Выделение и культивирование первичных клеток Мюллера сетчатки у крыс Sprague-Dawley (SD)

Глиальные клетки Мюллера (РМК) сетчатки, преобладающие макроглии в сетчатке, составляют ядро нейроваскулярной единицы сетчатки ^1,2. Охватывая почти всю толщину сетчатки, RMC охватывают почти все нейроны сетчатки и микроциркуляторное русло. Их отростки распространяются вверх до внутренней пограничной мембраны (ILM), образуя апикальные концевые лапы, и вниз до внешней пограничной мембраны (OLM), где они развивают специализированные микроворсинки³. Эта уникальная архитектура позволяет RMC функционировать в качестве основного структурного каркаса для организации сетчатки ^4,5.

РМК обогащены ионными каналами, лигандами, рецепторами, трансмембранными транспортерами и ферментами⁶ и участвуют в метаболизме глюкозы сетчатки посредством гликолиза⁷. Ионные каналы калия (Kir2.1, Kir4.1) и белки водных каналов (AQP4, AQP9, AQP11) совместно регулируют ионный и водный гомеостаз через клеточную мембрану, поддерживая физиологический баланс сетчатки⁷. Кроме того, RMC поглощают и выводят нейротрансмиттеры, выделяемые нейронами, включая глутамат, γ-аминомасляную кислоту (ГАМК) и глицин ^7,8.

Патологические состояния, такие как диабетическая ретинопатия⁷, глаукома⁹ и пигментный ретинит¹⁰, могут повреждать RMC, нарушать гемато-ретинальный барьер, вызывать воспаление, увеличивать проницаемость сосудов и ухудшать функцию сетчатки. РМК также признаны латентными внутренними источниками регенеративных клеток сетчатки ^11,12. У рыб и некоторых амфибий RMC могут дедифференцироваться в клетки-предшественники сетчатки, которые заменяют нейроны, утраченные из-за повреждения. В сетчатке взрослых млекопитающих RMC экспрессируют маркерные белки, связанные со стволовыми клетками^14,15, что дает им возможность дифференцироваться в нейроны сетчатки и замещать поврежденные клетки при дегенеративных заболеваниях, таких как возрастная макулярная дегенерация, глаукома и диабетическая ретинопатия¹⁶. Первичные РМК близко имитируют их состояние in vivo и имеют большое значение для изучения и лечения дегенеративных заболеваний сетчатки. Тем не менее, в литературе содержится мало установленных методов выделения и культивирования первичных RMC, особенно у неонатальных крыс Sprague-Dawley (SD).

В этом протоколе используются 3-5-дневные неонатальные крысы SD без гендерных предпочтений. В стерильных условиях глазные яблоки энуклеируются, а ткань сетчатки переваривается с помощью трипсина. Затем первичные RMC выделяют с помощью центрифугирования и очистки для последующего культивирования и пассажа. Морфологический анализ с использованием инвертированной оптической микроскопии в сочетании с окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) показал, что выделенные клетки проявляют характерные особенности RMC. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило экспрессию RMC-специфичных белковых маркеров, включая глутаминсинтетазу (GS), клеточный ретинальдегидсвязывающий белок (CRALBP), виментин, аквапорин-4 (AQP4) и внутренний выпрямитель калиевого канала 4.1 (Kir4.1). Проточный цитометрический анализ после мечения антителами GS и CRALBP показал чистоту клеток на уровне ≥90%, что соответствует установленным критериям для биологических экспериментов на основе RMC и обеспечивает пригодность для последующих функциональных исследований. В ходе эксперимента клетки на четвертом пассаже показали сниженную адгезию к колбе с культурой, морфологические изменения и признаки старения, что в конечном итоге привело к гибели клеток. Поэтому в последующих экспериментах использовались только клетки из первых трех ходов.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Комитетом по этике животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (номер этики: 2024069). В исследовании использовались пятьдесят специфических крыс Спрага-Доули без патогенов (SPF) (в возрасте 3-5 дней, пол не указан, масса тела 7-10 г). Животные были коммерчески получены и размещены в Центре экспериментальных животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (лицензия на использование объекта: SYXK [Sichuan] 2024-049) в стандартных лабораторных условиях. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Выделение и культивирование первичных RMC

1. Подготовка экспериментальных изделий
   1. Перед использованием стерилизуйте следующие предметы под ультрафиолетовым светом в течение не менее 30 минут на чистом столе: колбы для культур T25, центрифужные пробирки и штативы, пипетки и подставки, контейнеры для жидких отходов, зажигалки, спиртовые лампы и маркеры.
   2. Перед использованием стерилизуйте следующие предметы путем автоклавирования: наконечники для пипеток объемом 1 мл, гнущиеся пластины, стеклянные чашки Петри с крышками, изогнутые пинцеты, нейлоновая сетка 45 мкм (300 меш), зубчатый пинцет, беззубый пинцет и ножницы для микророговицы.
2. Подготовка окружающей среды: Дезинфицировать окружающую среду и операционный стол для рассечения глазного яблока ультрафиолетовым светом в течение более 30 минут. Распыляйте спирт на руки экспериментатора каждый раз перед входом и после выхода с чистой скамейки. Установите инкубатор на 37 °C и 5%_CO2. Опрыскайте руки экспериментатора спиртом до и после открытия инкубатора.
3. Приготовление раствора: Приготовьте раствор D-Hank's, фосфатно-солевой буфер (PBS), модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM с высоким содержанием глюкозы), фетальную бычью сыворотку (FBS, термоинактивированную), раствор пенициллина/стрептомицина (100x) и 0,25% раствор трипсина-ЭДТА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием согрейте DMEM и FBS на водяной бане при температуре 37 °C.
   1. Приготовьте растворы D-Hank's и PBS, содержащие 1% пенициллин/стрептомицин, добавив 100 мкл раствора пенициллина/стрептомицина к 10 мл раствора D-Hank's или PBS соответственно.
   2. Приготовьте полную питательную среду, добавив 100 мкл раствора пенициллина/стрептомицина и 2 мл FBS к 10 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте растворы на чистом лабораторном столе и используйте их немедленно, когда это возможно. Храните всю питательную среду при температуре 4 °C и нагревайте до 37 °C перед каждым использованием. Выбросьте, если храните более одной недели.
4. Удаление глаз
   1. Усыпляйте неонатальных крыс с СД путем вывиха шейки матки (без удушья_СО2) на стерилизованном рабочем столе в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами. Погрузите тела в 75% спирт на 5 минут для дезинфекции, затем переложите в стерильную изогнутую посуду.
   2. Разлейте раствор D-Hank в две стеклянные посуды для культуры диаметром 10 см.
   3. Используйте зубчатый пинцет, чтобы разорвать веко вдоль глазной щели, чтобы обнажить глазное яблоко.
   4. Используйте беззубый пинцет, открытый и параллельный глазной щели, чтобы надавить на глазницу. Как только зрительный нерв будет достигнут и глазное яблоко обнажено, закройте пинцет, чтобы поднять и извлечь глазное яблоко.
   5. Поместите глазное яблоко в стеклянную чашку с раствором Д-Хэнка, промойте его и переложите в другую чашку со свежим раствором Д-Хэнка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что глазное яблоко остается неповрежденным. В идеале часть зрительного нерва должна оставаться прикрепленной, чтобы облегчить отделение ткани сетчатки.
5. Диссекция сетчатки
   1. Подготовьте стерилизованную пустую чашку для культуры с крышкой и отрегулируйте микроскоп.
   2. Поместите стеклянную чашку для культуры с шагом 1.4.5 под микроскоп. Используйте изогнутые офтальмологические микрощипцы, чтобы аккуратно зафиксировать область между роговицей и зрительным нервом, чтобы обнажить роговицу.
   3. Проколите корнеосклеральный переход с помощью микроножниц роговицы. Разрежьте вдоль лимба по кругу, затем сделайте симметричные склеральные надрезы примерно 2 мм в длину. Отпустите щипцы и снова зажмите в месте соединения зрительного нерва и склеры.
   4. С помощью вторых щипцов осторожно надавите на корешок зрительного нерва, направляя давление в сторону интерфейса роговичного и зрительного нерва. Когда ткань хрусталика появится, осторожно удалите ее и продолжайте надавливать, пока ткань сетчатки не появится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно снимите линзу, чтобы избежать случайного извлечения ткани сетчатки.
   5. Перенесите отделенную ткань сетчатки в другую стерильную чашку для посева с помощью щипцов. Накройте тарелку крышкой, сбрызните ее спиртом, и поставьте на чистую скамейку.
6. Извлечение первичных RMC
   1. Включите выключатель чистой настольной вентиляции.
   2. Откройте крышку чашки для культуры. С помощью пипетки с наконечником объемом 1 мл проведите пипеткой ткань сетчатки вверх и вниз около 15 раз, чтобы разбить ее на мелкие кусочки. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут.
   3. Выньте чашку для культуры из инкубатора и поставьте ее на чистую скамейку. Добавьте 2 мл готовой среды и аккуратно пипеткуйте, чтобы остановить пищеварение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте в два раза больше трипсина, чтобы остановить пищеварение. Например, если был использован 1 мл трипсина, завершите прием 2 мл полной среды.
   4. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновое сито с плотностью 300 меш в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Вымойте посуду подготовленным ПБС и соберите оставшуюся суспензию.
   5. Центрифугируйте пробирку при давлении 878 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл готовой среды и снова центрифугируйте при 878 x g в течение 5 минут для очистки клеток.
   6. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 2 мл готовой среды. Предварительно добавьте 3 мл готовой среды в каждую колбу T25, затем добавьте 1 мл клеточной суспензии. Встряхните колбу крестообразно и поместите ее в инкубатор.
   7. Первую смену среды проводят через 48 ч инкубации. Выньте колбу из инкубатора и поставьте ее на чистую скамейку. Выбросьте отработанную среду и трижды промойте прилегающую к клетке поверхность 1 мл PBS.
      1. Добавьте 5 мл свежей готовой среды. Продолжайте менять среду через день до тех пор, пока слияние клеток не превысит 90%, затем приступайте к субкультивированию.

2. Передача RMC

ПРИМЕЧАНИЕ: Проходите через клетки, когда слияние превышает 90%. В этом протоколе первичные культуры обычно требуют пассирования через 5-6 дней после изоляции. Сроки первого прохода могут варьироваться в зависимости от плотности обшивки. Отрегулируйте плотность клеток до 4 x 10³ клеток/мл и засейте клетки в колбы для культур T25. Когда слияние достигнет >90% через 3-4 дня, приступайте к пассированию.

1. Извлеките колбу с культурой Т25 из инкубатора. Выбросьте питательную среду и трижды промойте клетки 1 мл раствора PBS, содержащего 1% пенициллин/стрептомицин.
2. Добавьте в колбу 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин и 30 с.
3. Понаблюдайте за колбой под перевернутым микроскопом. Когда ячейки появятся круглыми, оторванными и начнут плавать, достаньте колбу из инкубатора. Переложите его на чистый стол и добавьте 2 мл готовой питательной среды, чтобы завершить разложение.
4. Используйте пипетку для аспирации клеточной суспензии. Аккуратно приложите пипетку к стенке колбы, чтобы удалить оставшиеся прилипшие клетки.
5. Перенесите всю клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте стенку колбы 2 мл PBS, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина, и добавьте его в ту же пробирку. Центрифугируйте пробирку при 878 x g в течение 5 минут при RT.
6. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме полной среды. Пройдите ячейки в соотношении 1:2 или 1:3 в зависимости от необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ячейки на проходе 2 (P2) для последующих экспериментов (рис. 1).

3. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Затравочный канал 2 (Р2) клетки в 6-луночный планшет, содержащий предварительно размещенные стерильные покровные стекла с плотностью 2 х 10⁵ клеток на лунку. Добавьте в каждую лунку по 2 мл готовой питательной среды. Когда клетки достигнут примерно 80% конфлюенции, выбросьте питательную среду и осторожно промойте каждую лунку дважды 1 мл PBS.
2. Добавьте 1 мл 4% фиксатора параформальдегида в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут для фиксации клеток. Выбросьте фиксатор и дважды промойте клетки 1 мл PBS.
3. Добавьте по 1 мл гематоксилинового красителя в каждую лунку и выдерживайте в течение 15 минут. Выбросьте раствор для окрашивания и промойте лунки 2-3 раза 1 мл PBS.
4. Понаблюдайте за клетками под микроскопом. Если окрашивание гематоксилином кажется слишком темным, используйте 1% спирт соляной кислоты для дифференцировки и удаления избытка цитоплазматического окрашивания. Промыть 2-3 раза 1 мл PBS.
5. Добавьте в каждую лунку по 1 мл раствора для окрашивания эозина. Наблюдайте за окрашиванием под микроскопом в течение примерно 30 с или до тех пор, пока не будет достигнута желаемая интенсивность цвета. Промойте лунки 2-3 раза 1 мл PBS. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах с помощью нейтральной смолы.

4. Иммунофлюоресцентное окрашивание

1. Засейте Р2-клетки в 6-луночный планшет, содержащий предварительно размещенные стерильные покровные стекла с плотностью 2 х 10 по⁵ клеток на лунку. Добавьте в каждую лунку по 2 мл готовой питательной среды.
   1. Когда клетки достигнут примерно 80% слияния, выбросьте питательную среду. Снимите покровную крышку и положите ее в банку для окрашивания. Промойте покровное стекло три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
2. Добавьте примерно 50 мкл раствора для пермеабилизации (Triton X-100: PBS = 1:200) для покрытия клеток. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут, затем трижды промыть 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут. Добавьте примерно 50 мкл 3% раствора для блокировки BSA и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
3. Аккуратно выбросьте раствор для блокировки. Добавьте примерно 200 мкл первичного раствора антитела, приготовленного в PBS, чтобы покрыть предметное стекло: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) или Vimentin (1:200). Поместите покровное стекло во увлажненную камеру и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C.
4. Промойте покровное стекло три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
5. Добавьте примерно 200 мкл меченого FITC козьего вторичного антитела IgG¹⁷ к кролику. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 50 минут. Промойте покровное стекло три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
6. Окрашивайте ядра DAPI в течение 10 минут. Умыться три раза 1 мл PBS, каждый раз по 5 минут.
7. Добавьте одну каплю средства для крепления, препятствующего выцветанию, на затвор. Установите покровное стекло ячейкой вниз. Закройте и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.

5. Проточная цитометрия

1. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1,0 x 10⁷ клеток/мл с помощью буфера для окрашивания проточной цитометрией.
2. Аликвота 100 мкл одноклеточной суспензии в две отдельные пробирки для образцов в каждом кондиционировании. Обозначьте одну пробирку в качестве отрицательного (неокрашенного) контроля.
3. Добавьте в каждую пробирку по 100 мкл проникающей среды А (из коммерчески приобретенного набора, см. Таблицу материалов). Аккуратно перемешайте и выдержите в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Добавьте в каждую пробирку по 3 мл предварительно охлажденного буфера для окрашивания проточной цитометрией. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
5. Добавьте 100 μL проникающей среды B (из коммерчески приобретенного набора) в каждую пробирку и перемешайте вихрь. Добавьте 0,1 мкл антитела CRALBP в предназначенные для этого пробирки и 0,8 мкл антитела GS в соответствующие пробирки. Не добавляйте антитела в отрицательную контрольную трубку. Выдерживать при температуре 4 °C в темноте в течение 30-60 минут.
6. Добавьте в каждую пробирку по 3 мл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируйте каждую пробирку в 100 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Добавьте 1 мкл FITC-конъюгированного козьего антикроличьего IgG (H&L) в каждую окрашенную CRALBP пробирку и 1 мкл PE-конъюгированного козьего антикролиашьего IgG (H&L) в каждую GS-окрашенную трубку. Не добавляйте антитела в отрицательную контрольную трубку. Выдерживать при температуре 4 °C в темноте в течение 30-60 минут.
8. Добавьте в каждую пробирку по 3 мл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
9. Ресуспендируйте каждую пробирку в 300 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией. Немедленно приступайте к анализу проточной цитометрии; в качестве альтернативы ресуспендируют в 500 мкл 1%-4% параформальдегида, хранят при температуре 2-8 °C в темноте и анализируют в течение 24 ч.
10. Анализируйте отрицательные и положительные образцы с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии.

После того, как первичные клетки засеяны в колбу для культур, последующие изменения среды и пассирование помогают устранить плохо адгезивные RMC и удалить клеточный мусор, образующийся во время пассирования, тем самым обогащая популяцию RMC в культуре. РМК были идентифицированы на основе их морфологии с помощью инвертированного оптического микроскопа (рис. 1) и окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) (рис. 2). Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили с использованием специфических антител против GS, Vimentin, CRALBP, AQP4 и Kir4.1 для наблюдения за экспрессией белка (рис. 3). Кроме того, проводили проточную цитометрию с использованием мечения антител GS и CRALBP для определения чистоты популяции RMC (рис. 4).

Как показано на рисунках 1 и 2, РМК второго прохода (P2), наблюдаемые под инвертированным оптическим микроскопом, демонстрируют звездообразную или веретенообразную морфологию с четкими границами и обильной цитоплазмой. Их ядра круглые или овальные, однородные по размеру и окружены радиально расширяющимися отростками. Также видны некоторые клетки-предшественники сетчатки; Эти клетки круглые или овальные, содержат крупные ядра и имеют относительно меньшую цитоплазму.

Для специфической идентификации RMC в этом исследовании в качестве иммунофлуоресцентных маркеров использовали GS, виментин, CRALBP, AQP4 и Kir4.1. GS является ключевым ферментом, который превращает глутамат в глутамин. Он экспрессируется исключительно в RMC и преимущественно локализуется в их цитоплазме 18,19. CRALBP, первоначально идентифицированный в сетчатке позвоночных, экспрессируется как в клетках пигментного эпителия сетчатки (RPE), так и вRMC20. Экспрессия GS и CRALBP также наблюдалась на протяжении всех клеточных процессов в сетчатке глазачеловека21. Примечательно, что специфический уровень экспрессии CRALBP в RMC млекопитающих регулирует эффективность зрительного цикла сетчатки и тесно связан с функцией колбочек22,23. Таким образом, как GS, так и CRALBP служат надежными иммуноспецифическими маркерами для RMC.

Виментин, промежуточный белок цитоскелета, является отличительной чертой глиальных клеток сетчатки млекопитающих. Он в изобилии экспрессируется в цитоплазме и отростках RMC и обычно используется в качестве маркера глиальных клеток сетчатки24. AQP4 представляет собой двунаправленный белок трансмембранного водного канала, который колокализуется с Kir4.1 на внутренней пограничной мембране (ILM). Эти два белка демонстрируют структурную и функциональную связь, способствуя скоординированному трансмембранному транспорту избыточной воды и ионов K+ в интерстициальное пространство сетчатки для поддержания гомеостаза 7,25. NeuN, нейрональный ядерный антиген и маркер дифференцировки нейронов, был использован в качестве отрицательного контроля в этом исследовании26.

На рисунке 3 иммунофлуоресцентное окрашивание RMC показало ярко-красную флуоресценцию для GS, AQP4, в то время как CRALBP, Kir4.1 и Vimentin показали ярко-зеленую флуоресценцию. RMC демонстрировали разнообразную морфологию, при этом клеточные тела выглядели круглыми, овальными или неправильными и имели четко определенные границы. Были видны дендритные процессы, указывающие на тесные межклеточные связи. Экспрессия NeuN в RMC не выявлена, что подтверждает отсутствие загрязнения нейронов.

На рисунке 4 проточный цитометрический анализ после мечения антител GS и CRALBP показал, что чистота культивируемых RMC превышает 90%. Такой высокий уровень чистоты отвечает требованиям, предъявляемым к последующим функциональным исследованиям.

Рисунок 1: Морфология RMC на стадии P2, наблюдаемая под инвертированным микроскопом при различных увеличениях. Ячейки получаются звездообразными или веретенообразными, плотно расположенными, с гладкими краями. Ядра имеют круглую или овальную форму, а в цитоплазме видны зернистые вещества. Изображения получаются с 40-кратным, 100-кратным и 200-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Клеточная морфология RMC после окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Ячейки имеют веретенообразную или звездообразную форму; некоторые остаются относительно круглыми, что указывает на неполную дифференциацию. Цитоплазма обильная и светло-розовая, с четкими клеточными мембранами. Ядра большие, овальные, расположены по центру, кажутся темнее цитоплазмы в розовом или светло-красном цвете. Клетки имеют гладкие края и соединены между собой тонкими нитчатыми структурами. Изображения получаются с 100-кратным, 200-кратным и 400-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Иммунофлуоресцентное окрашивание RMC. GS и AQP4 демонстрируют ярко-красную флуоресценцию, в то время как CRALBP, Kir4.1 и Vimentin демонстрируют зеленую флуоресценцию. РМК имеют круглые или овальные клеточные тела с одним или двумя ядрами и обильной цитоплазмой. Клеточные мембраны имеют четко выраженные границы, видны дендритные выступы. Количественная оценка проводилась в пяти случайно выбранных полях зрения, показывающих 90% положительных клеток (n = 3 независимых эксперимента). Увеличение: 40x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Проточный цитометрический анализ RMC. Показаны уровни экспрессии GS (слева) и CRALBP (справа). Синим цветом обозначена популяция отрицательного контроля, а красным — клетки, окрашенные для белка-мишени. Горизонтальная ось показывает интенсивность флуоресценции (FL2-Area для PE-Area, FL1-Area для FITC-Area), а вертикальная ось указывает на количество клеток. Значения, обозначенные синими и красными вершинами, представляют собой пропорции отрицательных и положительных ячеек соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

У всех авторов нет конфликта интересов, связанного с содержанием данной статьи.