Method Article

Простой и эффективный метод тестирования иммуномодулирующих агентов для получения толерогенных дендритных клеток из моноцитов CD14+ человека

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем процедуру оценки способности фармакологических агентов генерировать толерогенные дендритные клетки из наивных дендритных клеток, полученных из моноцитов, in vitro и подтверждать их активность путем аутологичной регуляторной генерации Т-клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Толерогенные дендритные клетки (толДК) представляют собой подмножество дендритных клеток (ДК), которые, как известно, влияют на наивные Т-клетки в направлении фенотипа регуляторных Т-клеток (Treg). В настоящее время TolDC исследуются в качестве терапии аутоиммунных и трансплантационных препаратов, как в качестве клеточной терапии, так и метода индуцирования толDC из эндогенных DC. На сегодняшний день, однако, количество известных агентов, индуцирующих толДК из наивных ДК, относительно невелико, и их способность генерировать Tregs in vivo была непостоянной, особенно терапии, которая индуцирует толДК из эндогенных ДК. Это дает возможность исследовать новые соединения для получения допусков.

В данной статье мы описываем метод тестирования новых иммуномодулирующих соединений на моноцитарных ДК (moDCs) in vitro и валидации их функциональности для генерации аутологичных Tregs. Во-первых, мы получаем PBMC и выделяем моноциты CD14+ и CD3+ Т-клетки с помощью коммерчески доступных наборов для магнитной сепарации. Затем мы дифференцируем моноциты в moDC, обрабатываем их установленным иммуномодулятором, таким как рапамицин, дексаметазон, IL-10 или витамин D3, в течение 24 ч и проверяем их изменение толерогенных маркеров в качестве валидации протокола. Наконец, мы совместно культивируем индуцированные толДК с аутологичными Т-клетками в присутствии анти-CD3/CD28 стимуляции и наблюдаем изменения в популяциях Treg и пролиферации Т-клеток. Мы предполагаем, что этот протокол будет использоваться для оценки эффективности новых иммуномодулирующих агентов для перепрограммирования уже дифференцированных ДК в сторону толДК.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные клетки (ДК) являются важнейшими медиаторами между врожденным и адаптивным иммунитетом. ДК, которые в основном находятся в слизистых оболочках, коже и лимфоидной ткани, являются основными антигенпрезентирующими клетками (АПК)1. ДК поглощают чужеродные белки, обрабатывают и представляют их на белках основной гистосовместимости (МНС) наивным Т-клеткам. ДК специфически экспрессируют белки MHC класса II, такие как человеческий лейкоцитарный антиген-DR (HLA-DR) у человека. Состояние активации ДК при воздействии антигена имеет решающее значение для нисходящего ответа Т-клеток2. Незре....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все образцы мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC) были получены из Центра иммунологии человека Университета Пенсильвании от обезличенных доноров с предварительного одобрения Институционального наблюдательного совета (IRB) Университета Пенсильвании с согласия пациента.

Дополнительно: В то время как в этом методе мы использовали свежевыделенные PBMC, полученные из академической лаборатории, PBMC могут быть выделены как из цельной крови, так и из продуктов крови, обогащенных лейкаферезом. Мы рекомендуем использовать метод центрифугирования с градиентом плотности, так как э....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали протокол для PBMC человека, выделили CD3+ Т-клетки и CD14+ моноциты с помощью коммерчески доступных наборов для магнитной сепарации, дифференцировали моноциты на CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDCs с помощью GM-CSF и IL-4, обрабатывали их в течение 24 ч и совместно культивировали с аутологичными Т-клетками со стимуляцией анти-CD3/CD28 в течение 72 ч. Экспериментальная схема показана на рисунке 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы описываем надежный и универсальный метод оценки функциональности иммуномодулирующих агентов для индуцирования толДК из моДК и валидации их функциональности для генерации Tregs из аутогенных Т-клеток ex vivo. В этом протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, моноциты печально известны своей чувствительностью и должны быть получены из свежих, а не ранее замороженных PBMC для достижения наилучших результатов. Моноциты должны быть выделены как можно скорее .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Центр иммунологии человека (HIC) Университета Пенсильвании за предоставление свежих человеческих PBMC от доноров. HIC частично поддерживается стандартами NIH P30 AI045008 и P30 CA016520.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10 & микро; L Фильтрованные наконечники для пипетокVWR76322-158Общая клеточная культура
1,5 мл Центрифужная пробиркаVWR77508-358Общая клеточная культура
10 мл Серологическая пипеткаVWR414004-267Общая клеточная культура
100-1000 &; L Наконечники для пипеток с фильтромVWR76322-164Общая клеточная культура
15 мл Коническая трубкаVWR77508-212Общая клеточная культура
20-200 &; L Фильтрованные наконечники для пипетокVWR76322-160Общая клеточная культура
2-меркаптоэтанолMP Биомедицинская194834Т-клеточная культура
50 мл Коническая трубкаVWR21008-736Общая клеточная культура
60 x 15 мм Чашка, Нунклон ДельтаТермо Фишер150326Общая клеточная культура
96 Лунка Коническая (V) нижняя пластина, необработанная поверхностьТермо Фишер277143Общая клеточная культура
96 лунок Плоскодонная пластинаThermo Fischer161093Общая клеточная культура
APC/Cyanine7 античеловеческий CD272 (BTLA) АнтителоBiolegend344518Проточная цитометрия
Attune NxT (красный/синий лазер, 7 каналов)Thermo FischerA24863Проточная цитометрия
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Культивирование
моноклонального антитела CD14 (61D3), ПЭThermo Fischer12-0149-42Проточная цитометрия
CD1c Моноклональное антитело (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Проточная цитометрия
CD209 (DC-SIGN) Моноклональное антитело (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Проточная цитометрия
CD25 Моноклональное антитело (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Проточная цитометрия
CD274 (PD-L1, B7-H1) Моноклональное антитело (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Проточная цитометрия
CD4 Моноклональное антитело (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Проточная цитометрия
CD40 Моноклональное антитело (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Проточная цитометрия
CD40 Моноклональное антитело (5C3), проточная цитометрия APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42
Моноклональное антитело CD69 (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Проточная цитометрия
CD86 Моноклональное антитело (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Проточная цитометрия
Моноклональное антитело CD8a (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Проточная цитометрия
Коническое дно (V-образный колодец) 96-луночный планшетThermo Fischer2605проточная цитометрия
криогенные флаконы, 2 млThermo Fischer430488Т-клеточная культура
диметилсульфоксид (ДМСО), секвенирование классаThermo Fischer20688общая клеточная культура
DPBSThermo Fischer14200166общая клеточная культура
EasySep Набордля выделения моноцитов человекаТехнологии стволовых клеток19359Разделение клеток
EasySep Набор для изоляции Т-клеток человекаТехнологии стволовых клеток17951Разделение клеток
EasySep MagnetТехнологии стволовых клеток18000Разделение клеток
EDTAThermo FischerAIM9260GОбщая клеточная культура
Falcon Круглодонные полистирольные трубки, 5 млТехнологиистволовых клеток38025
Ингибитор связывания рецепторов разделения клеток Поликлональные антителаThermo Fischer14-9161-73Проточная цитометрия
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаThermo FischerA5670701Общая клеточная культура
Поправляемая жизнеспособность краситель eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Проточная цитометрия
Foxp3 / Набор буферов для окрашивания транскрипционного фактораThermo Fischer00-5523-00Проточная цитометрия
FOXP3 Моноклональное антитело (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Проточная цитометрия
HBSSThermo Fischer14170-112Общая клеточная культура
Термоинактивированная фетальная бычья сывороткаThermo FischerA5670801общей клеточной культуры
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Культура
HLA-DR Моноклональное антитело (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Проточная цитометрия
человека CD3/CD28/CD2 Т-клеточный активаторStemCell Technologies10970Т-клеточная культура
человека GM-CSF Рекомбинантный белокThermo Fischer300-03moDC Клеточная культура
человека IL-10 ELISA Kit, высокочувствительныйThermo FischerBMS215-2HSЭлиза
IL-4 человека, рекомбинантный белок животного происхожденияThermo FischerAF-200-04moDC Клеточная культура
человека PBMC (свежевыделенный)UPПенн HICN/A
Клетки человека TNF альфа ИФА НаборThermo FischerBMS223-4ИФА
Световой микроскоп (DMi1)Люсия391240Общая клеточная культура
Липополисаккарид (ЛПС)Invivogentlrl-eblpsmoDC Клеточная культура
LIVE/DEAD Фиксируемый ближний инфракрасный набор для окрашивания мертвых клетокThermo FischerL34975Проточная цитометрия
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)Thermo Fischer11140050Т-клеточная культура
пенициллин-стрептомицин (100x)Thermo Fischer15140122общий контроллер пипеток для клеточных культур
VWR77575-370Общая клеточная культура
рапамицин, 98+%ThermoFischerJ62473. MFmoDC Клеточная культура
RPMI 1640 с глутамаксомThermo Fischer61870-036Общее разделение клеточных культур
Буферныетехнологии стволовых клеток 20144Разделение клеток
Коктейль для стимуляции Т-клеток (500x)Thermo Fischer00-4970-93Т-клеточная культура
UltraComp eBead Plus Компенсационные бусиныThermo Fischer01-3333-41Flow
Набор вариабельных пипетокFischer Scientific05-403-152Общая клеточная культура
для цитометрии

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles