Методическая статья

В лицо Криосекция сетчатки мыши для многомерного пространственного молекулярного анализа

DOI:

10.3791/68171

⸱

8 июля 2025 г.

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сетчатка демонстрирует сложную пространственную организацию по всей своей ламинарной структуре. Современные методы пространственной транскриптомики и секвенирования требуют срезов тканей толщиной < 20 мкм, что ограничивает их применимость в исследованиях сетчатки. Этот метод криосекции позволяет получить тонкие срезы сетчатки мыши, сохраняя при этом плоские пространственные отношения, что позволяет проводить всестороннее молекулярное картирование пластинок.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сложная ламинарная структура сетчатки представляет собой серьезную проблему для комплексного пространственного молекулярного картирования. Современные методы исследования архитектуры тканей и молекулярных взаимодействий ограничены техническими ограничениями, которые ставят под угрозу пространственные отношения или ограничивают молекулярное профилирование. Существующие методы, такие как поперечные срезы, цельные препарирования, химические или механические диссоциации и толстые срезы на лице , либо нарушают целостность тканей, либо теряют критический пространственный контекст, либо, чаще всего, просто несовместимы с платформами пространственного секвенирования высокой размерности.

В этом исследовании представлен метод криосекции, который позволяет получить тонкие (<20 мкм) срезы на лице , сохраняя при этом пространственные отношения, необходимые для картирования распределения клеток сетчатки. Метод поддерживает целостность РНК и тканевую архитектуру, создавая при этом срезы, совместимые с высокопроизводительными платформами молекулярного анализа. Целостность РНК сохраняется благодаря тому, что этот метод разрезает свежезамороженную ткань, которую производители пространственных транскриптомных платформ официально поддерживают относительно постфиксированной ткани. Мы проверяем этот подход с использованием нескольких методов молекулярного профилирования, демонстрируя успешную интеграцию как с ручной гибридизацией РНК in situ (12 мишеней), так и с пространственным секвенированием ксения (300 мишеней). Этот метод последовательно сохраняет тканевую архитектуру во всех образцах, сохраняя при этом качество РНК, подходящее для этих чувствительных молекулярных приложений.

Этот методологический прогресс позволяет проводить новые исследования распределения типов клеток сетчатки, молекулярных градиентов по пластинкам и пространственных аспектов патологии сетчатки. Универсальность метода и его совместимость с современными платформами пространственной биологии обеспечивают основу для всестороннего молекулярного картирования сложной клеточной организации сетчатки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейроны сетчатки развили пространственные топографии, которые облегчают обработку информации, что у многих видов приводит к грубой специализации, такой как ямки, центральная область и полосы 1,2,3. В отличие от хорошо изученного разнообразия распределения фоторецепторов, пространственная специализация выхода сетчатки, образованной ганглиозными клетками сетчатки (РГК), менее ясна. Для большинства видов пространственное распределение РГК совершенно неизвестно. Даже для мыши, которая, возможно, является одной из наиболее изученных моделей зрительной функции позвоночных, менее трети подтипов РГК были картированы с помощью традиционных методов, таких как иммуногистохимия2. Эти методы не работают, потому что большинство подтипов РГК не имеют специфического генетического маркера. Вместо этого дляточной классификации RGC с помощью секвенирования РНК одиночных клеток 5,6,7 требуется молекулярная информация более высокой размерности.

Информация о распределении РГК важна, так как топографии, наблюдаемые у мышей, демонстрируют четкую экологическую корреляцию между размещением РГК и зрительной функцией. Наиболее ярким примером является пространственная организация РГК ɑON-S, которые группируются в височной сетчатке. Эта область получает образ жертвы8 во время охотничьего поведения9. Также хорошо известно, что подтипы РГК по-разному восприимчивы к заболеванию10, а некоторые распространенные заболевания, такие как глаукома, имеют пространственный компонент их прогрессирования 11,12. Таким образом, важный вопрос, стоящий перед этой областью, заключается в следующем: какова пространственная организация подтипов RGC, когда они застилают сетчатку1? Этот пробел в знаниях в настоящее время ограничивает понимание других визуально контролируемых моделей поведения и заболеваний.

Основное внимание в настоящем методе уделяется устранению этих пробелов в молекулярных знаниях с помощью подхода криосекции enface , который сохраняет пространственные отношения и позволяет проводить молекулярный анализ с высоким разрешением. Современные платформы пространственного секвенирования, такие как Xenium от 10X, представляют собой революционный прогресс в молекулярном профилировании, предлагая беспрецедентное понимание организации тканей и клеточных взаимодействий. Тем не менее, эти платформы, наряду с методами более низкого уровня сложности, такими как РНК-скоп, и методами пространственного секвенирования с штрих-кодированием, такими как Visium, имеют важное техническое ограничение: они требуют срезов ткани тоньше 20 мкм. Это требование представляет собой особую проблему для ткани сетчатки, толщина которой обычно составляет 200 мкм.

До настоящего времени исследователи в основном полагались на поперечные сечения при применении этих технологий к тканям сетчатки13. В то время как поперечные срезы эффективно выявляют молекулярные отношения в ядерных и плексиформных слоях в контексте вертикальных цепей, они менее пригодны для захвата более широкого пространственного распределения клеток сетчатки, котороетрадиционно обнаруживается при составлении целых гор. Недавние попытки разрезания на лицевой поверхности были ограничены ограничениями по толщине сечения, при этом в исследованиях сечения были достигнуты только 50 мкм, что на14 толщин для современных платформ молекулярного анализа с высоким уровнем сложности. Другие исторические подходы, которые были применены для изучения отдельных пластинок сетчатки, но несовместимы с современными методами пространственного секвенирования, включают ферментативное пищеварение в сочетании с механической диссоциацией15,16 или только механическую диссоциацию 17,18,19,20. Здесь мы представляем новую технику криосекции, специально разработанную для тонкой, изогнутой ткани сетчатки, которая преодолевает эти ограничения. Вкратце, наш метод включает в себя экстракцию задней камеры глаза, создание рельефных разрезов через сетчатку и склеру, уплощение ткани внутренней сетчаткой на фоне покровного стекла, встраивание ткани в ОКТ и, наконец, криосекцию от наружной к внутренней сетчатке (рис. 1). Наш метод поддерживает пространственные отношения, создавая участки, достаточно тонкие (<20 мкм) для инструментов пространственной биологии высокой размерности, что подтверждается успешной реализацией как с помощью ручного РНК-скопа (12 мишеней), так и с помощью автоматизированной платформы Xenium (300 мишеней), демонстрируя совместимость на различных уровнях сложности молекулярного анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с одобрением и одобрением Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) и соответствующими институциональными руководящими принципами, одобряющими эти методы, под надзором Университета Колорадо. Все шаги, связанные с использованием животных и эвтаназией, должны соответствовать местным правилам и разрешениям на проведение экспериментов. Все мыши содержались со стандартным уходом в аккредитованном ветеринарном учреждении со свободным доступом к пище и воде. Этот метод криосекции на лице основан на стандартных методах диссекции сетчатки, оптимизированных для мышей C57BL/6. Для разработки этой методики было использовано около 150 мышей обоего пола в возрасте от 6 недель до 2 лет. Окончательная методика, описанная здесь, имеет коэффициент успеха примерно 95% независимо от демографических характеристик мышей. Обратите внимание, что если температура не указана для шага, ожидается температура в помещении примерно 20-25 °C. Растворы без указанной температуры будут работать при охлаждении, поэтому диапазон рабочих температур для растворов составляет 4-25 °C.

1. Вскрытие

  1. Обезболите мышь изофлураном и подтвердите анестезию с помощью щипки пальца ноги или следуйте местным правилам и нормам для индуцирования и подтверждения анестезии, поскольку другие методы также подходят.
  2. Усыпите мышь при шейном вывихе: одной рукой закрепите голову мыши, а другой — основание хвоста, затем потяните в противоположных направлениях. Провести вторичную эвтаназию путем обезглавливания.
  3. Заклеймите височный полюс глазного яблока на роговице, чтобы сохранить ориентацию и создать слабое место для диссекции (Рисунок 2B и Рисунок 3A).
  4. Погрузите глобус в раствор Эймса в чашку, содержащую лист фильтровальной бумаги (больше глобуса, но меньше чашки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование растворов, отличных от Эймса, приведет к ухудшению состояния сетчатки (Рисунок 4A).
  5. Используя острые щипцы #5 и ножницы для радужной оболочки, осторожно удалите всю мускулатуру, фасции, сосуды и нервы из глазного яблока (рисунок 2E, F и рисунок 3B), не прокалывая склеру (рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пункция склеры на этом этапе (Рисунок 4B) приведет к образованию грыжи ткани (Рисунок 4C).
  6. Расположите кончик одного лезвия ножниц радужной оболочки перпендикулярно роговице ножницами параллельно головке зрительного нерва. Проколите глобу в этом положении (Рисунок 3C,D).
  7. Сделайте один чистый разрез через роговицу и лимб, продолжая в склере и сетчатке по направлению к диску зрительного нерва (рисунок 3E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перерезайте корешок зрительного нерва, иначе склера и сетчатка разделятся. Точная длина этого разреза будет варьироваться в зависимости от размера земного шара, который может сильно варьироваться между старыми и молодыми животными, а также в некоторых линиях Cre относительно диких животных. Мы рекомендуем оставлять примерно 1 мм ткани между самой глубокой областью этого разреза и диском зрительного нерва.
  8. Расположите лезвие перпендикулярно первоначальному разрезу (Рисунок 3F, G), примерно на 1 мм позади лимба (Рисунок 2C). Начните разрез радиально через склеры и сетчатку.
    1. Поддерживайте постоянную линию разреза сзади и параллельно лимбу, используя острые щипцы для направления и вращения глобуса. Хотя сведение к минимуму порезов является идеальным вариантом, приоритетом является поддержание чистоты радиальной траектории. Если сетчатка и склера разделяются, переместите лезвие ножниц радужной оболочки глаза, чтобы разрезать их вместе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез в лимбе может привести к отделению сетчатки от склеры во время удаления хрусталика. Допустимы небольшие ножницы и вращения. Избегайте применения силы для его фиксации, так как это может привести к образованию грыжи сетчатки.
    2. Оцените заднее расстояние в 1 мм, используя среднюю ширину лезвия ножниц радужной оболочки. Если вы не уверены, ошибитесь в сторону более заднего положения, так как соединение сетчатки с лимбом изгибается изнутри. Более задний разрез способствует удалению плоской сетчатки.
  9. После завершения радиального разреза параллельно лимбу осмотрите наличие оставшихся соединений сетчатки. Осторожно разрежьте их ножницами для радужной оболочки глаза, пока передняя и задняя части глазного яблока не будут разделены.
  10. С помощью двух пар острых щипцов #5 аккуратно разделите переднюю и заднюю части глазного яблока (Рисунок 3H). У старых мышей прозрачные волокна могут соединять хрусталик с чашечкой сетчатки; Осторожно разрежьте их ножницами с радужной оболочкой, сводя к минимуму разделение сетчатки и склеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линза должна оставаться прикрепленной к лимбу и роговице.
  11. Используя фильтровальную бумагу в качестве опорной платформы, разрежьте ножницами радужной оболочки глаза в виде листа клевера (также известного как железный крест) (рисунок 3I-K).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрезы листьев клевера должны быть короче, чем первичный ориентирующий разрез, первоначально сделанный через лимб, если требуется запись ориентации с этим срезом. Мы рекомендуем уменьшить размер этих трех новых радиальных разрезов, чтобы они были примерно на 1-2 мм короче первичного разреза. Если для ориентации будет использоваться другой признак, такой как опсин градиент, целесообразно, чтобы все разрезы были одинаковой длины, при этом всегда сохранялся примерно 1 мм ткани между самой глубокой частью разреза и головкой зрительного нерва, чтобы предотвратить разделение сетчатки и склеры.
  12. Повторите рассечение со вторым глазом. Чтобы свести к минимуму некроз, завершите удаление передней камеры второго глаза в течение 10 минут после эвтаназии.

2. Криоконсервация

  1. Приготовьте одноразовую пластиковую пипетку для переноса, разрезав кончик так, чтобы образовалось отверстие, превышающее рассеченную сетчатку и склеру (далее – сетчатка).
  2. Аккуратно отсосите сетчатку в пипетку и положите ее на предметное стекло микроскопа. С помощью лабораторной салфетки осторожно удалите излишки раствора Эймса вокруг сетчатки до тех пор, пока она больше не сможет свободно плавать и может быть сплющена.
  3. С помощью двух острых щипцов #5 разверните сетчатку и расположите ее горизонтально внутренней чашкой глаза вверх. В зависимости от размера ткани сделайте рельефные надрезы на 0,5-2 мм в каждом сегменте клеверного листа для дальнейшего сплющивания сетчатки, тщательно корректируя ткань для предотвращения складчатости (рисунок 5А). Удаляйте дополнительный раствор Эймса до тех пор, пока жидкость не останется только рядом с сетчаткой.
  4. С помощью покровного стекла быстро надавите и перенесите сетчатку (рисунок 5B) с окружающей жидкостью так, чтобы наружная склера была обращена вверх, а внутренний глазной стакан соприкоснулся с покровным стеклом, то есть ганглиозные клетки сетчатки будут обращены вверх (рисунок 5C).
  5. Убедитесь, что сетчатка не согнута, и при необходимости внесите коррективы; добавьте раствор Эймса для облегчения манипуляций. Поскольку избыток жидкости приведет к скручиванию ткани, используйте лабораторную салфетку, чтобы удалить весь избыток раствора Эймса и дайте сетчатке высохнуть на воздухе в течение 5-10 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не допустить кратковременной сушки на воздухе, это может привести к случайному разделению тканей и ОКТ во время криосекции. Чрезмерное высыхание на воздухе может привести к повреждению тканей, связанному с кристаллами соли.
  6. Нанесите среду ОКТ, чтобы покрыть сетчатку, и с помощью щипцов равномерно распределите этот слой по покровному стеблю, предотвращая флотацию сетчатки. Подождите 30 с, чтобы среда ОКТ проникла в сетчатку.
  7. Мгновенно заморозьте сетчатку глаза в ОКТ (рисунок 5D) с помощью металлической пластины, косвенно охлаждаемой парами жидкого азота, или путем прямого контакта с сухим льдом.
  8. Храните сетчатку на сухом льду при немедленном использовании или в морозильной камере при температуре -80 °C в пластиковом пакете или контейнере с влагопоглотителями при длительном хранении.

3. Криосекция

  1. Установите криостатную камеру на -18 °C и ступень на -12 °C. Поместите сетчатку в камеру, чтобы уравновесить температуру.
  2. Создайте купол ОКТ на патроне для образца. Если используется такая же модель криостата, то следите за тем, чтобы этот купол занимал внутренние 2-3 кольца. После замораживания обрежьте купол OCT, чтобы создать плоскую поверхность предметного столика, параллельную лезвию патрона, чтобы сохранить ламинарную плоскостность (рис. 6A).
  3. Создайте или запишите руководство по ориентации, связывающее патрон со стадией криостата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На модели криостата, которую мы рекомендуем, ориентация представляет собой центральную линию, выгравированную в положении «12 часов» над держателем патрона, в то время как сам патрон имеет треугольный вырез на крайнем кольце. Вместе мы называем эти функции руководством по ориентации. Если ваш криостат не обладает такими особенностями, мы рекомендуем использовать перманентный маркер для изготовления самостоятельного.
  4. Подготовьте сетчатку к переносу с помощью бритвенного лезвия, удалив избыток ОКТ, окружающий сетчатку сбоку, а затем осторожно отделив сетчатку от покровного стекла, чтобы сделать ее подвижной.
  5. Снимите патрон со столика и нанесите небольшую каплю жидкого ОКТ на подготовленную плоскую поверхность столика ОКТ.
  6. Поместите сетчатку непосредственно на жидкий ОКТ. С помощью предварительно охлажденного предметного стекла (-18 °C) нажмите и удерживайте сетчатку напротив предметного стекла ОКТ в течение 10-30 с, пока она не замерзнет.
  7. Нанесите дополнительную ОКТ на сетчатку и сцену, чтобы обеспечить полное сцепление. Заморозьте в зоне быстрой заморозки криостата. Инкубируйте стадию сетчатки/ОКТ в криостате в течение не менее 30 минут, чтобы обеспечить полное сцепление.
  8. Начните секционирование:
    1. Тщательно обрезайте избыток ОКТ до тех пор, пока сетчатка не станет видимой (Рисунок 6B). Используйте лезвие бритвы для удаления излишков ОКТ с краев блоков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда убирайте столик перед возобновлением секции после любой ручной радиальной обрезки. Для обрезки срезов по лицевой стороне мы рекомендуем использовать ту же толщину реза, которая будет использоваться для нужных участков; Тем не менее, толщина обрезки может составлять от 10 мкм до 100 мкм в зависимости от предпочтений пользователя.
    2. Продолжайте обрезку во время осмотра срезов на наличие склер. Когда склера будет видна, при необходимости отрегулируйте угол наклона сцены. Продолжайте обрезку до тех пор, пока секции не покажут равномерное распределение склер, что обеспечит оптимальную плоскостность и максимальную площадь клеверного листа в каждой секции.
    3. Соберите срезы ткани (рисунок 6C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная толщина будет зависеть от выполняемого окончательного анализа и должна соответствовать этому протоколу на последующих этапах. Например, если используется 10-кратный ксений, мы рекомендуем профили толщиной 20 мкм. В то время как для 10X Visium более подходящими являются участки толщиной 15 мкм.
    4. Используйте предварительно охлажденные слайды и перемещайте секции в нужное положение с помощью двух кистей.
    5. Поместите палец под срез до тех пор, пока ОКТ не расплавится и ткань не прилипнет (примерно 5 с).
    6. Верните предметное стекло на холодную поверхность для повторного замораживания тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе срезов на небольших площадях (например, для ксения) может потребоваться несколько циклов замораживания-оттаивания. Хотя это не влияет на методы, основанные на зондах, это может повлиять на качество РНК при подходах к несмещенному секвенированию.
  9. Храните предметные стекла на сухом льду для немедленного использования, при -20 °C для РНК-скопа на следующий день и при -80 °C при длительном хранении.

4. Обнаружение мишени и микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что этот метод совместим с другими методами молекулярного профилирования, мы подробно описываем RNAscope в качестве одного из проверенных примеров.

  1. Подготовка образцов:
    1. Достаньте предметные стекла из хранилища при температуре -80 °C и прогрейте до -20 °C в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла можно хранить при температуре -20 °C до 12 часов до начала остальной части этой процедуры, но их не следует оставлять при температуре -20 °C слишком долго, чтобы свести к минимуму деградацию РНК.
  2. Быстро нагрейте предметные стекла до 37 °C в течение 10 секунд.
  3. Зафиксируйте ткань, погрузив предметные стекла в свежий 4% PFA на 30 минут при комнатной температуре.
  4. Тщательно вымойте слайды 1x PBS.
  5. Обезвоживание тканей с помощью этанола: 50% этанол в течение 5 минут, 70% этанол в течение 5 минут, 100% этанол в течение 5 минут, свежий 100% этанол в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный этап контроля качества для монтажа тканей. Если при обезвоживании происходит отслоение тканей, это указывает на перекрытие ОКТ со смежных участков во время монтажа. Тщательная обрезка излишков OCT во время секции и монтажа предотвращает эту проблему.
  6. Подготовка барьера:
    1. Высушите горки на воздухе на столе в течение 5 минут при комнатной температуре.
    2. С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте барьер вокруг каждого участка ткани. Дайте барьеру полностью высохнуть в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Молекулярное детектирование:
    1. Применяйте процедуру Protease IV для пермеабилизации тканей.
    2. Следуйте протоколу производителя для гибридизации целевого зонда (2 ч при 40 °C), этапов усиления сигнала (три последовательных усилителя), детектирования флуорофоров (четыре последовательных раунда для трехплексного окрашивания).
  8. Отображение:
    1. Выполняйте противоядерное окрашивание DAPI перед каждым монтажом защитного стекла.
    2. Установите защитное стекло с помощью крепежного носителя с защитой от выцветания.
    3. Изображение получено с помощью флуоресцентной микроскопии с соответствующими наборами фильтров.
    4. Для мультиплексного детектирования захватите одно и то же поле во всех четырех раундах детектирования для компьютерной регистрации.
    5. Поддерживайте постоянные настройки экспозиции между раундами для точного сравнения сигнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения полной информации о реализации RNAscope обратитесь к протоколам производителей (см. Таблицу материалов). Для полностью автоматизированных платформ, таких как Xenium, следуйте всем шагам протокола производителя в точности так, как указано. Для всех протоколов следует ожидать, что неудача из-за отслойки тканей, скорее всего, произойдет во время ранней стадии обезвоживания или промывания из-за перекрытия ОКТ, как указано в этом примерном протоколе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешная реализация этого протокола позволяет получить неповрежденные участки сетчатки лица , пригодные для нескольких подходов к молекулярному профилированию, сохраняя при этом пространственные отношения по всей поверхности сетчатки. Мы демонстрируем полезность протокола с помощью систематического подхода к валидации, переходя от традиционной иммуногистохимии через ручное обнаружение мультиплексной РНК к автоматизированному высокопроизводительному молекулярному профилированию.

При пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь метод устраняет критический технический барьер в пространственной биологии сетчатки, позволяя получать тонкие срезы на лице , подходящие для современных технологий молекулярного профилирования. Наиболее важные этапы протокола связаны с обработкой тканей во время первоначальной диссекции и точным контролем температуры и гидратации во время криоконсервации и секции. Успешная реализация зависит, в частности, от достижения надлежащего выравнивания тканей перед в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Общий ресурс по мониторингу иммунного иммунитета человека (RRID:SCR_021985) в Онкологическом центре Университета Колорадо (P30CA046934) за их экспертную помощь в эксплуатации платформы 10X Xenium. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01EY035293).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эймс&прайм; СреднийSigma-AldrichA1420-10X1LКонкретная марка не важна
Beadsmith Thread Zap, Thread BurnerThe Beadsmith Store7.90524E+11Можно использовать альтернативные прижигатели
CryostatLeicacm1950Важным фактором является раздельно контролируемый объем и температура стола.
Сухой ледNANA
NA Fine Science Tools Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools 1129500NC9889584Конкретная марка не важна
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571Конкретная марка не важна
Fisherbrand High Precision Straight Slender Fine Point Пинцет/щипцы FisherScientific12-000-127Конкретная марка не важна
Стандартные ножницы для препарирования FisherbrandFisher Scientific08-951-20Конкретная марка не важна
Горные стекла для микроскопа Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific22-037-246Конкретная марка не важна
Integra Miltex Noyes Ножницы с ирисомIntegra Miltex 18151012-460-278Конкретная марка не важна
Epifluorescence микроскопДля рисунка 7
РНКоскоп HiPlexACDBio
Прямоугольная крышка очковFisherScientific 12-541-033Конкретная марка не важна
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS6014-25GКонкретная марка не важна
Thermo Scientific Nunc Стеклянная нижняя посудаFisher Научный12-567-400Конкретная марка не важна
Мировой прецизионный прибор Прецизионный стерео зум Тринокулярный микроскоп (IV) на стреле ПодставкаМировой прецизионный прибор PZMTIVBS50-253-8607Конкретная марка не важна
Zeiss Axio Imager.M2 эпифлуоресцентный микроскоп Оптическое сечение включено (для рис. 8)
Olympus IX81 с вращающимся диском

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. Topographic variations in retinal encoding of visual space. Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).
  3. Collin, S. P. A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates. Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).
  4. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. bioRxiv. , (2024).
  5. Rheaume, B. A., et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes. Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).
  6. Tran, N. M., et al. Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  7. Yan, W., et al. Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  8. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).
  9. Holmgren, C. D., et al. Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow. eLife. 10, e70838(2021).
  10. Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury. Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).
  11. Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder. Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).
  12. de Gainza, A., et al. The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space. Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).
  13. Choi, J., et al. Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH. Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).
  14. Kremers, L., et al. Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina. Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).
  15. Simon, P., Thanos, S. Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).
  16. Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).
  17. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  18. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  19. Jaeger, C., et al. Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators. FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).
  20. Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina. J Vis Exp. (203), e65757(2024).
  21. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. bioRxiv. , (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNAscopeXenium

Похожие статьи