В этой статье мы представляем подход к генной терапии, который доставляет хитозан с покрытием ABE непосредственно в костный мозг путем внутрикостной инъекции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Улучшенная доставка и экспрессия генов с помощью внутрикостного введения наночастиц хитозана, инкапсулированных плазмид редактора адениновых оснований
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Доставка экзогенных плазмид экспериментальным животным имеет решающее значение в биомедицинских исследованиях, включая изучение функций генов, выяснение механизмов заболевания и оценку эффективности лекарств. Тем не менее, эффективность трансфекции данного метода относительно низка, и введение плазмид для долгосрочной экспрессии генов может зависеть от иммунной системы. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали и исследовали новый метод, в котором хитозан используется для инкапсуляции плазмид редактора адениновых оснований (ABE), а затем непосредственно доставляется комплекс в костный мозг мышей путем внутрикостной инъекции. В этом исследовании для нацеливания на ген CaMK II δ , который тесно связан с дифференцировкой остеокластов, мы использовали хитозан для инкапсуляции δ плазмид ABE CaMK II . Мы вводили плазмидный груз непосредственно в полость костного мозга путем внутрикостного введения. Результаты показали высокую эффективность редактирования in vivo в 14,27% в локусе А1 и 10,69% в локусе А2 у мышей-реципиентов. Эта новая стратегия не только особенно подходит для заболеваний, вызванных аномальной функцией остеокластов, но и обладает значительным потенциалом для продвижения в области генной терапии.
Введение
Генная терапия стала перспективным подходом в области биомедицинских исследований 1,2. Он предлагает потенциал для лечения различных заболеваний путем введения чужеродных плазмид экспериментальным животным для модуляции экспрессии определенных генов и изучения их терапевтических эффектов. Однако традиционные методы доставки столкнулись с некоторыми проблемами, которые ограничивают их эффективность и безопасность3. Проблемы включают низкую эффективность трансфекции, высокие биологические повреждения и низкую эффективность экспрессии....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по охране здоровья животных Аньхойского университета по использованию и уходу за животными. В этом исследовании ABE был щедро пожертвован профессором Тянь Чи (Шанхайский университет науки и технологии, Шанхай, Китай; Рисунок 1D).
1. Конструкция плазмиды ABE
- Дизайн гРНК с последовательностью TCCATGATGCACAGACAGGA, где PAM представлен GAC.
- Согласно руководству компании по перечню праймеров, добавьте праймер к соответствующему объему ddH2O для достижения концентрации 100....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Плазмиды in vitro вводили мышам путем внутрикостной инъекции (рис. 1A). Средний размер наночастиц составил около 202,9 нм, потенциал — 2,77 мВ, а PDI — 0,22 (рис. 1B). На рисунке 1C показана форма поверхности наночастиц, наблюдаемая как сферическая с помощью электронной микроскопии. На рисунке 1D показана плазмидная карта вектора ABE и плазмидная карта вектора .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В биомедицинских исследованиях задача доставки экзогенных плазмид животным заключается в повышении эффективности доставки и экспрессии генов при одновременной минимизации вреда для животных для достижения желаемого терапевтического эффекта15,16. Мы представляем новый метод внутрикостного введения хитозан-опосредованной доставки плазмиды ABE в клетки костного мозга мышей-реципиентов. Эта стратегия повышает эффективность доставки п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была профинансирована Фондом естественных наук провинции Аньхой (2208085MC74, 2208085MC51) и Научно-исследовательским фондом Департамента образования провинции Аньхой, Китай (KJ2021A0055).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2 мл ПЦР-пробирки, плоская крышка | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | ПТ-02-С | |
| 1 мл шприца | Аньхой Цзяннань Медицинское оборудование Ко., Лтд | / | |
| 1% пентобарбитала натрия | / | / | |
| Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | МСТ-001-150 | |
| 10 раз &; Буфер для загрузки ДНК | Вазиме | П022-01 | |
| 10X Т4 Буфер ДНК-лигазы 1 мл | TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD | 2011А | |
| 1250 μ l Наконечник для пипетки 102,1 мм | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | Т-001-1250 | |
| 200 μ l Наконечники для пипеток 50,55 мм | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | Т-001-200 | |
| 2x Phanta Max Buffera | Вазиме | П505-д1 | |
| 4 ? центрифуга | Термо Фишер | 75002425 | |
| 50 мл Центрифужная пробирка | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | Т-012-50 | |
| 6-луночные планшеты для культивирования клеток | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | 11110 | |
| Агар | Сангон Биотех | A505255-0250 | |
| Ампер | Абиовелл | / | |
| Хитозан | Сангон Биотех | A600614-0500 | |
| Встряхиватель для культур с постоянной температурой | Шанхайская компания Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ЦВИ-200Д | |
| Автоматизированный счетчик ячеек Countess | Thermo Fisher Scientific | Графиня II/II FL | |
| Горки и держатель счетной камеры Countess Cell, одноразовые | Thermo Fisher Scientific | С10228 | |
| Буфер CutSmart | Биолаборатории Новой Англии | B7204SVIAL | |
| DH5&альфа; | Общие биосистемы | CS01010 | |
| DMEM | ГИБКО | C11995500BT | |
| Микс dNTP | Вазиме | П505-д1 | |
| Фермент Esp3I | NEBiolabs | Р0734С | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота | VETEC (сигма-олдрич) | V900106 | |
| Фетальная бычья сыворотка | ОриСелл | ФСБАД-01011-500 | |
| Проточный цитометр | BD FACSКалибур | 342975 | |
| Проточная трубка | Beyotime Biotechnology | Сумка FFC005-1bag | |
| Флуоресцентный микроскоп | Лейка | 427019 | |
| Набор для очистки гелем макси | ТЯНЬГЕН | ДП210 | |
| Набор для экстракции геномной ДНК | ТЯНЬГЕН | ДП304 | |
| Ледяная уксусная кислота | Китайская национальная фармацевтическая группа | 10000218 | |
| Маркер ДНК GoldBand DL2,000 | ЕСЭН | 10501ЭС60 | |
| Льдогенератор | Шанхайчжэнцяо | БНС-30 | Зарезервирована лаборатория |
| ImunoSep Buffer | Прецизионная биомедикалс Ко., ЛТД | 604050 | |
| Megafuge 8 Серия малых настольных центрифуг | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| МЭМ | Технологии Life | 11140050 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, США | ||
| НаОХ | СИГАМ | С5881-500Г | |
| ПБС | КсиГен | ХГ3650 | |
| PCMV-SPRY-ABE8E вектор | / | / | |
| Аппарат для амплификации ПЦР | Термо Фишер | AKC96300441 | |
| Пенициллин/Стрептомицин | Соларбио | П1400 | |
| пептон | Сангон Биотех | A505247-0500 | |
| ДНК-полимераза Phanta Max Super-Fidelity | Вазиме | П505-д1 | |
| Лизат эритроцитов | Бейотим | С3702 | |
| Хлорид натрия | Китайская национальная фармацевтическая группа | 10019318 | |
| Сульфат натрия | Аладдин | S433911 | |
| Т-001-10 10μ l Наконечники для пипеток 31,65 мм | ЛАБОРАТОРИЯ ВЫБРАТЬ | Т-001-10 | |
| Т4 ДНК-лигаза | TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD | 2011А | |
| Трис | БиоФрокс | 1115КГ001 | |
| триптон | Сангон Биотех | A505250-0500 | |
| вихревой смеситель | сигма | Z258423 | |
| Водяная баня | Шанхайихэн | ДК-80 | |
| YeaRed Гель для окрашивания нуклеиновыми кислотами | ЕСЭН | 10203ЭС76 | |
| Дрожжевой экстракт | ББИ | A610961-0500 | |
| Зетазер Нано | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | |
| &бета;-меркаптоэтанол | Сигма | 444203 |
Ссылки
- Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
- Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
