Методическая статья

Улучшенная доставка и экспрессия генов с помощью внутрикостного введения наночастиц хитозана, инкапсулированных плазмид редактора адениновых оснований

DOI:

10.3791/68181

⸱

16 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем подход к генной терапии, который доставляет хитозан с покрытием ABE непосредственно в костный мозг путем внутрикостной инъекции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доставка экзогенных плазмид экспериментальным животным имеет решающее значение в биомедицинских исследованиях, включая изучение функций генов, выяснение механизмов заболевания и оценку эффективности лекарств. Тем не менее, эффективность трансфекции данного метода относительно низка, и введение плазмид для долгосрочной экспрессии генов может зависеть от иммунной системы. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали и исследовали новый метод, в котором хитозан используется для инкапсуляции плазмид редактора адениновых оснований (ABE), а затем непосредственно доставляется комплекс в костный мозг мышей путем внутрикостной инъекции. В этом исследовании для нацеливания на ген CaMK II δ , который тесно связан с дифференцировкой остеокластов, мы использовали хитозан для инкапсуляции δ плазмид ABE CaMK II . Мы вводили плазмидный груз непосредственно в полость костного мозга путем внутрикостного введения. Результаты показали высокую эффективность редактирования in vivo в 14,27% в локусе А1 и 10,69% в локусе А2 у мышей-реципиентов. Эта новая стратегия не только особенно подходит для заболеваний, вызванных аномальной функцией остеокластов, но и обладает значительным потенциалом для продвижения в области генной терапии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генная терапия стала перспективным подходом в области биомедицинских исследований 1,2. Он предлагает потенциал для лечения различных заболеваний путем введения чужеродных плазмид экспериментальным животным для модуляции экспрессии определенных генов и изучения их терапевтических эффектов. Однако традиционные методы доставки столкнулись с некоторыми проблемами, которые ограничивают их эффективность и безопасность3. Проблемы включают низкую эффективность трансфекции, высокие биологические повреждения и низкую эффективность экспрессии генов. Таким образом, необходимо разработать новый метод доставки генной терапии, который сможет преодолеть эти ограничения.

Хитозан является природным полисахаридом с хорошей биоразлагаемостью и биосовместимостью 4,5,6, что позволяет легко разлагаться в организме животных, не вызывая серьезной биологической токсичности. Он широко используется для доставки лекарств благодаря высокой скорости внедрения лекарств 7,8, повышенной эффективности доставки и снижению вреда для животных.

Технология редактирования генов ABE, которая позволяет напрямую конвертировать пары оснований A-T в G-C, является многообещающей в генетических и медицинских исследованиях. По сравнению с текущей основной технологией редактирования генов, технология ABE может достичь точной мутации одного основания, тем самым уменьшая редактирование нецелевых последовательностей ДНК, уменьшая побочные эффекты 9,10 и приводя к нулю двухцепочечных разрывов ДНК11, что значительно снижает риск редактирования генов12. Технология ABE также обладает высокой биосовместимостью и больше подходит для исследований в области лечения заболеваний.

Инъекция в хвостовую вену является распространенным методом, используемым для доставки плазмид in vivo, особенно в генной терапии. Целевым геном для данного исследования является CaMK II δ, который тесно связан с дифференцировкой остеокластов13,14. Использование внутрикостного введения вместо хвостовой вены позволяет отредактированной плазмиде вводить остеокласты непосредственно в костный мозг. Эта прямая передача в костный мозг повышает эффективность и стабильность экспрессии генов, что благоприятно для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией остеокластов.

В данной статье мы представляем новый метод, который включает в себя инкапсуляцию плазмиды ABE с хитозаном и последующее непосредственное введение комплекса мышам путем внутрикостной инъекции. С помощью этого метода мы надеемся проложить путь к более эффективному лечению чужеродных плазмид, проникающих в организмы, особенно заболеваний, связанных с дисфункцией остеокластов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по охране здоровья животных Аньхойского университета по использованию и уходу за животными. В этом исследовании ABE был щедро пожертвован профессором Тянь Чи (Шанхайский университет науки и технологии, Шанхай, Китай; Рисунок 1D).

1. Конструкция плазмиды ABE

  1. Дизайн гРНК с последовательностью TCCATGATGCACAGACAGGA, где PAM представлен GAC.
  2. Согласно руководству компании по перечню праймеров, добавьте праймер к соответствующему объему ddH2O для достижения концентрации 100 μM. Затем встряхните и тщательно перемешайте, чтобы обеспечить равномерное распределение. Для реакции отжига приготовьте 10 мкМ раствор, добавив 10 мкл исходного раствора грунтовки в новую микроцентрифужную пробирку, 90 мкл ddH2O, и хорошо перемешайте.
  3. Добавьте 5 μL предварительного праймера, 5 μL нисходящего праймера и 40 μL ddH2O в микроцентрифужную пробирку. Чтобы облегчить реакцию отжига, погрузите трубку в емкость, наполненную кипятком, на 5 минут. Следите за тем, чтобы уровень воды не достигал отверстия трубки, чтобы предотвратить попадание воды и загрязнение грунтовки. Охладите до комнатной температуры, чтобы завершить реакцию отжига.
  4. Добавьте 2 мкг pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (рис. 1D), 1 мкл ESP3I, 4 мкл буфера и 33 мкл ddH2O в микроцентрифужную пробирку и дайте вступить в реакцию на водяной бане постоянной температуры при 37 °C в течение 45 минут.
  5. Проведите электрофорез в агарозном геле. Приготовьте 1% агарозный гель, взвесив 0,5 г агарозы и перелейте его в стеклянную бутылку. Добавьте 50 мл 1x TAE буфера в стеклянную бутылку и встряхните, чтобы порошок агарозы растворился. Нагревать в микроволновой печи 2 минуты до полного таяния. Добавьте 5 μL YeaRed Nucleic Acid Gel Stain, тщательно перемешайте и вылейте в форму для геля; После того как гель застынет, приступайте к добавлению образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 1xTAE используйте реагенты, перечисленные в таблице 1.
  6. Добавьте 1x ТАЭ в емкость для электрофореза и вставьте в него сконфигурированный блок агарозного геля, который следует погрузить в ТАЭ. Добавьте 5 мкл 1x загрузочного буфера в продукт разложения из шага 1.4 и перемешайте. Добавьте образец в гель. Кроме того, добавьте в гель 6 μл маркера.
  7. Запустите программу электрофореза при постоянном напряжении 110 В в течение 35 минут. После электрофореза определите положение полосы в образце по маркеру и разрежьте гелевую полоску чистым лезвием для восстановления геля.
  8. Выполните операцию восстановления геля в соответствии с инструкциями набора для очистки геля maxi. Установите водяную баню на 50 °C. Добавьте соответствующий объем раствора PN в пробирку с разрезанным гелем в соответствии с набором. Проткните гель наконечником пипетки, чтобы облегчить растворение, а затем поставьте его на водяную баню. Время от времени встряхивайте тюбик и наблюдайте за процессом растворения до полного растворения гелевого блока.
  9. Возьмите спиннинговую колонку, CA3, из комплекта. Добавьте 500 мкл раствора BL из набора в спиновую колонку и центрифугируйте ее при давлении 2 000 x g в течение 1 минуты для балансировки колонки. После центрифугирования удалите отработанную жидкость со дна сборной пробирки и поместите адсорбционную колонну обратно в сборную трубку.
  10. Продолжайте центрифугирование при давлении 2000 x g в течение 1 минуты. Слейте отработанную жидкость на дно пробирки центрифуги, добавьте 600 μл раствора PN и центрифугируйте 2 000 x г в течение 30 с; Снова выбросьте отработанную жидкость. Повторите операцию и снова выбросьте отработанную жидкость.
  11. После центрифугирования замените пробирку для сбора объемом 2 мл на новую пробирку объемом 1,5 мл. Откройте крышку и дайте высохнуть в проветриваемом месте в течение 30 минут, чтобы полностью удалить этанол. Затем добавьте предварительно нагретые 40 мкл ddH2O, центрифугу и элюируйте необходимую ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PN следует добавлять с безводным этанолом в соответствии с инструкцией. Использование предварительно подогретой воды может увеличить урожайность.
  12. Добавьте 7 мкл продукта отжига из стадии 1.3, 3 мкл продукта восстановления геля из стадии 1.11, 1 мкл T4 ДНК-лигазы, 2 мкл 10x T4 лигазного буфера и 7 мкл ddH2O в микроцентрифужную пробирку и выдержите в течение ночи при 16 °C для получения продукта лигирования.
  13. Добавьте 10 μL продукта лигирования и 70 μL DH5α в микроцентрифужную пробирку на лед на 30 минут. Установите водяную баню на 42 °C. После ледяной ванны поместите трубку в водяную баню на 90 с, а затем снова на лед на 2 мин.
  14. Добавьте в пробирку 600 μL жидкой среды Luria-Bertani (LB) и встряхивайте на шейкере в течение 30 минут. В то же время облучайте твердую среднюю пластину LB внутри шкафа с ламинарным потоком в течение 30 минут. После инкубации равномерно распределите по тарелке 100 мкл раствора. После нанесения покрытия поместите пластину вверх дном в бактериальный инкубатор с температурой 37 °C для культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DH5α обычно хранят при температуре -80 °C. Твердую среду LB готовят с использованием реагентов, перечисленных в таблице 2. Жидкую среду LB готовят с использованием реагентов, перечисленных в таблице 3.
  15. Выберите одну колонию и разверните бактериальную колонию на 14 часов на свежей тарелке. Возьмите центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавьте 50 мл жидкой среды, добавьте 50 мл ампициллина в соотношении 1:1000 и хорошо перемешайте. Разделите его на новые пробирки по 15 мл на пробирку.
  16. Проверьте культурную пластину на наличие круглых белых колоний с хорошим ростом. Выберите их с помощью пипетки объемом 10 мкл и перенесите в среду LB. Культивируйте его в шейкере в течение 12 часов, а затем отправьте этот образец на секвенирование.
  17. Сравните результаты секвенирования с целевой гРНК, чтобы идентифицировать штамм с соответствующей последовательностью, Camk II δ-sgRNA, в качестве целевого штамма, а затем извлеките плазмиду.
  18. Проводите экстракцию плазмид в соответствии с инструкцией мини-набора плазмид. Добавьте 500 мкл BL в адсорбционную колонну CP3, центрифугируйте в течение 1 мин при концентрации 2 000 x g и выбросьте отработанную жидкость. Поместите адсорбционную колонну обратно в сборную трубку. Добавьте 500 μл бактериального раствора и центрифугируйте при 4 000 x g в течение 10 минут.
  19. Соберите поток наружу. Снова центрифугу, а после удаления надосадочной жидкости добавить 250 мкл Р1 в центрифужную пробирку с бактериальным осадком, а затем перенести в микроцентрифужную пробирку и вихрь. Добавьте 250 μL P2 и аккуратно переверните в 6-8 раз. Добавьте 350 μL P3 и снова аккуратно переверните на 6x-8x. Появляется осадок белого флокулянта.
  20. Центрифуга в течение 10 мин при 2 000 x g. Перенесите надосадочную жидкость в новую адсорбционную колонку CP3, центрифугируйте при давлении 2 000 x g в течение 30 с и удалите отработанную жидкость. Добавьте 600 μл PW, снова центрифугируйте при 2 000 x g в течение 30 с и удалите отработанную жидкость. Снова добавьте 600 μL PW, центрифугируйте при 2 000 x g в течение 30 с и удалите отработанную жидкость.
  21. Поместите адсорбционную колонну в сборную пробирку и центрифугуйте на 2 минуты при давлении 2 000 x g для удаления остаточного PW. Затем поместите адсорбционную колонну в чистую микроцентрифужную пробирку, дайте ей высохнуть в течение 30 минут и добавьте 35 μL предварительно нагретого ddH2O в середину адсорбционной пленки, затем храните полученный продукт при температуре -20 °C для последующих испытаний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PW следует добавлять безводный этанол в соответствии с инструкцией. Использование предварительно подогретой воды может увеличить урожайность.

2. Экстракция клеток костного мозга

  1. Выберите мышей KM в возрасте 8-9 недель, самцов, весом около 30 г. Зафиксируйте мышей в левой руке головой вниз и введите 150 мкл 1% пентобарбитала натрия со стороны брюшной полости с помощью шприца правой рукой. Подтвердите анестезию путем защемления пальцев ног.
  2. Выполните шейный вывих мышей, удалите большеберцовую кость хирургическими ножницами и пинцетом, а также удалите окружающие лишние мышечные ткани. Замочите удаленную большеберцовую кость в PBS и промойте, оставив только чистые кости.
  3. Возьмите 1 мл PBS в шприц для промывания клеток костного мозга с одного конца большеберцовой кости до тех пор, пока кость не станет белой.
  4. Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте при 800 х г при 4 °C в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости лизируйте эритроциты 500 мкл лизата эритроцитов. Через 1 минуту добавьте 1 мл разделительного буфера, чтобы прекратить образование лизата эритроцитов. После центрифугирования при 800 x g при 4 °C в течение 5 минут удалите надосадочную жидкость и поместите клетки на лед для последующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эритроциты полностью лизированы, клетки выпадают в осадок, и эритроциты не видны. Если эритроциты все еще видны, их можно лизировать снова, но время инкубации не должно быть слишком большим, чтобы избежать повреждения других клеток.

3. Трансфекция хитозаном

  1. Препарат хитозана: Смассировать 4 мг хитозана и растворить в 20 мл 0,2 мг/мл раствора уксусной кислоты. Отрегулируйте pH до 5,5 с помощью 10 М NaOH. Возьмите 500 μл этого раствора и добавьте его в отдельные микроцентрифужные пробирки.
  2. Добавьте 2 мкг, 3 мкг, 4 мкг и 5 мкг плазмид ABE в отдельные пробирки и растворите их в 500 мкл 30 мМ Na2SO4. Смешайте 500 мкл раствора хитозана и 500 мкл плазмиды.
  3. Выдержите их на водяной бане при температуре 50-55 °C в течение 15 минут. Хорошо перемешав два раствора, перемешайте в течение 15-30 с и дайте постоять 30 минут.
  4. Определение характеристик хитозана: Проанализируйте диаметры и дзета-потенциалы хитозана с помощью динамического рассеяния света (DLS) с концентрацией хитозана на уровне 0,1 мг/мл в ddH2O. Проведите 3 раза для каждого образца.
  5. Отлите образцы с концентрацией 0,1 мг/мл на кремниевый чип. Добавьте 20 мкл ресуспендированных образцов в сетки с ячейками 200 меш и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Смочите сетки 2% фосфовольфрамовой кислотой в течение 3 минут и удалите остатки жидкости фильтровальной бумагой. Наблюдайте с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
  6. Эффективность инкапсуляции наночастиц: Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,1 мкм, чтобы удалить неосажденные частицы. Загрузите плазмиду и измерьте концентрацию с помощью спектрофотометра на длине волны 260 нм. Расчетная эффективность плазмиды ABE и гРНК-плазмиды составила 84% ± 0,37% и 85% ± 0,53% соответственно.
  7. Ввести мышам через полость костного мозга 100 мкл хитозана с плазмидой через полость костного мозга (шаг 5). После 7 дней инъекции изолируйте клетки костного мозга и лизируйте эритроциты, как описано в шаге 2.
  8. Добавьте 2 мл сыворотки, содержащей среду DMEM, в 6-луночные клеточные культуральные планшеты и добавьте клетки костного мозга (примерно 1 x 106), взвешенные в 500 μл сыворотки, содержащей среду DMEM. Измерьте интенсивность флуоресценции под флуоресцентным микроскопом. Плазмида CaMK II δ-sgРНК имеет красную флуоресценцию TagRFP при возбуждении на длине волны 580 нм (рис. 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сывороткосодержащую среду DMEM готовят с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4.

4. Проточная цитометрия

  1. Приготовьте плазмиды ABE в различных дозировках: 2 мкг, 3 мкг, 4 мкг и 5 мкг, и подайте их мышам-реципиентам, как описано на шаге 3. Через 7 дней изолируйте клетки костного мозга от мышей, как описано на шаге 3.
  2. Соберите клетки костного мозга и центрифугируйте при 800 x g при 4 °C в течение 5 минут. Откажитесь от надосадочной жидкости и лизируйте эритроциты 500 мкл лизата эритроцитов. Через 1 мин завершите реакцию 1 мл разделительного буфера и подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток.
  3. Перенесите 1 x 106 клеток в новую микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте с 800 x g при 4 °C в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки 500 мкл PBS и перенесите их в проточную трубку. Измерьте эффективность с помощью проточной цитометрии. Подготовьте контрольную группу проточной цитометрии, как описано на шаге 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обломки и мертвые клетки с нижними сигналами FSC и расположенные в левом нижнем углу диаграммы рассеяния FSC в сравнении с SSC (менее 400), были исключены (рис. 3). Поскольку плазмиды имеют красную флуоресценцию TagRFP, их можно отсортировать.

5. Инъекция в полость костного мозга

  1. Выберите самцов мышей в возрасте от 8 до 9 недель, весом около 30 г. Обезболите их внутрибрюшинной инъекцией 150 мкл 1% пентобарбитала натрия (шаг 2.1). Подтвердите глубину анестезии щипцом пальца ноги.
  2. Зафиксируйте мышь под наркозом в лежачем положении на операционном столе и зафиксируйте переднюю конечность мыши скотчем.
  3. Продезинфицируйте заднюю большеберцовую кость мышей спиртовым тампоном. Наполните вводимую плазмиду в шприц объемом 1 мл с помощью иглы 26G. Удалите пузырьки воздуха и подготовьте к инъекции.
  4. Коснитесь голени мыши и зажмите голень мышки пальцами. Определите положение иглы для инъекции так, чтобы большеберцовый стержень проникал из плато большеберцовой кости в коленном суставе мыши. Поверните иглу для инъекции параллельно большеберцовой кости, введите в полость костного мозга и вводите медленно (около 3 с), чтобы свести к минимуму повреждение мышей.
  5. После инъекции медленно вытащите иглу (около 3 с) и сразу же используйте спиртовой тампон, чтобы остановить кровотечение и продезинфицировать место прокола.
  6. Аккуратно поместите мышей в теплую среду (20-26 °C), подождите, пока мыши оправятся от анестезии, и наблюдайте за их восстановлением.

6. Секвенирование по Сэнгеру

  1. Через 7 дней после инъекции соберите клетки костного мозга мыши, как описано на шаге 2, и выделите геномную ДНК с помощью набора для экстракции. Соберите клетки путем центрифугирования при давлении 2 000 x g в течение 1 минуты. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 200 μл раствора ГА и вибрируйте вихревым смесителем. Добавьте 20 μL Proteinase K и 200 μL GB, перемешайте, а затем поместите на водяную баню при температуре 70 °C на 10 минут.
  2. После инкубации добавьте 200 μл безводного этанола, встряхните в течение 15 с, а затем поместите перемешанную жидкость во вспомогательную адсорбционную колонну. Центрифугируйте при давлении 2 500 x g в течение 1 минуты, выбросьте отработанную жидкость на дно пробирки и добавьте 500 μл раствора GD. Центрифугируйте и выбросьте отработанную жидкость, промойте гранулу 2 раза с PW и, наконец, высушите ее, намочив 40 μл чистой воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PW следует добавлять безводный этанол в соответствии с инструкцией.
  3. Амплифицируйте ген-мишень CaMKIIδ методом ПЦР с помощью прямой последовательности праймера gctaaggtgataaatgtggcact и обратной последовательности праймера ctagtgtgcgggccagattc. Приготовьте ПЦР-реакцию, добавив 25 мкл 2x буфера, 1 мкл смеси dNTP, 2 мкл прямого праймера, 2 мкл обратного праймера, 1 мкл ДНК-полимеразы, 2 мкл матричной ДНК и 17 мкл ddH2O. Запустите следующую программу ПЦР: 95 °C в течение 3 мин, 95 °C в течение 15 с, 53,7 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 60 с, 12 °C для сохранения тепла.
  4. После ПЦР приготовьте 1% агарозный гель и проведите электрофорез в агарозном геле при напряжении 110 В в течение 35 мин (шаг 1,5, шаг 1,6). Разрежьте целевую область геля после электрофореза и отправьте на секвенирование по Сэнгеру (Рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плазмиды in vitro вводили мышам путем внутрикостной инъекции (рис. 1A). Средний размер наночастиц составил около 202,9 нм, потенциал — 2,77 мВ, а PDI — 0,22 (рис. 1B). На рисунке 1C показана форма поверхности наночастиц, наблюдаемая как сферическая с помощью электронной микроскопии. На рисунке 1D показана плазмидная карта вектора ABE и плазмидная карта вектора ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В биомедицинских исследованиях задача доставки экзогенных плазмид животным заключается в повышении эффективности доставки и экспрессии генов при одновременной минимизации вреда для животных для достижения желаемого терапевтического эффекта15,16. Мы представляем новый метод внутрикостного введения хитозан-опосредованной доставки плазмиды ABE в клетки костного мозга мышей-реципиентов. Эта стратегия повышает эффективность доставки п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Фондом естественных наук провинции Аньхой (2208085MC74, 2208085MC51) и Научно-исследовательским фондом Департамента образования провинции Аньхой, Китай (KJ2021A0055).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл ПЦР-пробирки, плоская крышкаЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ  ПТ-02-С
1 мл шприцаАньхой Цзяннань Медицинское оборудование Ко., Лтд/
1% пентобарбитала натрия//
Микроцентрифужные пробирки 1,5 млЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬМСТ-001-150
10 раз &; Буфер для загрузки ДНКВазимеП022-01
10X Т4 Буфер ДНК-лигазы 1 млTaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD2011А
1250 μ l Наконечник для пипетки 102,1 ммЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬТ-001-1250
200 μ l Наконечники для пипеток 50,55 ммЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ  Т-001-200
2x Phanta Max BufferaВазимеП505-д1
4 ? центрифугаТермо Фишер75002425
50 мл Центрифужная пробиркаЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬТ-012-50
6-луночные планшеты для культивирования клетокЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ11110
АгарСангон БиотехA505255-0250
АмперАбиовелл/
ХитозанСангон БиотехA600614-0500
Встряхиватель для культур с постоянной температуройШанхайская компания Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdЦВИ-200Д
Автоматизированный счетчик ячеек CountessThermo Fisher ScientificГрафиня II/II FL
Горки и держатель счетной камеры Countess Cell, одноразовыеThermo Fisher ScientificС10228
Буфер CutSmartБиолаборатории Новой АнглииB7204SVIAL
DH5&альфа;Общие биосистемыCS01010
DMEMГИБКОC11995500BT
Микс dNTPВазимеП505-д1
Фермент Esp3INEBiolabsР0734С
Этилендиаминтетрауксусная кислотаVETEC (сигма-олдрич)V900106
Фетальная бычья сывороткаОриСеллФСБАД-01011-500
Проточный цитометрBD FACSКалибур342975
Проточная трубкаBeyotime BiotechnologyСумка FFC005-1bag
Флуоресцентный микроскопЛейка427019
Набор для очистки гелем максиТЯНЬГЕНДП210
Набор для экстракции геномной ДНКТЯНЬГЕНДП304
Ледяная уксусная кислотаКитайская национальная фармацевтическая группа10000218
Маркер ДНК GoldBand DL2,000ЕСЭН10501ЭС60
ЛьдогенераторШанхайчжэнцяоБНС-30Зарезервирована лаборатория
ImunoSep BufferПрецизионная биомедикалс Ко., ЛТД604050
Megafuge 8 Серия малых настольных центрифугThermo Fisher Scientific75004250
МЭМТехнологии Life11140050
NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, США
НаОХСИГАМС5881-500Г
ПБСКсиГенХГ3650
PCMV-SPRY-ABE8E вектор//
Аппарат для амплификации ПЦРТермо ФишерAKC96300441
Пенициллин/Стрептомицин СоларбиоП1400
пептонСангон БиотехA505247-0500
ДНК-полимераза Phanta Max Super-FidelityВазимеП505-д1
Лизат эритроцитовБейотимС3702
Хлорид натрияКитайская национальная фармацевтическая группа10019318
Сульфат натрияАладдинS433911
Т-001-10 10μ l Наконечники для пипеток 31,65 ммЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ  Т-001-10
Т4 ДНК-лигазаTaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD2011А
ТрисБиоФрокс1115КГ001
триптонСангон БиотехA505250-0500
вихревой смесительсигмаZ258423
Водяная баняШанхайихэнДК-80
YeaRed Гель для окрашивания нуклеиновыми кислотамиЕСЭН10203ЭС76
Дрожжевой экстрактББИA610961-0500
Зетазер НаноMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS
&бета;-меркаптоэтанол Сигма444203

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med. 26 (8), e3721(2024).
  3. Chen, J., Wang, K., Wu, J., Tian, H., Chen, X. Polycations for gene delivery: Dilemmas and solutions. Bioconjug Chem. 30 (2), 338-349 (2019).
  4. Tong, H., et al. Progress and prospects of chitosan and its derivatives as non-viral gene vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 9 (6), 495-502 (2009).
  5. Alizadeh, L., Zarebkohan, A., Salehi, R., Ajjoolabady, A., Rahmati-Yamchi, M. Chitosan-based nanotherapeutics for ovarian cancer treatment. J Drug Target. 27 (8), 839-852 (2019).
  6. Dimassi, S., Tabary, N., Chai, F., Blanchemain, N., Martel, B. Sulfonated and sulfated chitosan derivatives for biomedical applications: A review. Carbohydr Polym. 202, 382-396 (2018).
  7. Maity, S., Mukhopadhyay, P., Kundu, P. P., Chakraborti, A. S. Alginate coated chitosan core-shell nanoparticles for efficient oral delivery of naringenin in diabetic animals-an in vitro and in vivo approach. Carbohydr Polym. 170, 124-132 (2017).
  8. Abnoos, M., et al. Chitosan-alginate nano-carrier for transdermal delivery of pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biol Macromol. 118 (Pt A), 1319-1325 (2018).
  9. Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., Hennighausen, L. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol. 3 (1), 19(2020).
  10. Lee, S. N., Jang, H. S., Woo, J. S. Heterologous expression and purification of a CRISPR-cas9-based adenine base editor. Methods Mol Biol. 2606, 123-133 (2023).
  11. Tang, J., Lee, T., Sun, T. Single-nucleotide editing: From principle, optimization to application. Hum Mutat. 40 (12), 2171-2183 (2019).
  12. Newby, G. A., et al. Base editing of hematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 595 (7866), 295-302 (2021).
  13. Lu, D. Z., et al. Camkii(δ) regulates osteoclastogenesis through erk, jnk, and p38 mapks and creb signalling pathway. Mol Cell Endocrinol. 508, 110791(2020).
  14. Sato, K., et al. Regulation of osteoclast differentiation and function by the camk-creb pathway. Nat Med. 12 (12), 1410-1416 (2006).
  15. Li, X., et al. Viral vector-based gene therapy. Int J Mol Sci. 24 (9), 7736(2023).
  16. Gonçalves, G. A. R., Paiva, R. M. A. Gene therapy: Advances, challenges and perspectives. Einstein. 15 (3), 369-375 (2017).
  17. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 11 (4), 321-330 (2011).
  18. Mingozzi, F., et al. Cd8(+) t-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13 (4), 419-422 (2007).
  19. Dong, L., Li, Y., Cong, H., Yu, B., Shen, Y. A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges. Carbohydr Polym. 324, 121562(2024).
  20. Rizeq, B. R., Younes, N. N., Rasool, K., Nasrallah, G. K. Synthesis, bioapplications, and toxicity evaluation of chitosan-based nanoparticles. Int J Mol Sci. 20 (22), 5776(2019).
  21. Mansouri, S., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: Strategies to improve transfection efficacy. Eur J Pharm Biopharm. 57 (1), 1-8 (2004).
  22. Zhou, C., et al. Off-target rna mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 571 (7764), 275-278 (2019).
  23. Betzler, B. K., Chee, Y. J. Bin Abd Razak, H.R. Intraosseous injections are safe and effective in knee osteoarthritis: A systematic review. Arthrosc Sports Med Rehabil. 3 (5), e1557-e1567 (2021).
  24. Lin, Y. W., Aplan, P. D. Leukemic transformation. Cancer Biol Ther. 3 (1), 13-20 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи