Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Шпатель Монтевидео Аппарат для витрификации эмбрионов млекопитающих

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68176

⸱

6 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, 2Centro de Esterilidad Montevideo, 3Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол Spatula Montevideo для витрификации предимплантационных эмбрионов мышей и овец, состоящий из самодельного шпателя и использования домашних растворов. Эмбрионы быстро уравновешиваются в двух растворах криопротекторов возрастающей концентрации, загружаются на шпатель, погружаются в жидкий азот и, наконец, запечатываются соломинкой объемом 0,5 мл.

Аннотация

В этом исследовании описывается эффективный и экономичный метод витрификации для криоконсервации эмбрионов мышей и овец, известный как Spatula Montevideo (MVD). В этом протоколе в качестве несущего устройства используется самодельный шпатель, который подготавливается с помощью наконечника для загрузчика геля. Эмбрионы быстро уравновешиваются в двух домашних растворах криопротектора возрастающей концентрации, загружаются в шпатель, а затем непосредственно погружаются в жидкий азот. Примерно 30-40 эмбрионов мышей на предимплантационной стадии могут быть загружены на шпатель, который впоследствии запечатывается соломинкой объемом 0,5 мл. Использование шпателей вместо криопробирок, которые часто используются для хранения витрифицированных эмбрионов, оптимизирует пространство в сосудах с жидким азотом. Кроме того, для процесса согревания требуется только домашний раствор сахарозы в уменьшающейся концентрации для регидратации эмбрионов и восстановления их морфологии. Наша лаборатория уже более 10 лет успешно использует шпатель Монтевидео для предимплантационных эмбрионов мышей и овец. Шпатель Монтевидео продемонстрировал среднюю скорость восстановления (восстановленные/витрифицированные эмбрионы) 84% и выживаемость (жизнеспособные/восстановленные эмбрионы) 97% у эмбрионов мышей. Витрификация эмбрионов мышей дала лучшие результаты, чем медленное замораживание, хотя никаких различий в репродуктивных исходах (беременность, роды и рождаемость) не наблюдалось. У эмбрионов овец были достигнуты аналогичные показатели выживаемости и развития эмбрионов с помощью Spatula Montevideo по сравнению с коммерческим устройством. Хотя частота наступления беременности была выше для коммерческого устройства, выживаемость ягнят существенно не отличалась между устройствами. Метод витрификации Монтевидео — это простой метод криоконсервации, который может быть использован для хранения излишков эмбрионов, резервного копирования генетически модифицированных линий мышей и моделей овец, а также для облегчения обмена ими между исследователями по всему миру.

Введение

Эффективность получения генетически модифицированных (ГМ) животных значительно возросла благодаря развитию методов на основе эндонуклеазы, в частности CRISPR/Cas9. Многие лаборатории по всему миру производят различные линии ГМ-мышей и крыс, которые должны быть криоконсервированы, чтобы предотвратить генетический дрейф и сохранить целостность исходного фенотипа1. Кроме того, архивирование устраняет необходимость в постоянном разведении, что часто приводит к чрезмерной численности животных. Некоторые лаборатории отправляют линии ГМ-мышей в виде криоконсервированных эмбрионов или спермы в международные репозитории, облегчая обмен этими моделями и избегая транспортировки живых животных. Это обеспечивает доступ к линиям без повторяющейся генерации идентичных моделей животных GM2. По этим причинам криоконсервация эмбрионов и спермы имеет первостепенное значение в любом предприятии по выращиванию генетически модифицированных животных. Как правило, криоконсервация эмбрионов предпочтительна для хранения линий ГМ, поскольку эмбрионы содержат полный диплоидный геном с модификациями и могут быть легко восстановлены путем переноса эмбрионов.

Витрификация – это неравновесный процесс, характеризующийся дисбалансом между водой, поступающей в клетку, и водой, образующей вокруг нее внеклеточные кристаллы. Этот метод предотвращает образование внутриклеточных кристаллов льда, в отличие его от метода медленного замораживания (SLF)3 (см. рис. 1). Высокая концентрация криопротекторов и прямой контакт с жидким азотом (LN2) обеспечивают сверхбыстрое охлаждение (~40 °C/с), достигая стекловидного состояния образцов в течение нескольких секунд. Более того, витрификация быстрее, проще и дешевле, чем медленное замораживание4. Он требует минимального LN2 и, как правило, использует простое оборудование, которое можно купить в продажеили сделать домашним 5 (см. Рисунок 1).

Кроме того, процесс нагревания, как правило, быстрый и воспроизводимый. Его следует проводить быстро, чтобы избежать токсичности криопротектора и сохранить стекловидное тело3. При замораживании эмбрионов многие лаборатории учитывают удобство устройства-носителя, его надежность, прочность, удерживающую способность и стоимость.

Для рутинной криоконсервации эмбрионов овец и мышей мы предпочитаем метод витрификации минимального объема шпателем с использованием аппарата Spatula Montevideo (MVD)6. Первоначально мы использовали метод медленной заморозки7 , но быстро перешли на витрификацию. Чтобы создать более простое и компактное устройство для LN2 dewar, мы модифицировали самодельный шпатель от Tsang and Chow (2009)8, который вставляется в криопробирку, чтобы получить шпатель MVD, который герметизируется соломинкой объемом 0,5 мл (см. Таблицу материалов). Шпатель оснащен наконечником загрузчика геля (см. Таблицу материалов), где платформа размером около 1 мм² формируется путем аккуратного плавления наконечника с помощью тонких щипцов, создавая лепесткообразную пластину для загрузки эмбрионов. Эта платформа может вместить до 40 эмбрионов мыши в небольшой капельке витрификации. Стержень для идентификационной пробки (см. Таблицу материалов) вставляется в открытый конец наконечника загрузчика геля.

Целью этого метода является витрификация эмбрионов простым, быстрым и недорогим методом, который, кроме того, экономит место в азотном дьюаре. Эта система успешно используется в течение многих лет, обеспечивая отличные показатели выживаемости эмбрионов (~97%) и репродуктивных результатов, особенно у эмбрионов мышей. Поскольку шпатель МВД готовится в лабораторных условиях, он является малозатратным методом по сравнению с коммерческими приборами9. Кроме того, это экономит место в азотном дьюаре по сравнению с использованием криопробирок 8,10.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Сравнение двух основных методов, используемых для криоконсервации эмбрионов. Этот рисунок был изменен с разрешения Crispo et al.1. Создано в BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные, используемые для получения эмбрионов мышей, содержались и обрабатывались в соответствии с национальным законодательством 18.611 и международными рекомендациями по уходу за животными11. Протокол эксперимента (разрешение No #007-18) был своевременно одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Institut Pasteur de Montevideo (письменное согласие). Экспериментальные протоколы для овечьих ооцитов/эмбрионов были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными Fundación IRAUy (протокол #001-2017), в соответствии с руководящими принципамиARRIVE12 и проводились в соответствии с международными рекомендациями по уходу за животными11.

1. Витрификация (Рисунок 2)

  1. Подготовка шпателя МВД
    1. Укоротите наконечник загрузчика геля (см. Таблицу материалов), отрезав первые 10 мм и конус наконечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это создает более короткий, прямой наконечник, облегчая окончательное уплотнение соломинкой объемом 0,5 мл (см. Таблицу материалов).
    2. Удерживайте конец наконечника загрузчика геля с помощью часовых щипцов #5 (см. Таблицу материалов) примерно в 1,0 см от наконечника. Осторожно поместите наконечник в пламя горелки Бунзена (см. Таблицу материалов) и удерживайте в течение 8-10 с, чтобы образовалась лепестковидная платформа размером примерно 1мм2.
    3. Снимите с пламени и крепко удерживайте щипцами в течение 5 с.
    4. С помощью стереомикроскопа (см. Таблицу материалов) проверьте, что лепестковидная платформа (~ 1 мм2) сформирована и дистальный край загерметизирован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа должна быть закрыта с дистального конца, чтобы предотвратить проникновение LN2 во время витрификации. Убедитесь, что платформа чистая и на ней нет пластиковых нитей. Если он слишком мал или имеет нитки, обрежьте кончик и повторите процедуру.
    5. Повторите шаги 1.1.1-1.1.4 для подготовки необходимого количества лопаток (1 лопатка = до 40 эмбрионов мыши).
    6. Простерилизуйте шпатели с помощью ультрафиолетовых (УФ) лучей или окиси этилена и храните их в стерильной пробирке или коробке.
    7. В день остеклования извлеките лопатки, обрабатывая их с противоположного конца платформы. Вставьте идентификационный стержень (см. Таблицу материалов) в каждый шпатель и поместите его на основание стереомикроскопа. Наклейте на удилище перманентный маркер или жидкую азотостойкую наклейку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда избегайте прикосновения к платформе при работе со шпателями. Общая длина комплектного устройства (шпатель + 0,5 мл соломинки + идентификационный стержень) не должна превышать более 1 см длины бокала.
  2. Приготовление растворов для остекловывания
    1. Приготовьте раствор ФС: растворите 1,5 г градиентной среды плотности (см. Таблицу материалов) и 0,85 г сахарозы (см. Таблицу материалов) в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS; см. Таблицу материалов). Нагрейте на кипящей водяной бане до полного растворения, затем простерилизуйте с помощью фильтра 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
    2. Приготовьте раствор для предварительной витрификации (PV): в день витрификации смешайте 10% этиленгликоля (см. Таблицу материалов), 10% диметилсульфоксид (см. Таблицу материалов) и 80% среду M2 (см. Таблицу материалов). Общий объем 100 мкл необходим для 5 шпателей.
    3. Приготовьте раствор для остекловывания (V): В день остекловывания смешайте 15% этиленгликоля, 15% диметилсульфоксида, 10% М2 среды и 60% раствор FS. Общий объем 100 мкл требуется для 5 шпателей.
  3. Процесс обезвоживания эмбрионов и витрификации
    1. Подготовьте LN2: Налейте LN2 в подходящую емкость (например, в изолированный контейнер из полистирола размером 10 см x 30 см x 20 см) и положите столько соломинок объемом 0,5 мл, сколько шпателей для использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения визуализации платформы шпателя во время манипуляций под LN2 рекомендуется использовать контейнер из полистирола с цветным дном для создания контрастного эффекта.
      ВНИМАНИЕ: Надевайте соответствующие очки и перчатки (см. Таблицу материалов) при работе с LN2.
    2. Приготовьте растворы: На пластиковую чашку Петри диаметром 100 мм (см. Таблицу материалов) нанесите следующие капли: 100 μL M2, 20 μL раствора PV и 20 μL V раствора на каждый шпатель.
    3. Витрификация эмбрионов: поместите эмбрионы, подлежащие витрификации, в каплю M2. Обрабатывайте 30-40 эмбрионов за один раз, инкубируя их в капле раствора ПВ в течение 30 с, а затем в капле раствора V еще 30 с при комнатной температуре (ОТ).
    4. Используйте натяжной стеклянный капилляр (см. Таблицу материалов) с аспираторной трубкой в сборе (см. Таблицу материалов). Перед помещением эмбрионов предварительно загрузите в капилляр не менее 1 мкл соответствующего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы будут находиться на разной высоте в каплях, поэтому отрегулируйте микроскоп стереомикроскопа, чтобы определить их местонахождение. Извлекайте эмбрионы из каждой капли, когда остается 10 секунд. Все манипуляции с эмбрионами должны проводиться под стереомикроскопом.
    5. Загрузка эмбрионов: Аспирируйте эмбрионы, используя минимальное V-раствор (например, ~ 0,1 μL) и быстро поместите их на платформу для шпателя.
    6. Погружение в LN2: После загрузки эмбрионов немедленно погрузите платформу шпателя в LN2 на 5 с (удерживая шпатель рукой, за его стержень). Затем, выдерживая шпатель в парах LN2 , запечатайте его соломинкой объемом 0,5 мл с помощью длинного пинцета из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запечатыванием извлеките LN2 из соломинки, чтобы предотвратить расширение во время нагревания. Убедитесь, что шпатель и соломинка правильно выровнены, чтобы избежать контакта между каплей эмбриона и стенкой соломинки. Для удобства герметичные шпатели могут оставаться в контейнере LN2 до тех пор, пока все шпатели не будут загружены эмбрионами, при необходимости заполняя LN2 .
    7. Повторите процедуру: Повторите шаги с 1.3.3 по 1.3.7 для каждой группы эмбрионов, используя свежую пару капель PV и V.
    8. Хранение: Переложите шпатели в бокалы (см. Таблицу материалов), а затем в накопитель LN2 Dewar (см. Таблицу материалов).

figure-protocol-1
Рисунок 2: Схема процесса остекловывания с помощью шпателя МВД. Подробнее см. в тексте. Создано в BioRender. Мейкл, М. (2025) https://BioRender.com/x96y902. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Согревание (Рисунок 3)

  1. Приготовление раствора
    1. Приготовьте 1 М раствор сахарозы, растворив 0,85 г сахарозы в 2,5 мл М2 среды. Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно готовить и хранить при температуре 4 °C до 1 недели.
    2. Готовят 0,5 М и 0,25 М растворов сахарозы, разбавляя 1 М раствор сахарозы соответствующим объемом М2 среды.
    3. Поддерживайте растворы сахарозы при температуре 37 °C на горячей плите (см. Таблицы материалов) до начала нагревания.
  2. Подготовка согревающей плиты
    1. На пластиковую чашку Петри диаметром 100 мм поместите следующие капли раствора: каплю 0,5 М сахарозы на 500 мкл, каплю 0,5 М сахарозы на 50 мкл и каплю 0,25 М сахарозы на 50 мкл на каждый нагреваемый шпатель. Налейте три капли среды M2 (по 100 мкл каждая) для умывания.
  3. Процесс прогрева
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс нагревания происходит при RT, например, при 20-22 °C на основе стереомикроскопа.
    1. Достаньте запечатанные шпатели из дьюара. Поместите их в соответствующую емкость с LN2. Смотрите рисунок 3.
    2. Поместите нагревательную пластину в стереомикроскоп. По очереди придерживайте основание шпателя пинцетом из нержавеющей стали, а рукой в перчатке вытаскивайте идентификационный стержень, а затем соломинку. Быстро окуните платформу, содержащую эмбрионы, в 0,5 М каплю сахарозы объемом 500 мкл.
    3. Следите за тем, чтобы все эмбрионы попали в каплю; При необходимости аккуратно переместите шпатель, чтобы облегчить их освобождение. Загрузите эмбрионы в вытянутый стеклянный капилляр, поместите их в каплю объемом 50 мкл 0,5 М раствора сахарозы и инкубируйте в течение 2 минут.
    4. Поместите эмбрионы в каплю объемом 50 мкл 0,25 М раствора сахарозы и инкубируйте еще 2 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед помещением эмбрионов в каждый раствор предварительно загрузите капилляр раствором, который будет использоваться.
    5. Наконец, промойте эмбрионы три раза в разных каплях среды М2, чтобы удалить сахарозу.
    6. Инкубируйте эмбрионы в условиях, подходящих для каждого вида, не менее 1 часа перед использованием.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Схема процесса прогревания шпателем МВД. Подробнее см. в тексте. Создано в BioRender. Мейкл, М. (2025) https://BioRender.com/k91k191. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первоначально мы использовали традиционный метод медленной заморозки на основе растворов пропиленгликоля, соломинок и оборудования для заморозки с контролируемой скоростью7. Однако, рассмотрев метод витрификации как потенциально более простой и экономически эффективный вариант, мы провели исследование для сравнения результатов традиционного медленного замораживания (SLF) с MVD Spatula у 8-клеточных эмбрионов in vivo и 2-клеточных эмбрионов in vitro

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Шпатель МВД - это простое в сборке, недорогое, минимальное по объему витрификационное устройство с высокой емкостью удержания эмбрионов и оптимальным содержанием жидкого азота. Этот метод доказал свою простоту, скорость и надежность. В среднем достигнуты не только высокие показатели восстановления эмбрионов и выживаемости витрифицированных эмбрионов (~90%), но и хорошие репродуктивные результаты при проведении переноса эмбрионов у мышей (~80% стельности и ~30% рождаемости), которые сопос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Алехо Менчаку за его вклад в развитие Шпателя МВД. GS получил финансирование от Программы последипломного образования в области биотехнологии - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (номер гранта: GS 2437 347). GS, MNM и MC получили финансирование от FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (номер гранта: COF 03/11). GS и MC являются членами Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Уругвай. (https://www.anii.org.uy/). Спонсоры (Программа последипломного образования в области биотехнологии - Facultad de Ciencias - Universidad de la República; FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay) не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m filter Сарториус16534Шприцевой фильтр Minisart 0,2 & микро; L
0,5 мл соломинки Минитуб13408/0044Пайетка среднего размера французского типа
Сборка трубки аспиратора СигмаА5177
Горелка Бунзена Индулаб7000134
Диметилсульфоксид СигмаД2650
Этиленгликоль Сигма102466
Ficoll PM70 СигмаФ2878Градиент плотности среды
Наконечник загрузчика геляEppendorf 10411193
Стеклянные капилляры Мариенфельд2900000Микрогематокрит капиллярная трубка
Перчатки для работы с LN2 Временный щитЦЭ0338Криоперчатки
БокалыМинитуб16913/1133
Очки для управления ЛН<саб>2   3 МИН.  40661-00000-10Антизапотевающее, устойчивое к царапинам покрытие
КонфоркаЛабекЛА-Ш-II-5БЦифровая модель
Идентификационный стержень Технологии IMV6326Нестерильный LG48 мм
Изолированный контейнер из пенополистирола
LN2 накопитель ДьюараТейлор-УортонХТ21-АИКрионаука
Длинные пинцелеры из нержавеющей сталиИнструменты для точной науки11000-25
М2 СигмаМ7167
ПБС ДомашнийФосфатный буферный солевой раствор. Обычно готовят 1 л концентрированного 5x буфера, а затем разбавляют до 1x. Рецепт: 40 г хлорида натрия, 1 г хлорида калия, 7,2 г безводного динатрийфосфата, 1,2 г монокалийфосфата. Добавьте дистиллированную воду и простерилизуйте автоклавом.
Пластиковая чашка Петри Сокол    351029Не обработанная ТС бактериологическая чашка Петри
Стереомикроскоп ОлимпСЗ2-ЛГБ
Сахароза СигмаС1888
Часовщик S #5 Щипцы Инструменты для точной науки11254-20

Ссылки

  1. Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine. , Springer. Cham. (2024).
  2. Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. Reproducibility: use mouse biobanks or lose them. Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).
  3. Hart-Johnson, S., Mankelow, K. Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals. Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).
  4. Shaw, J. M., Jones, G. M. Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos. Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).
  5. Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
  6. dos Santos Neto, P. C., et al. Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods. Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).
  7. Renard, J. P., Babinet, C. High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant. J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).
  8. Tsang, W. H., Chow, K. L. Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula. Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).
  9. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  10. Nakao, K., Nakagata, N., Katsuki, M. Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos. Exp Anim. 46 (3), 231-234 (1997).
  11. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
  12. du Sert, N. P., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  13. Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos. Cryobiology. 84, 77-81 (2018).
  14. Momozawa, K., et al. Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device. Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).
  15. Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures. , International Embryo Transfer Society. (2010).
  16. Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos. Cryobiology. 78, 8-14 (2017).
  17. Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice. PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).
  18. Kamoshita, M., et al. Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals. Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).
  19. Qiu, J., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants. Cryobiology. 98, 127-133 (2021).
  20. Tsang, W. H., Chow, K. L. Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Витрификация эмбрионовметод криоконсервацииэмбрионы мышиэмбрионы овцыкриопротекторные растворыхранение в жидком азотесогревание эмбрионовпреимплантационные эмбрионы
Шпатель Монтевидео Аппарат для витрификации эмбрионов млекопитающих
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.