. Используйте изогнутые офтальмологические микрощипцы, чтобы аккуратно зафиксировать область между роговицей и зрительным нервом, чтобы обнажить роговицу.
    3. Проколите корнеосклеральный переход с помощью микроножниц роговицы. Разрежьте вдоль лимба по кругу, затем сделайте симметричные склеральные надрезы примерно 2 мм в длину. Отпустите щипцы и снова зажмите в месте соединения зрительного нерва и склеры.
    4. С помощью вторых щипцов осторожно надавите на корешок зрительного нерва, направляя давление в сторону интерфейса роговичного и зрительного нерва. Когда ткань хрусталика появится, осторожно удалите ее и продолжайте надавливать, пока ткань сетчатки не появится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно снимите линзу, чтобы избежать случайного извлечения ткани сетчатки.
    5. Перенесите отделенную ткань сетчатки в другую стерильную чашку для посева с помощью щипцов. Накройте тарелку крышкой, сбрызните ее спиртом, и поставьте на чистую скамейку.
  6. Извлечение первичных RMC
    1. Включите выключатель чистой настольной вентиляции.
    2. Откройте крышку чашки для культуры. С помощью пипетки с наконечником объемом 1 мл проведите пипеткой ткань сетчатки вверх и вниз около 15 раз, чтобы разбить ее на мелкие кусочки. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут.
    3. Выньте чашку для культуры из инкубатора и поставьте ее на чистую скамейку. Добавьте 2 мл готовой среды и аккуратно пипеткуйте, чтобы остановить пищеварение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте в два раза больше трипсина, чтобы остановить пищеварение. Например, если был использован 1 мл трипсина, завершите прием 2 мл полной среды.
    4. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновое сито с плотностью 300 меш в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Вымойте посуду подготовленным ПБС и соберите оставшуюся суспензию.
    5. Центрифугируйте пробирку при давлении 878 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл готовой среды и снова центрифугируйте при 878 x g в течение 5 минут для очистки клеток.
    6. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 2 мл готовой среды. Предварительно добавьте 3 мл готовой среды в каждую колбу T25, затем добавьте 1 мл клеточной суспензии. Встряхните колбу крестообразно и поместите ее в инкубатор.
    7. Первую смену среды проводят через 48 ч инкубации. Выньте колбу из инкубатора и поставьте ее на чистую скамейку. Выбросьте отработанную среду и трижды промойте прилегающую к клетке поверхность 1 мл PBS.
      1. Добавьте 5 мл свежей готовой среды. Продолжайте менять среду через день до тех пор, пока слияние клеток не превысит 90%, затем приступайте к субкультивированию.

2. Передача RMC

ПРИМЕЧАНИЕ: Проходите через клетки, когда слияние превышает 90%. В этом протоколе первичные культуры обычно требуют пассирования через 5-6 дней после изоляции. Сроки первого прохода могут варьироваться в зависимости от плотности обшивки. Отрегулируйте плотность клеток до 4 x 103 клеток/мл и засейте клетки в колбы для культур T25. Когда слияние достигнет >90% через 3-4 дня, приступайте к пассированию.

  1. Извлеките колбу с культурой Т25 из инкубатора. Выбросьте питательную среду и трижды промойте клетки 1 мл раствора PBS, содержащего 1% пенициллин/стрептомицин.
  2. Добавьте в колбу 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин и 30 с.
  3. Понаблюдайте за колбой под перевернутым микроскопом. Когда ячейки появятся круглыми, оторванными и начнут плавать, достаньте колбу из инкубатора. Переложите его на чистый стол и добавьте 2 мл готовой питательной среды, чтобы завершить разложение.
  4. Используйте пипетку для аспирации клеточной суспензии. Аккуратно приложите пипетку к стенке колбы, чтобы удалить оставшиеся прилипшие клетки.
  5. Перенесите всю клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте стенку колбы 2 мл PBS, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина, и добавьте его в ту же пробирку. Центрифугируйте пробирку при 878 x g в течение 5 минут при RT.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме полной среды. Пройдите ячейки в соотношении 1:2 или 1:3 в зависимости от необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ячейки на проходе 2 (P2) для последующих экспериментов (рис. 1).

3. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Затравочный канал 2 (Р2) клетки в 6-луночный планшет, содержащий предварительно размещенные стерильные покровные стекла с плотностью 2 х 105 клеток на лунку. Добавьте в каждую лунку по 2 мл готовой питательной среды. Когда клетки достигнут примерно 80% конфлюенции, выбросьте питательную среду и осторожно промойте каждую лунку дважды 1 мл PBS.
  2. Добавьте 1 мл 4% фиксатора параформальдегида в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут для фиксации клеток. Выбросьте фиксатор и дважды промойте клетки 1 мл PBS.
  3. Добавьте по 1 мл гематоксилинового красителя в каждую лунку и выдерживайте в течение 15 минут. Выбросьте раствор для окрашивания и промойте лунки 2-3 раза 1 мл PBS.
  4. Понаблюдайте за клетками под микроскопом. Если окрашивание гематоксилином кажется слишком темным, используйте 1% спирт соляной кислоты для дифференцировки и удаления избытка цитоплазматического окрашивания. Промыть 2-3 раза 1 мл PBS.
  5. Добавьте в каждую лунку по 1 мл раствора для окрашивания эозина. Наблюдайте за окрашиванием под микроскопом в течение примерно 30 с или до тех пор, пока не будет достигнута желаемая интенсивность цвета. Промойте лунки 2-3 раза 1 мл PBS. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах с помощью нейтральной смолы.

4. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. Засейте Р2-клетки в 6-луночный планшет, содержащий предварительно размещенные стерильные покровные стекла с плотностью 2 х 10 по5 клеток на лунку. Добавьте в каждую лунку по 2 мл готовой питательной среды.
    1. Когда клетки достигнут примерно 80% слияния, выбросьте питательную среду. Снимите покровную крышку и положите ее в банку для окрашивания. Промойте покровное стекло три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
  2. Добавьте примерно 50 мкл раствора для пермеабилизации (Triton X-100: PBS = 1:200) для покрытия клеток. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут, затем трижды промыть 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут. Добавьте примерно 50 мкл 3% раствора для блокировки BSA и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
  3. Аккуратно выбросьте раствор для блокировки. Добавьте примерно 200 мкл первичного раствора антитела, приготовленного в PBS, чтобы покрыть предметное стекло: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) или Vimentin (1:200). Поместите покровное стекло во увлажненную камеру и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C.
  4. Промойте покровное стекло три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
  5. Добавьте примерно 200 мкл меченого FITC козьего вторичного антитела IgG17 к кролику. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 50 минут. Промойте покровное стекло три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
  6. Окрашивайте ядра DAPI в течение 10 минут. Умыться три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
  7. Добавьте одну каплю средства для крепления, препятствующего выцветанию, на затвор. Установите покровное стекло ячейкой вниз. Закройте и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.

5. Проточная цитометрия

  1. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1,0 x 107 клеток/мл с помощью буфера для окрашивания проточной цитометрией.
  2. Аликвота 100 мкл одноклеточной суспензии в две отдельные пробирки для образцов в каждом кондиционировании. Обозначьте одну пробирку в качестве отрицательного (неокрашенного) контроля.
  3. Добавьте в каждую пробирку по 100 мкл проникающей среды А (из коммерчески приобретенного набора, см. Таблицу материалов). Аккуратно перемешайте и выдержите в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
  4. Добавьте в каждую пробирку по 3 мл предварительно охлажденного буфера для окрашивания проточной цитометрией. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 100 μL проникающей среды B (из коммерчески приобретенного набора) в каждую пробирку и перемешайте вихрь. Добавьте 0,1 мкл антитела CRALBP в предназначенные для этого пробирки и 0,8 мкл антитела GS в соответствующие пробирки. Не добавляйте антитела в отрицательную контрольную трубку. Выдерживать при температуре 4 °C в темноте в течение 30-60 минут.
  6. Добавьте в каждую пробирку по 3 мл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Ресуспендируйте каждую пробирку в 100 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Добавьте 1 мкл FITC-конъюгированного козьего антикроличьего IgG (H&L) в каждую окрашенную CRALBP пробирку и 1 мкл PE-конъюгированного козьего антикролиашьего IgG (H&L) в каждую GS-окрашенную трубку. Не добавляйте антитела в отрицательную контрольную трубку. Выдерживать при температуре 4 °C в темноте в течение 30-60 минут.
  8. Добавьте в каждую пробирку по 3 мл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Ресуспендируйте каждую пробирку в 300 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Немедленно приступайте к анализу проточной цитометрии; в качестве альтернативы ресуспендируют в 500 мкл 1%-4% параформальдегида, хранят при температуре 2-8 °C в темноте и анализируют в течение 24 ч.
  10. Анализируйте отрицательные и положительные образцы с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После того, как первичные клетки засеяны в колбу для культур, последующие изменения среды и пассирование помогают устранить плохо адгезивные RMC и удалить клеточный мусор, образующийся во время пассирования, тем самым обогащая популяцию RMC в культуре. РМК были идентифицированы на основе их морфологии с помощью инвертированного оптического микроскопа (рис. 1) и окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) (рис. 2). Иммунофлуоре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье представлен подробный протокол выделения первичных RMC от неонатальных крыс SD. Протокол охватывает все этапы, включая предэкспериментальную подготовку, энуклеацию глазного яблока, выделение ткани сетчатки и пошаговые процедуры экстракции, культивирования, пассирования и идентификации RMC. В нем также подчеркиваются ключевые соображения, которые должны соблюдаться на протяжении всего процесса культивирования клеток, и предлагается стандартизированное техническое руководство...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликта интересов, связанного с содержанием данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом природы провинции Сычуань (2023NSFSC0690).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1% Triton X-100SolarbioT8200
0,25% Трипсин-ЭДТАГиклон SH30042.01B
1% соляная кислота спиртBIOSYSTEMS3803651E
4% параформальдегидSolarbioP1110
45μ m нейлоновая сетка (300 меш)SolarbioYA0926
6-луночная пластинаServicebioIMC202302001
6 см Стеклянная чашка ПетриNormax5058541
75% спиртаKESHIGEA004
Аквапорин-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
Инкубатор для клеточных культурThermoFORMA311
клеточный ретинальдегидсвязывающий белок (CRALBP)HUABOIHA721330
ЦентрифугаHunan XiangyiTDZ5-WS
Чистая скамьяZHICHENGZHJH-C12
Роговичные ножницыJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
Раствор D-HankSolarbioH1045
DMEM  среда с высоким содержанием глюкозыGibcoC11995500BT
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Sbjbio life SciencesBC-SE-FBS01
FIX& PERM Medium AMultiSciencesGAS006/2
FIX& PERM Medium BMultiSciencesGAS006/2
буфер для окрашивания проточной цитометриейMultiSciencesS1001
Fluoromount-G Флуоресцентная монтажная средаSourthernBiotech0100-01
Глутаминсинтетаза Поликлональное антителоProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50UL
Goat 324 Anti-Rabbit IgG H& L PEBiossbs-0295G-PE
Козий анти-323 кролик IgG H& L FITCBiossbs-0295G-FITC
набор для окрашивания гематоксилин-эозина (HE)SolarbioG1120
машина для дезинфекции высокого давленияzealway (xiamen) инструмент IncGI80DS
Инвертированный флуоресцентный микроскопNikon 
Инвертированный фазово-контрастный микроскопLeica DMIL
внутренний выпрямитель калиевого канала 4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
Нейтральная смолаSolarbioG8590-100
Раствор пенициллина-стрептомицина (100&раз;)ГиклонSV30010
фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) (pH7,2-7,4)SolarbioP1020-500 мл
Вторичное антитело (меченое FITC козье анти-кролико)ServicebioGB22303
крыс Sprague-Dawley Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd.Лицензия на производство No: SCXK [Сычуань] 2020-0030
T25 Колба для культурыCornning 
Трубки для торнадо: 15 млWHB WHB-15-1
Трубки для торнадо: 50 млWHB WHB-50-1
стерилизатор для ультрафиолетовой дезинфекцииGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
SMZ1500430639

Ссылки

  1. Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  2. Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
  3. Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
  4. Subirada, P. V., Paz, M. C., Ridano, M. E., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. Eur J Neurosci. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  5. Wang, J., O'Sullivan, M. L., Mukherjee, D., et al. Anatomy and spatial organization of Müller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  6. Beverley, K. M., Pattnaik, B. A. Inward rectifier potassium (Kir) channels in the retina: Living our vision. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (3), C772-C782 (2022).
  7. Lai, D., Wu, Y., Shao, C., et al. The role of Müller cells in diabetic macular edema. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (10), 8(2023).
  8. Coughlin, B., Schnabolk, G., Joseph, K., et al. Systemic complement inhibition reduces intraocular inflammation and retinal cell death in murine models of glaucoma. J Neuroinflammation. 16, 212(2019).
  9. Alarcon-Martinez, L., Shiga, Y., Villafranca-Baughman, D., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  10. Strong, S., Liew, G., Michaelides, M. Retinitis pigmentosa-associated cystoid macular oedema: Pathogenesis and avenues of intervention. Br J Ophthalmol. 101 (1), 31-37 (2017).
  11. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  12. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. J. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  13. Norrie, J. L., et al. Latent epigenetic programs in Müller glia contribute to stress and disease response in the retina. Dev Cell. 60 (8), 1199-1216.e7 (2025).
  14. Too, L. K., Gracie, G., Hasic, E. Adult human retinal Müller glia display distinct peripheral and macular expression of CD117 and CD44 stem cell-associated proteins. Acta Histochem. 119 (2), 142-149 (2017).
  15. Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res. 93 (6), 852-861 (2011).
  16. Grigoryan, E. N. Cell sources for retinal regeneration: Implication for data translation in biomedicine of the eye. Cells. 11 (23), 3755(2022).
  17. Dong, S., Li, X., Chen, Z. MMP28 recruits M2-type tumor-associated macrophages through MAPK/JNK signaling pathway-dependent cytokine secretion to promote the malignant progression of pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 60(2025).
  18. Vardimon, L., Ben-Dror, I., Havazelet, N. Molecular control of glutamine synthetase expression in the developing retina tissue. Dev Dyn. 196 (4), 276-282 (1993).
  19. Xu, Q. A., Boerkoel, P., Hirsch-Reinshagen, V. Müller cell degeneration and microglial dysfunction in the Alzheimer's retina. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 145(2022).
  20. Bunt-Milam, A. H., Saari, J. C. Immunocytochemical localization of two retinoid-binding proteins in vertebrate retina. J Cell Biol. 97 (3), 703-712 (1983).
  21. Masri, R. A., et al. Immunohistochemistry and spatial density of Müller cells in the human fovea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 46(2025).
  22. Kolesnikov, A. V., Kiser, P. D., Palczewski, K. Function of mammalian M-cones depends on the level of CRALBP in Müller cells. J Gen Physiol. 153 (1), e202012675(2021).
  23. Xue, Y., Shen, S. Q., Jui, J. CRALBP supports the mammalian retinal visual cycle and cone vision. J Clin Invest. 125 (2), 727-738 (2015).
  24. Pereiro, X., Beriain, S., Rodriguez, L. Characteristics of whale Müller glia in primary and immortalized cultures. Front Neurosci. 16, 854278(2022).
  25. Tran, T. L., Bek, T., Holm, L. Aquaporins 6-12 in the human eye. Acta Ophthalmol. 91 (6), 557-563 (2013).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (2), 42-47 (2015).
  27. Zeng, Q., Xia, X. B. Study on the differentiation of retinal ganglion cells from rat Müller cells in vitro. Yan Ke Za Zhi. 46 (7), 615-620 (2010).
  28. Backstrom, J. R., et al. Phenotypes of primary retinal macroglia: Implications for purification and culture conditions. Exp Eye Res. 182, 85-92 (2019).
  29. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  30. Pereiro, X., et al. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice Müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14 (7), (2020).
  31. Wang, M., Ma, W., Zhao, L. Adaptive Müller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. J Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  32. Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P. Isolation of primary mouse retinal glial Müller cells. J Vis Exp. (210), e66237(2024).
  33. Li, Q., Cheng, Y., Zhang, S. TRPV4-induced Müller cell gliosis and TNF-α elevation-mediated retinal ganglion cell apoptosis in glaucomatous rats via JAK2/STAT3/NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 18 (1), 271(2021).
  34. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  35. Reichenbach, A., Wolburg, H., Richter, W. Membrane ultrastructure preservation and membrane potentials after isolation of rabbit retinal glial (Müller) cells by papain. J Neurosci Methods. 32 (3), 227-233 (1990).
  36. Harstad, H. K., Ringvold, A. Scanning and transmission electron microscopy of Müller cells isolated from rabbit retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 223 (1), 29-34 (1985).
  37. Guidry, C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (5), 740-752 (1996).
  38. Qiu, A. W., Wang, N. Y., Yin, W. J. Retinal Müller cell-released exosomal miR-92a-3p delivers interleukin-17A signal by targeting Notch-1 to promote diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 1(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Первичная культура клетокдиссекция сетчаткитрипсинизациякрысы Sprague-Dawleyиммунофлуоресцентное окрашиваниепроточная цитометрияокрашивание гематоксилином и эозиномглутаминсинтетазастволовые клетки сетчатки
Выделение и культивирование первичных клеток Мюллера сетчатки у крыс Sprague-Dawley (SD)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.