Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг чечевичных полей на наличие фузариозного увядания и корневых гнилей в Турции в условиях наземного климата

857 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68156

⸱

11 апреля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University, 2Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Tokat Gaziosmanpaşa, 3Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University

В этой статье

Краткое содержание

Исследование, проведенное в провинции Йозгат, показало, что биотические факторы, такие как грибковые заболевания, такие как увядание и корневая гниль, ограничивают производство чечевицы. Изоляты фузариоза были обнаружены в 95,4% образцов, что предполагает периодические локальные обследования и регулярный мониторинг для устойчивого развития технологий и эффективных стратегий борьбы.

Аннотация

Чечевица является важным самоопыляемым растением бобовых культур. Его производство ограничено различными биотическими факторами, особенно грибковыми агентами, вызывающими увядание и комплекс корневых гнилей. Целью исследования было понимание региональной эпидемиологии и этиологии фитопатогенных грибковых агентов для разработки стратегий борьбы с почвенным Fusarium spp. В ходе этого исследования в 2022 и 2023 гг. были изучены 83 района посева чечевицы в провинции Йозгат на предмет болезней увядания, корневых и коронных гнилей, вызванных распространенными видами Fusarium . Для выделения и идентификации грибов были собраны растения чечевицы с симптомами. Изоляты Fusarium были сгруппированы в соответствии с морфологией колонии и культивировались на среде PDA. Кроме того, геномные ДНК, полученные из изолятов Fusarium , были проанализированы с помощью ПЦР и сравнены с другими изолятами Fusarium , зарегистрированными в NCBI GenBank. Генетические родства между изолятами Fusarium определяли с помощью метода максимальной парсимонии (МП) в программе Mega 11. В результате средние показатели заболеваемости и тяжести болезней увядания и корневых гниль в провинции Йозгат составили 16,9% и 38,6% соответственно. Изоляты Fusarium обнаружены в 95,4% образцов. Среди изолятов F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum и F. solani наблюдалась гомогенность нуклеотидных последовательностей от 99,5% до 100%, а наиболее изолированным видом был F. oxysporum. Дендрограмма МП изолятов Fusarium была разделена на две основные ветви, первая из которых включала все изоляты F. solani . Вторая основная ветвь включала другие виды Fusarium, выделенные в настоящем исследовании и в NCBI GenBank. В исследовании предлагается проводить периодические локальные обследования для определения частоты подавления фузариоза у чечевицы. Для борьбы с болезнью и сохранения системы производства чечевицы настоятельно рекомендуется своевременное подавление повреждений, вызванных фузариозом.

Введение

Чечевица (Lens culinaris Medik.), мелкосъедобная зерновая бобовая, принадлежащая к семейству Fabaceae, представляет собой самоопыляющуюся культуру прохладного сезона с игольчатыми листьями и белыми или бледно-фиолетовыми или темно-фиолетовыми цветами1. Он был одомашнен человеком около 10 000 лет назад в месопотамской части Плодородного полумесяца и быстро распространился в Новом Свете, включая Средиземноморский бассейн и Центральную Азию, а позже был натурализован в Северной и ЮжнойАмерике. Мировые площади выращивания чечевицы составляют около 5,5млн га при производстве 6,6 млн тонн3. Турция занимает4-е место по производству чечевицы после Канады, Индии и Австралии. Выращивание чечевицы в Турции имеет очень важное значение и составляет 6,7% мирового производства. Общий объем производства чечевицы в Турции составляет 474 000 тонн и производится по меньшей мере в 40провинциях. Около 89,5% производства чечевицы в Турции составляют красная и зеленая чечевица, которые составляют 10,5% озимых культур в регионе Юго-Восточной Анатолии. Остальной урожай выращивается как яровый. Наибольший вкладв производство зеленой чечевицы вносят провинции Йозгат (39,5%), Конья (23,7%), Кыршехир (16,3%), Чорум (7,6%) и Анкара (2,9%). Производство чечевицы может быть ограничено биотическими и абиотическими стрессовыми факторами. Морозы и засуха являются наиболее распространенными абиотическими факторами стресса при выращивании зеленой чечевицылетом 5. Грибковые заболевания, такие как увядание, комплекс корневых и коронных гнилей, вызываемые видами Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium и Fusarium, являются наиболее серьезными грибковыми заболеваниями, которые вызывают комбинацию заболеваний, включая выползание, фитофтороз рассады, увядание и корневую гниль, в зависимости от времени заражения, восприимчивости хозяина и метеорологических условий 6,7, 8.

Fusarium представляет собой нитчатый несовершенный грибок, обнаруженный в почве, растениях и органических субстратах и являющийся космополитическим родом среди этих патогенов9. Он вызывает различные заболевания, такие как фузариозное увядание, корневая гниль и гниль корневой шейки, а также фузариозное поражение кочана у пшеницы, фузариозное увядание у бахчевых и корневая гниль у большинства бобовых, включая чечевицу 10,11,12. Сосудистое увядание, корневая гниль и гниль корневой шейки, вызываемые Fusarium spp., являются наиболее распространенным заболеванием чечевицы во многих районах выращивания чечевицы во всем мире10. Fusarium oxysporum является наиболее распространенным видом Fusarium, связанным с увяданием, корневой гнилью и гнилью корневой шейки чечевицы. В глобальном масштабе увядание, корневые и кронные гнили вызываются F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani и F. verticillioides на посадках чечевицы7. Болезни увядших, корневых и кронных гнилей, вызываемые Fusarium spp., проявляются как на рассадной, так и на взрослой стадиях и вызывают внезапное увядание, засыхание и последующую гибель листьев. Симптомы заболевания включают гниль семян, корневую гниль, увядание верхних листьев, отставание в росте, усыхание и скручивание листьев. На средних и поздних стадиях наполнения стручков семена обычно сжимаются, а симптомы корней включают задержку роста, коричневое обесцвечивание, поврежденные кончики стержневых корней и разрастание вторичных корней. Изменение цвета сосудистой ткани может наблюдаться не во всех случаях13.

В регионе Центральной Анатолии исследования состояния болезней увядания и корневой гнили у чечевицы проводились в ограниченном количестве. Йозгат имеет мягкий и умеренный климат с обильными осадками зимой по сравнению с летом и классифицируется как Dsb (теплый, влажный наземный климат) по шкале Кеппена иГейгера 14. Средняя температура составляет 9,6 °C при среднем количестве осадков 512 мм. Йозгат расположен в северном полушарии. Лето приходится на июнь, июль, август и сентябрь. Очень важно иметь информацию о региональной эпидемиологии и этиологии фитопатогенных грибковых агентов, вызывающих заболевание, для разработки различных стратегий борьбы с почвенным Fusarium spp., для борьбы с болезнью15. В связи с этим целями настоящего исследования являются определение и идентификация параметров заболевания (распространенность, частота и тяжесть заболевания) болезней увядания, корневой и корончатой гнили чечевицы путем проведения обследования в провинции Йозгат, где примерно 40% от общего объема производства зеленой чечевицы производится единолично, патогенный фузариоз виды, вызывающие увядание и корневую гниль у чечевицы, с помощью морфологического и молекулярного анализа, а также для определения индивидуальных уровней вирулентности видов Fusarium путем проведения тестов на патогенность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Полевое обследование, отбор проб и выделение грибов

ПРИМЕЧАНИЕ: Исследовательские работы проводились в 2022 и 2023 годах, согласно Endes16. В общей сложности на 83 участках посадки чечевицы в девяти районах провинции Йозгат наблюдались случаи увядания, корневой гнили и гнили корневой шейки (Рисунок 1).

  1. Выберите поля чечевицы площадью более 1000м2 в качестве участка отбора проб. Соберите каждый образец, проходя хаотично от границы к центру или середине поля зигзагами, идущими по диагоналям с помощью рамки 1м2 , размещая его случайным образом как минимум в трех случайно выбранных разных точках. Соберите растения чечевицы с симптомами болезни с каждой точки, положите их в бумажные пакеты и передайте в лабораторию для использования в исследованиях по выделению грибов и идентификации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корни и корневая шейка больных растений чечевицы, перенесенные в лабораторию, сначала промывали водопроводной водой, чтобы избавиться от грубых остатков; позже они были подвергнуты поверхностной дезинфекции для выделения грибковых патогенов, как описано в Endes16.
  2. Замочите больные ткани растений в 70% этаноле на 10-15 с, а затем промойте 3 раза по 3 мин в стерильной воде. Подержите их все в 1% гипохлорите натрия (NaOCl) в течение 5 минут и снова промойте 3 раза в течение 5 минут каждый раз стерильной водой.
  3. Высушите влажные растительные ткани на фильтровальной бумаге в стерильном шкафу, чтобы завершить процесс дезинфекции поверхности. После этого продезинфицированные ткани растения разрезать на кусочки длиной 5-10 мм и поместить 4-5 штук на среду КПК, содержащую 0,01% стрептомицина, в чашках Петри (диаметр 90 мм). Поместите чашки Петри в инкубатор в темноте при температуре 25 ± 1 °C на 4-7 дней и наблюдайте за ростом грибка.
    Примечание: Развивающиеся грибковые изоляты очищали методом выделения одиночных спор. С этой целью было модифицировано и использовано исследование, проведенное Choi et al.17 по получению одиночных споровых культур грибов, принадлежащих к Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes и Hyphomycetes.
  4. Для очистки грибковых изолятов следует хранить грибковые изоляты, полученные в конце исследований изоляции, в инкубаторе при температуре 25 ± 1 °C в течение 12 часов флуоресцентного света / 12 часов в темноте в течение 15 дней, чтобы стимулировать образование анаморфотных репродуктивных структур на ОАП.
  5. Взвесьте шпателем около 100 мг грибного мицелия из 15-дневных культур, переложите его в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, а затем тщательно измельчите стерильными пластиковыми пестиками для гомогенизации.
  6. Добавьте 1 мл стерильной воды и сделайте вихрь на 1 минуту, чтобы обеспечить перенос спор в воду. Чтобы отрегулировать количество спор, попадающих в воду, наберите 20 мкл этой смеси с помощью пипетки и проверьте количество спор при 10-кратном увеличении светового микроскопа.
  7. Когда количество спор станет больше желаемого, разбавьте спорово-водную смесь в соотношении 1/10, 1/100 и 1/1000. Обеспечьте смесь, содержащую 4-6 спор, в поле зрения микроскопа.
  8. Возьмите 100 мкл приготовленной споровой суспензии и перенесите ее в чашки Петри диаметром 90 мм, содержащие среду ОАП с добавлением 0,1% стрептомицина. Затем распределите перенесенную суспензию по КПК с помощью шпателя Дригальского.
  9. Подготовленные чашки Петри выдерживать в темноте при температуре 25 ± 1 °C в течение 12-24 часов. В конце этого периода перенесите небольшие кусочки гиф, образованных из одной конидии с петлей инокуляции, в новую чашку Петри, содержащую среду PDA. Каждая культура, полученная из каждой споры, представляет собой отдельную культуру спор. Храните их для использования в тестах на патогенность и морфологической и молекулярной идентификации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основная цель состоит в том, чтобы сохранить грибковые изоляты живыми в течение длительного времени без изменения их морфологии, генетики и вирулентности. Процесс хранения осуществлялся с использованием двух различных методов18,19. Все методы хранения, использованные в данном исследовании, подробно описаны ниже.
    1. Первый способ хранения образцов заключается в следующем. Выращивайте грибковые изоляты на среде PDA при температуре 25 ± 1 °C при 12:12 ч темный: световой в течение 15 дней для получения мицелиевых дисков диаметром 4 мм, которые можно хранить в стерильной воде.
    2. Срезайте диски мицелия (диаметр 4 мм, 10 дисков) пробковым точильщиком из грибных культур, выросших в вышеупомянутых условиях. Перенесите диски мицелия в микроцентрифужные пробирки, содержащие 1 мл стерильной воды. Хранить образцы в микроцентрифужных пробирках в холодильнике при температуре -20 °C в течение 6 месяцев.
    3. Второй способ хранения образцов заключается в следующем. Во-первых, возьмите щепотку чистого грибкового диска из одиночных споровых культур, полученных с помощью петли инокуляции, и перенесите ее в чашки Петри, содержащие КПК с добавлением хлорамфеникола, молочной кислоты, ампициллина, рифампицина, тетрациклина, стрептомицина и т.д.
    4. Выращивать в течение 5-10 дней до процесса хранения при температуре 25 ± 1 °C в течение 12 часов: 12 часов в темноте: светло. Отрежьте и простерилизуйте фильтровальную бумагу общего назначения размером 1 см x 1 см в автоклаве при температуре 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 минут.
    5. Поместите фильтровальную бумагу в новые чашки Петри с такой же или селективной средой. Вырежьте колонии/споры из чистой грибковой культуры и поместите их поверх каждого кусочка.
    6. Укупорьте чашки Петри и поместите их в инкубатор при соответствующих условиях роста (о чем говорилось выше). Грибковые изоляты медленно растут на фильтровальной бумаге. Инкубируйте примерно 15 дней, чтобы обеспечить полную колонизацию.
    7. После спороношения или полного образования колонии на фильтровальной бумаге перенесите отдельные листы бумаги в новую чашку Петри без питательной среды. Позже поместите чашки Петри в инкубатор до полного высыхания фильтровальной бумаги и грибка (примерно 20-30 дней).
    8. После высыхания положите 10 листов фильтровальной бумаги в каждый стерильный бумажный конверт, промаркируйте каждый конверт, положите эти конверты в полиэтиленовые пакеты и храните пластиковые пакеты с конвертами в пластиковом и прозрачном контейнере при температуре -20 °C.
  10. Рассчитайте распространенность чечевичного увядания, корневой гнили и гнили короны в Йозгате по приведенной ниже формуле, учитывая распространенность болезни на каждом поле чечевицы, а затем укажите название района провинции.
    Распространенность заболевания (%) = (а / б) х 100
    где a обозначает количество пораженных полей; b указывает общее количество обследованных полей в округе.
  11. Рассчитайте заболеваемость в соответствии с методом средневзвешенного значения, о котором сообщили Bora и Karaca20. Посчитайте растения в каждом квадрате на поле. Разделите их на больные и небольные растения в каждом квадрате и рассчитайте распространенность болезни по приведенной ниже формуле.
    Распространенность заболевания (%) = (x / y) x 100
    где x обозначает количество больных растений; y обозначает общее количество обследованных растений.
  12. Рассчитайте тяжесть заболевания по шкале 0-4 по шкале Öğüt21, где 0 = симптомы не проявились, 1 = слабо выраженные симптомы у 25% листьев; 2 = умеренные симптомы в 26%-50% листьев; 3 = сильный хлороз и увядание у 51%-75% листьев; и 4 = очень тяжелые симптомы хлороза и увядания или высыхание, осыпание, задержка роста или отмершие листья на более чем 75% растений в том же порядке (Рисунок 2).
  13. Рассчитайте тяжесть заболевания по следующей формуле с полученными значениями шкалы16.
    Тяжесть заболевания (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    где ni количество растений в масштабе; значение масштаба vi; Наибольшее значение шкалы V; N общее количество наблюдаемых растений; i указывает количество классов.

2. Метеорологические данные

  1. Проведение обзорных исследований. Для этого протокола опросы проводились в периоды с мая по июнь 2022 и 2023 годов. Получите значения температуры, относительной влажности и общего количества осадков за период с марта по июль в 2022 году, 2023 году и за долгие годы от Управления провинциальной метеорологии в Йозгате (Таблица 1).

3. Морфологическая идентификация

  1. Сравните культуральные (цвет колонии, воздушный мицелий, скорость роста мицелия) и конидиальные (размеры конидиальности, форма, цвет и количество перегородок) изоляты Fusarium с более ранними исследованиями и предварительно определите виды грибов.
  2. Выберите репрезентативные образцы из групп, которые будут использоваться для морфологической идентификации. Очистите эти образцы в соответствии с методом выделения одиночных спор, как упоминалось выше. В течение этого периода наблюдайте за характеристиками пигментации колоний изолятов Fusarium , а также за микро/макроконидиями и хламидоспоровыми структурами.
  3. Чтобы способствовать образованию микроморфологических структур, таких как микро/макроконидии и хламидоспоры в полученных чистых грибных культурах, инкубируют на ОАП при 25 ± 1 °C и 12 ч: 12 ч темноте: свет в течение 25-30 дней в инкубаторе. Измерьте длину и ширину конидий для каждого изолята Fusarium с помощью световой микроскопии. Кроме того, задокументируйте структуру, форму, цвет и перегородки конидий или без них с помощью светового микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
  4. Основываясь на вышеприведенных наблюдениях, сгруппируйте изоляты Fusarium по видовому уровню, как описано в Leslie and Suerell22.

4. Молекулярная идентификация

Примечание: Общая геномная ДНК изолятов Fusarium была экстрагирована с использованием следующего метода, который был немного модифицирован по сравнению с протоколом Cenis23. ПЦР-анализы и электрофорез изолятов Fusarium проводили по протоколу, описанному Aras and Endes24.

  1. Экстракция геномной ДНК грибов
    1. Из свежей культуры (возрастом 10 дней) изолятов Fusarium , выращенных на ОАП, соскребите 100 мг мицелия стерильным скальпелем и затем перенесите его в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Инкубируйте пробирки при температуре -20 °C в течение ночи.
    2. После ночной инкубации добавьте в пробирки 500 мкл буфера для экстракции ДНК (200 мМ Tris-HCl pH: 8,5, 250 мМ NaCl, 25 мМ ЭДТА, 0,5% додецилсульфата натрия) и измельчите стерильным пластиковым пестиком.
    3. Затем добавьте в пробирки 150 мкл 3М ацетата натрия (NaOAc) pH 5,2 и инкубируйте при -20 °C в течение 30 минут. После этой стадии центрифугируйте пробирки при давлении 4 000 x g в течение 10 минут.
    4. После центрифугирования перенесите 400 мкл надосадочной жидкости в верхней части пробирки в новые пробирки (1,5 мл) и добавьте равный объем изопропанола (2-пропанола). Инкубируйте новые пробирки при температуре -20 °C в течение 30 минут. За это время аккуратно перемешайте трубки 5x или 6x.
    5. Центрифугируйте при давлении 4000 x g в течение 10 минут, чтобы осадить геномную ДНК и отбросить всю жидкость, оставшуюся в пробирках.
    6. Добавьте 1 мл 70% этанола в гранулу геномной ДНК в виде белого или кремового осадка на дне пробирки. Аккуратно перемешайте пробирку вверх и вниз 4-5 раз в течение примерно 1 минуты, сбрасывая весь этанол из пробирок. Затем откройте трубки в ламинарном потоке воздуха на 30 минут, чтобы полностью испарить этанол на грануле ДНК.
    7. Чтобы растворить геномную ДНК и сохранить ее в течение длительного времени, необходимо добавить в пробирки 50 мкл буферного раствора TE (1M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0) и инкубировать пробирки на водяной бане при 65 °C в течение 1 ч. За это время аккуратно перемешайте трубку вверх и вниз 8x-10x. Храните геномную ДНК, растворенную в буферном растворе TE, в морозильной камере при температуре -20 °C для использования в молекулярных исследованиях.
  2. Для ПЦР-исследований используют олигонуклеотидные праймеры ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') для амплификации ITS участка рДНК25. Проводите каждую ПЦР-реакцию с 2,5 мкл 10x ПЦР-буфера, 2,5 мкл MgCl2 (25 мМ), 2,5 мкл dNTP (2 мМ), 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ), 2 мкл матричной ДНК, 0,5 мкл Taq ДНК-полимеразы (1 ед/мкл, Фермантаса) и 14 мкл sQH2O в общем объеме 25 мкл.
  3. Для проведения ПЦР-реакции объемом 25 мкл выполните следующую программу ПЦР при температуре 95 °C в течение 2 мин (начальная денатурация), после чего следует 40 циклов; 95 °C в течение 30 с (денатурация), 55 °C в течение 45 с (отжиг), 72 °C в течение 90 с (растяжение) и 72 °C в течение 5 мин (окончательное растяжение). Электрофорезные продукты ПЦР в течение 1,5 ч при 90 В в 1,5% агарозном геле, приготовленном в 1x TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA) буферном растворе.
    1. Для приготовления буфера ТАЭ для гель-электрофореза растворите 242 г основания Триса в 700 мл стерильной воды; добавьте 57,1 мл ледяной уксусной кислоты; добавьте 100 мл 0,5 М раствора ЭДТА и отрегулируйте объем до 1 л, добавив стерильную воду. Отрегулируйте окончательный pH буфера 1 л 50x TAE до 8,5. Чтобы сделать 1x TAE рабочим буфером, добавьте 49 частей стерильной воды в 1 часть 50x TAE буфера.
  4. Окрасьте гели бромидом этидии с концентрацией 0,5 мкг/мл и визуально осмотрите их, сделав видимыми на УФ-трансиллюминаторе.
  5. Для изучения филогенетических отношений между изолятами возбудителей корневой и корончатой гнили с помощью ПЦР получены последовательности оснований гена ITS, которые были синтезированы двунаправленно (5'-3' и 3'-5') через поставщика. Сравните последовательности оснований с данными генов с веб-сайта NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) и последовательностями оснований гена ITS других изолятов Fusarium в мире с помощью программы Blast. Используйте его для идентификации изолятов на видовом уровне, как описано ниже.
    1. Перейдите на https://www.ncbi.nlm.nih.gov сайт. Нажмите на вкладку BLAST в разделе Популярные ресурсы.
    2. Нажмите на вкладку Nucleotide BLAST в новом окне. В разделе Введите последовательность запроса в новом окне введите базовые последовательности в формате Fasta и напишите название исследования в разделе Название должности.
    3. Затем отметьте Стандартные базы данных (nr и т. д.) на вкладке База данных в разделе Выберите набор поиска внизу.
    4. Отметьте галочкой Highly similar sequences (megablast) на вкладке Optimize for в разделе Program Selection и нажмите на вкладку BLAST внизу страницы.
  6. Используйте программу филогенетического анализа MEGA 11 для определения филогенетического родства между изолятами Fusarium . Выровняйте последовательности оснований с помощью программы ClustalW и создайте генетические генеалогические деревья изолятов в соответствии с максимальной экономией для гена ITS26.
    1. Чтобы скачать программное обеспечение Mega, перейдите на веб-сайт https://www.megasoftware.net и установите программное обеспечение Mega. Программное обеспечение MEGA предоставляется БЕСПЛАТНО для использования в научных исследованиях и образовании.
    2. Сначала сохраните последовательности на рабочем столе в виде файла Блокнота (.txt) в формате FASTA. Запустите программу Mega и нажмите на вкладку ALIGN . Нажмите « Редактировать/Построить выравнивание» в окне. Затем отметьте флажок «Создать новую трассу » в новом окне и нажмите «ОК» для подтверждения.
    3. Нажмите на вкладку ДНК. Исключите пункт 1. Последовательность, которая автоматически появится в окне, и перейдите в раздел Редактировать файл, затем нажмите на Вставить последовательность из вкладки Файл. Откройте файл «Блокнот» (.txt), который содержит последовательности и находится на рабочем столе.
    4. На этом этапе на экране появляются все последовательности. Сначала нажмите на любую последовательность , которая появится на экране, затем отметьте все последовательности с помощью CTRL + A. Откройте файл Alignment и нажмите Align by Clustal W оттуда, а затем нажмите OK , чтобы запустить программу с настройками по умолчанию.
    5. Изучив различия в выравнивании последовательностей, перейдите в файл данных, нажмите на Филогенетический анализ , а затем нажмите на Нет в чекбоксе в окне, чтобы узнать, синтезируют ли последовательности белки или нет. Наши последовательности не синтезируют белки, потому что они принадлежат к области ITS.
    6. Возврат в главное окно программного обеспечения Mega. Нажмите на Phylogeny и выберите Construct/Test Maximum Parsimony Tree(s). В новом окне выберите Bootstrap Method для теста Phylogeny и введите значения Bootstrap 1,000 для проверки силы ветви. На вкладке Gaps/missing Data Treatment выберите Partial Deletion, выберите Subtree-pruning-Regrafting (SPR) в качестве метода поиска MP и нажмите OK для подтверждения операций.
    7. Дождитесь результата анализа, который покажет филогенетическое дерево.

5. Тест на патогенность

  1. Используйте четыре изолята для изучения патогенности для каждого репрезентативного вида из видов Fusarium , которые были идентифицированы молекулярными методами. Проводите исследования патогенности при температуре 24 °C, 16 ч флуоресцентного света/8 ч темном фотопериоде, при влажности 65% в помещении с кондиционером.
  2. Посейте семена чечевицы в черные пластиковые флаконы с 45 отверстиями диаметром 5 см. Выдержите каждый флакон в 1% гипохлорите натрия в течение 3 минут, а затем промойте стерильной дистиллированной водой 3 раза. Просушите семена в стерильном шкафу в течение 24 часов и посейте по одному семени в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семена чечевицы сорта Kayı 91, чувствительные к заболеванию, использовались во всех испытаниях на патогенность6. В качестве метода инокуляции использовался метод погружения рассады27.
  3. Инкубировать чистые культуры каждого изолята в КПК при температуре 24 °С в течение 7-10 дней. Колонии, выращенные из исходной культуры, соскребают с поверхности среды с помощью шпателя и готовят спорово-мицелиевую суспензию с использованием стерильной дистиллированной воды.
  4. Удалите крупные остатки из суспензии путем фильтрации через 4-слойную марлю и отрегулируйте концентрацию спор/мицелия до 1 х 106 спор/мл с помощью гемоцитометра.
  5. После этого этапа выкорчевывайте корни ранее выращенной в флаконах рассады, когда у них появится 2-3 настоящих листочка. Промойте в водопроводной воде и слегка травмируйте корни стерильной иглой. Погрузите эти сеянцы в приготовленную спорово-мицелиевую суспензию на 3 минуты, а затем пересадите в пластиковые флаконы, содержащие стерильную смесь грунт/торф (2:1; v/v).
  6. Для рассады, используемой в качестве контроля, выкорчевывайте их корни, травмируйте их, а затем высаживайте, погружая только в стерильную воду. Проведите оценку патогенности через 3 недели после процесса инокуляции по шкале от 0 до 4.
  7. После того, как рассчитанные значения тяжести заболевания были подвергнуты угловому преобразованию, полученные значения подвергнуть дисперсионному анализу и оценить различия между средними по критерию HSD Тьюки (p = 0,05). Тяжесть заболевания: изоляты с 0%-15% оценивали как имеющие очень низкую вирулентность (ЛЖ), изоляты с 16%-35% оценивали как низкую вирулентность (ЛЖ), изоляты с 36%-50% оценивали как умеренную вирулентность (O), изоляты с 51%-70% оценивали как высоковирулентные (VV), изоляты с 71%-100% оценивали как очень высокую вирулентность (VV), а изоляты без симптомов заболевания оценивали как сапрофитные или эпифитные изоляты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение параметров заболевания
В общей сложности было оценено 83 посевных участка чечевицы в девяти различных районах Йозгата с точки зрения увядания, корневой гнили и симптомов гнили короны, охватывающих площадь 1,1984 x 106 м2 (Таблица 2). Симптомы увядания или корневой гнили встречались на всех полях. Тем не менее, заболеваемость увяданием и корневой гнилью в Йозгате составила 16,9%, а в Соргунском и Сарыкайском районах – 3...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Известно, что фузариозное увядание приводит к серьезным экономическим потерям урожая в некоторых частях мира31. Болезнь была впервые зарегистрирована в Венгрии32, а затем во многих странах, таких как Египет, Индия, Мьянма, Непал, Пакистан, Турция, Сирия и США33. Kumar et al.34 сообщили о широком распространении чечевичного увядания, корневой гнили и гнили корневой шейки с сообщениями ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Центром координации проектов и исследований Университета Бозок, подразделение BAP с номером проекта FÇD-2022-1096. Это исследование является частью докторской диссертации Севим Атмака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(S)-молочная кислотаMerck100366использовалась в качестве антибиотика в исследованиях.
2-пропанолMerck109634используется в молекулярных исследованиях.
Регулируемый микроавтоматический дозатор (0,1-2,5 &; L)Eppendorf ResearchLB. EP.3123000012Используется для измерения небольших объемов жидкостей.
Регулируемый набор микроавтоматических пипеток (2 – 20 & микро; л, 20 – 200 &микро; l, 100 – 1.000 & микро; l)Eppendorf ResearchLB. EP.4924000916Используется для измерения небольших объемов жидкостей.
АгарМерк110453Для использования в изготовлении грибных сред.
АгарозаСигма-Олдрич18300012Для использования в приготовлении геля при электрофорезе.
длякондиционированияиспользовалось для выращивания растений в контролируемых условиях.
АмписилинSigma-AldrichA9393использовался в качестве антибиотика в исследованиях.
Аналитические прецизионные весыShimadzu ATX224использовались для взвешивания твердых материалов, использованных в исследовании.
Автоклавный стерилизаторZealway GF-120DRОн использовался для стерилизации твердых и жидких материалов на каждом этапе исследования.
Бинокулярный микроскопLeica DM750Для использования в морфологической диагностике.
Шкаф биологической безопасностиHFsafe Class II A2Для обеспечения безопасности рабочей зоны, пользователя, окружающей среды и эксплуатации.
ЦентробежныйDLAB DM1424LB. DL.903001124Используется для разделения частиц в образце на основе их формы, размера и плотности
ХлорамфениколSigma-Aldrich220551Использовался в качестве антибиотика в исследованиях.
Пробковый наборСигма-ОлдричZ165220его использовали для взятия проб из грибной культуры в чашках Петри.
Защитное стекло и предметное стеклоISOLAB075.01.006 / 075.02.005Использовалось в процессе подготовки к микроскопическим исследованиям.
D(+)-моногидрат глюкозыMerck108342Для использования в производстве грибковых сред.
DFC450 с цифровой камеройLeicaDigital для микроскопа с интерфейсом c-mount и с 5-мегапиксельной ПЗС-матрицей.
Бинокулярный микроскоп Dm750 LeicaMIC5246использовалась для морфологической идентификации грибов.
ДНК-гель электрофорезthermo fisher scientificB2-UVT
ДНК-гель загружающий краситель (6x)Thermo ScientificR0611Для использования в молекулярной диагностике.
Смесь dNTPThermo ScientificR0192Используется в молекулярных исследованиях.
Мастер-смеси для ПЦР Dreamtaq (2x)Thermo ScientificK1082Для использования в молекулярной диагностике.
Дригальский шпательISOLAB082.03.001Применялся для соскабливания и разбрасывания грибковых культур, выращенных в чашках Петри.
Edta Thermo Scientific17892Для использования в молекулярной диагностике.
ЭтанолMerck100983используется в молекулярных исследованиях и исследованиях по дезинфекции поверхностей.
Бромид этидияSigma-AldrichE7637Используется для окрашивания ДНК в гелях во время гель-электрофореза.
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-AldrichE6758Используется в молекулярных исследованиях.
Фильтровальная бумагаISOLAB107.58.158Используется при исследованиях стоковых культур.
Шкаф для принудительной сушки воздухаZHICHENG ZXDS-A-1090Для использования в инкубационных процессах.
Вытяжной шкафElektromag EM1201LB. ЭМ. EM1201Он использовался для борьбы с вредными химическими парами, газами и пылью.
Гелевая система визуализацииSyngene G:BOX Chemi XX6Для использования в молекулярной диагностике.
Лестница для ДНК Generuler 50 b.pThermo ScientificSM0372Для использования в молекулярной диагностике.
Ледяная уксусная кислотаMerck1005706используется в молекулярных исследованиях.
ГлицеринMerck104094Для использования в поголовье культуры грибов.
ЛанцетISOLAB048.50.002Используется для удаления больных тканей из образцов растений.
Хлорид магнияSigma-Aldrich814733используется в молекулярных исследованиях.
Измерительная лентаISOLAB016.07.500Используется для измерения объемов жидкости.
Микроцентрифужные пробиркиISOLAB0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003Используются для хранения различных объемов жидкостей.
ПЦР-пробиркаISOLAB123.01.002Использовалась для сдачи ДНК-микса в ПЦР-исследованиях.
Чашки ПетриISOLAB120.13.090Для использования при выращивании грибных культур.
Наконечники для пипетокISOLAB005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004Для переноса объемов жидкости используются в анализах.
Полиэтиленовый пакетISOLAB039.30.005использовался для транспортировки образцов в лабораторию.
Пластиковый горшокToXAиспользовался для выращивания растений.
Плоскогубцы, зажимыISOLAB048.08.130Его использовали для вложения фильтровальной бумаги в конверты после того, как грибок вырос в чашке Петри.
Фарфоровый растворISOLAB038.02.150Применялся для измельчения грибкового мицелия.
Картофельный декстроза агарCondalab1022Для идентификации и культивирования и выявления грибов.
Система чистой водычеловека КОРПОРАЦИЯLT. ХК. NHP009использовался для приготовления и анализа растворов на протяжении всех исследований.
Холодильник (+4° С/-20 °°; В)VestelДля использования при хранении исходных материалов.
Рифампицинсигма-Олдрич557303использовался в качестве антибиотика в исследованиях.
Ацетат натрияMerck106268используется в молекулярных исследованиях.
Хлорид натрияMerck1064041000используется в молекулярных исследованиях.
Додецилсульфат натрияSigma-Aldrich436143используется в молекулярных исследованиях.
Раствор гипохлорита натрияMerck105614используется для дезинфекции поверхностей.
ШпательISOLAB047.33.210Применялся для выскабливания грибной культуры, растущей в чашках Петри.
Стрептомицен сульфатBioShop CanadaSTP101Для предотвращения контаминации при культивировании грибковых культур.
Teksoll extra pureTekkimTK.200650Для использования в качестве дезинфицирующего средства на всех этапах работы.
ТетрасиклинSigma-AldrichT3258использовался в качестве антибиотика в исследованиях.
Термоамплификатор PCR Bio? Rad T100Для использования в геномном анализе.
Thoma lamISOLAB075.03.002Для использования при подсчете спор.
Tris HCLRoche10812846001используется в молекулярных исследованиях.
TrizmaSigma-AldrichT1503Используется в молекулярных исследованиях.
Tween 80Merck 822187Для использования в споровом растворе при испытаниях на патогенность.
Вихревой смеситель вортексVelp WIZARDLB. ВЛП. F202A0175Используется для смешивания веществ в жидких объемах.
Водяные баниMemmert WNB 221018-5702Использовались во время инкубации в исследованиях по экстракции ДНК.
Помещение воздуха : , камерой .

Ссылки

  1. Skrzypkowski, W., Kiełkowska, A. Current status of haploidization in cool-season grain legume crop species. Agriculture. 14 (7), 1031(2024).
  2. Liber, M., Duarte, I., Maia, A. T., Oliveira, H. R. The history of lentil (Lens culinaris subsp. culinaris) domestication and spread as revealed by genotyping-by-sequencing of wild and landrace accessions. Front Plant Sci. 12, 628439(2021).
  3. FAOSTAT. , Food and Agriculture Organization of the United Nations. Database on Crops https://www.fao.org/faostat/en/#data (2022).
  4. TÜİK. Agricultural statistics report. , Turkish Statistical Institute. Türkiye. (2023).
  5. Baxevanos, D., et al. Lentil cultivar evaluation in diverse organic mediterranean environments. Agronomy. 14 (4), 790(2024).
  6. Aydın, M., Koç, M., Sağır, A. Investigations on determination of soilborne fungal pathogens causing root rot, crown rot and wilt on lentil in Southeast Anatolia Region. Plant Protect Bulletin. 44 (1), 93-103 (2004).
  7. Zitnick-Anderson, K., et al. Fusarium species associated with root rot of lentil (Lens culinaris) in North Dakota. Plant Health Prog. 22 (4), 524-528 (2021).
  8. Kushwaha, D. A. A research book of seed mycoflora of chickpea (Cicer arietinum). , books.google.com (2020).
  9. Ekwomadu, T. I., Mwanza, M. Fusarium fungi pathogens, identification, adverse effects, disease management, and global food security: A review of the latest research. Agriculture. 13 (9), 1810(2023).
  10. Jiskani, A. M., et al. A destructive disease of lentil: Fusarium wilt of lentil. Plant Arch. 21 (1), 2117-2127 (2021).
  11. Alisaac, E., Mahlein, A. K. Fusarium head blight on wheat: biology, modern detection and diagnosis and integrated disease management. Toxins. 15 (3), 192(2023).
  12. Yang, F., et al. Effects of rhizosphere microbial communities on cucumber Fusarium wilt disease suppression. Microorganisms. 11 (6), 1576(2023).
  13. Kumari, N., Katoch, S. Wilt and root rot complex of important pulse crops: their detection and integrated management. Management of Fungal Pathogens in Pulses. Fungal Biology. , Springer. Cham. (2020).
  14. Köppen, W., Geiger, R. Handbuch der klimatologie. , Gebrüder Borntraeger. Berlin. (1936).
  15. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 5th Edn, Elsevier Academic Press. Amsterdam. (2005).
  16. Endes, A. Occurrence and distribution of Chickpea root rot and wilt disease in Yozgat Kırşehir and Kırıkkale Provinces. Çukurova J Agri Food Sci. 38 (2), 284-298 (2023).
  17. Choi, Y. W., Hyde, K. D., Ho, W. H. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 29-38 (1999).
  18. Baskarathevan, J., Jaspers, M. V., Jones, E. E., Ridgway, H. J. Evaluation of different storage methods for rapid and cost effective preservation of Botryosphaeria species. New Zealand Plant Protect. 62, 234-237 (2009).
  19. Dikilitaş, M., Katırcıoğlu, Z., Altınok, H. Latest developments and methods on long-term storage, protection, and recycle of fungi and fungal material. JAgric Fac HR U. 15 (1), 55-69 (2011).
  20. Bora, T., Karaca, İ Measurement of disease and damage in cultivated plants. , Ege University Press. Turkey. (1970).
  21. Öğüt, E. Pathogenic and molecular characterization of some Fusarium spp. causing root rot and wilt on lentil with determination of variety reactions in south eastern Anatolia. , Mustafa Kemal University, Institute of Science and Technology. (2015).
  22. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium Laboratory manual. , Blackwell Publishing. (2006).
  23. Cenis, J. L. Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplification. Nuc Acids Res. 20 (9), 2380(1992).
  24. Aras, S., Endes, A. Effect of Fusarium oxysporum infection on strawberry under calcium, iron, and zinc deficiency conditions. Zemdirbyste-Agri. 110 (1), 71-78 (2023).
  25. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protoc A Guide Metho Appl. , 315-322 (1990).
  26. Endes, A. Characterization and pathogenicity of Botryosphaeriaceae species associated with Gummosis, Dieback, Trunk and Branch Cankers of almond trees in Türkiye. J Agri Sci. 30 (4), 698-711 (2024).
  27. Gordon, T. R., Okamoto, D., Jacobson, D. J. Colonization of muskmelon and non-susceptible crops by Fusarium oxysporum f. sp. melonis and other species of Fusarium. Phytopathology. 79 (10), 1095-1100 (1989).
  28. Xu, X., et al. Fusarium species associated with maize leaf blight in Heilongjiang Province, China. J Fungi. 8 (11), 1170(2022).
  29. Fonseca-Guerra, I. R., Chiquillo-Pompeyo, J. C., Benavides Rozo, M. E., Díaz Ovalle, J. F. Fusarium spp. associated with Chenopodium quinoa crops in Colombia. Sci Rep. 12 (1), 20841(2022).
  30. Khan, M. F., et al. First report of damping-off and seedling rot of Hemp (Cannabis sativa) caused by Fusarium solani in North Dakota, U.S.A. Plant Dis. 107 (1), 232(2023).
  31. Chaudhary, R. G., Saxena, D. R., Dhar, V., Singh, R. K., Namdev, J. K. Prevalence of wilt-root rot and their associated pathogens at reproductive phase in lentil. Arch Phytopathol Plant Protect. 43 (10), 996-1000 (2010).
  32. Fleischmann, R. Some observations on Maize smut in Hungary. Pflanzenbau. 14 (5), 199-206 (1937).
  33. Bedasa, T. Distribution and management of Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. lentis) of lentil (Lens culinaris Medikus) in Central Highlands of Ethiopia. , Haramaya University Doctoral dissertation. (2018).
  34. Kumar, S., et al. Vascular wilt disease of lentil: A review. J Lentil Res. 4, 1-14 (2010).
  35. Chenari, S., Abbasi, S., Chehri, K. Phylogeny and host specificity of Fusarium solani species complex isolated from chickpea, lentil and common bean. Arch Phytopathol Plant Protect. , 1-15 (2024).
  36. Rathod, A., et al. Isolation of causal organism of wilt and collar rot of lentil and its pathogenicity tests. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 10 (12), 276-282 (2021).
  37. Hayit, T., Endes, A., Hayit, F. The severity level classification of Fusarium wilt of chickpea by pre-trained deep learning models. J Plant Pathol. 106 (1), 93-105 (2024).
  38. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (4), 414-430 (2012).
  39. Fletcher, J. D., Broadhurst, P. G., Bansal, R. K. F. avenaceum: A pathogen of lentil in New Zealand. New Zealand J Crop Horticultural Sci. 19 (2), 207-210 (1991).
  40. Al Ahmad, M., Mouselli, N. Wilt and root rot of lentis. Lens. 14 (1/2), 27-31 (1987).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Виды Fusariumпочвенные патогеныизоляция грибовПЦР-анализморфология колонийзаболеваемостьгенетические связи

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.